利用末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）和Caspase 3/7检测法测定患壶菌病青蛙表皮细胞死亡

摘要

我们采用两种方法量化患壶菌病青蛙的表皮细胞死亡。首先，使用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法（TUNEL） 原位 组织学分析以确定临床感染动物与未感染动物之间的差异；其次，通过caspase 3/7蛋白分析，对感染过程中细胞凋亡进行时间序列研究。

摘要

两栖动物在全球范围内正经历严重的生物多样性丧失，其中主要原因是传染病壶菌病。该疾病由真菌病原体引起 Batrachochytrium dendrobatidis (Bd），会感染并破坏蛙类表皮；然而，其病理变化尚未被明确表征。细胞凋亡（程序性细胞死亡）既可被病原体利用以损伤宿主组织，也可作为宿主抵抗疾病、清除病原体的防御机制。本研究中，我们采用两种不同的检测方法——末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法（TUNEL）和caspase 3/7检测，对感染与未感染动物的表皮细胞死亡情况进行定量分析。在TUNEL检测中，利用腹部、背部和大腿皮肤组织，我们观察到表皮细胞中存在细胞死亡现象 原位 对临床感染动物和未感染动物进行荧光显微镜观察，比较其细胞死亡情况。为了确定感染过程中表皮细胞凋亡水平的变化，我们在8周内每两周采集一次趾尖组织样本，提取蛋白质后采用caspase 3/7检测试剂盒定量分析样本中的酶活性，并将caspase 3/7活性与感染负荷进行相关性分析。TUNEL检测可用于细胞死亡的定位分析。 原位但每个样本的成本较高且耗时较长。半胱天冬酶3/7（caspase 3/7）检测适用于大样本量和时间序列实验。然而，由于蛙类趾尖活检样本较小，通过 Bradford 法等蛋白定量方法进行样本标准化时可获得的提取物有限。因此，我们建议通过趾部活检照片分析估算皮肤表面积，以避免在样本标准化过程中消耗提取物。

引言

两栖动物目前正经历着所有脊椎动物类群中最严重的全球生物多样性丧失之一¹。导致这一衰退的主要原因是由真菌病原体Batrachochytrium dendrobatidis, Bd引起的致命性皮肤疾病——壶菌病²。该病原体浅表感染表皮，可能导致皮肤功能紊乱，进而引发严重的电解质流失、心脏骤停甚至死亡³。目前，针对Bd的多种潜在宿主免疫机制正在被研究，例如抗菌肽^4,5、皮肤细菌群落⁶、免疫细胞受体^7,8以及淋巴细胞活性^9,10。然而，很少有研究探讨表皮细胞凋亡和细胞死亡是否是抵抗这种致命病原体的一种免疫机制。

细胞死亡，无论是通过凋亡（程序性细胞死亡）还是坏死（非程序性死亡），在表皮中均可能是一种病理表现 Bd 感染。先前的研究表明 Bd 感染可能诱导细胞凋亡，因为当皮肤外植体暴露于游动孢子上清液时，可观察到细胞内连接结构的破坏。 体外¹¹. 此外，表皮的退行性改变在 Bd使用电子显微镜观察感染的青蛙^12,13转录组学分析表明，感染皮肤中凋亡通路被上调¹⁴，当两栖动物的脾细胞暴露于以下条件时会发生凋亡 Bd 上清液 体外¹⁵尽管越来越多的证据表明 Bd 可诱导凋亡和宿主细胞死亡 体外, 体内 通过感染进程探究或量化凋亡机制的研究尚且缺乏。此外，尚不清楚宿主是否将凋亡作为一种防御性免疫策略来对抗 Bd 感染，或细胞凋亡是否为疾病的病理特征。

在本研究中，我们旨在通过两种方法在感染动物体内（in vivo）检测表皮细胞死亡和凋亡：半胱天冬酶3/7（caspase 3/7）蛋白检测法，以及末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）原位检测法。由于每种检测方法可识别细胞死亡的不同方面¹⁶，联合使用这些方法可全面理解细胞死亡的机制，并确保对效应的准确评估。caspase 3/7检测法可定量效应caspase 3和7的活性，从而量化内源性和外源性凋亡通路。相比之下，TUNEL检测法可检测DNA片段化，这种片段化可由包括凋亡、坏死和焦亡在内的多种细胞死亡机制引起¹⁷。我们使用TUNEL检测法，通过三种不同皮肤切片——Pseudophryne corroboree的背部、腹部和大腿部位，研究临床感染与未感染动物表皮内细胞死亡的位置。该方法可确定细胞死亡的解剖位置，并区分其在特定表皮层中的分布。随后，我们采用caspase 3/7检测法对Litoria verreauxii alpina在8周感染期间的凋亡进行时间序列定量分析。我们对同一批动物每两周采集一次脚趾尖样本，从而将病原体感染负荷与caspase 3/7活性进行关联分析。

方案

詹姆斯·库克大学批准了动物伦理申请，P. corroboree 的申请编号为 A1875，L. v. alpina 的申请编号为 A1897 和 A2171。

1. 动物饲养与监测

1. 将动物单独饲养，提供适合该物种的环境，并制定适当的供水、喂食和清洁计划。每天检查动物状况。
   1. 使用来自人工繁育设施捐赠的成年个体，包括极危物种Pseudophryne corroboree（用于TUNEL检测，第4节）和濒危物种Litoria verreauxii alpina（用于Caspase 3/7检测，第5节）。将动物维持在15–18 °C环境中，底材使用苔藓和碎石，每日用反渗透水喷雾保湿，每周喂食三次肠道富集的蟋蟀。
2. 每周对每只个体采集一次数据。按照步骤2.1所述方法对个体进行Bd拭子取样。使用天平称量每只动物的体重，精确至0.1 g，并使用数显卡尺测量其吻肛长（SVL），精确至0.01 mm。
3. 接种后（如第3节所述），应每天检查动物是否出现感染的临床症状（皮肤异常脱落、食欲减退、腿部发红、精神萎靡或翻正反射延迟），并遵守动物伦理指南。若动物出现临床症状和明显病态，应实施安乐死。
   1. 使用过量三卡因甲磺酸盐（MS222）实施安乐死（在陈化自来水中配制0.1% w/v MS222溶液，用碳酸氢钠调节pH至6– 7）。在动物所有活动停止且对外界刺激无反应后，继续将其留在MS222溶液中10分钟。

2. 检测 Bd 感染

1. 对 Bd 进行拭子采样
   1. 使用新的无菌人造丝拭子对每只动物进行采样（每只动物使用一个拭子）。采样方法如下：腹部擦拭5次，每个大腿、体侧和四肢各擦拭5次。总共45次擦拭动作。
   2. 在擦拭过程中及每次擦拭之间轻轻旋转拭子，以确保有效捕获DNA。将拭子头折断放入1.5 mL微量离心管中，并于-20 °C保存直至提取DNA。
2. DNA提取与qPCR检测
   1. 通过向含有30 - 40 mg 0.5 mm二氧化硅珠的50 µL商用DNA提取试剂中加入拭子样本，提取基因组DNA。在珠磨仪细胞破碎仪中以最大速度震荡样品2 min。珠磨步骤完成后，以2,000 x g离心1 min。
   2. 将样品在100 °C孵育10 min，随后冷却。以5,000 x g离心3 min，然后将上清液转移至各自的1.5 mL微量离心管中，并于-20 °C保存直至进行qPCR。
   3. 按照Boyle et al. 2004¹⁸的方法进行定量PCR（qPCR）以分析感染负荷。采用以下修改：
      1. 用双蒸水将DNA提取样本稀释6:100。向每个孔中加入0.7 µL牛血清白蛋白（BSA），以帮助防止PCR抑制。每个样本单次运行。每块板上均设置阴性（无模板）对照和阳性对照，并使用一系列稀释标准品来估算游动孢子（感染）负荷。

3. 接种

1. 培养 Bd
   1. 通过将 16 g 胰蛋白胨、2 g 明胶水解物和 4 g 乳糖（TGHL）加入 1 L 去离子水中制备培养液。在 121 °C 下高压灭菌 40 分钟，然后让培养液冷却。
   2. 将 Bd 分离株（本例中为来自新南威尔士州的分离株 AbercrombieR-L.booroologensis-2009-LB1，传代次数为 11）接种至 TGHL 培养液中，在 23 °C 下培养 7 天，随后将液体培养物转移至 TGHL 琼脂平板上。
   3. 制备平板时，向 1 L 去离子水中加入 16 g 胰蛋白胨、2 g 明胶水解物、4 g 乳糖（TGHL）和 10 g 细菌学琼脂，高压灭菌（121 °C，40 分钟）。待混合物冷却至可触碰但尚未凝固时，在 II 级生物安全柜中将 TGHL 琼脂倒入直径为 92 mm 的培养皿中，填充至 1/4 至 1/3 满。
   4. 待琼脂完全凝固并冷却后，每块平板接种 0.5 mL 来自液体培养液的 Bd，并均匀涂布。让 Bd 培养液混合物在平板上干燥约 1 小时，然后用塑料封口膜密封平板。将平板倒置，在 23 °C 下培养 5–7 天。
2. 制备游动孢子接种液的平板冲洗
   1. 接种前每日在倒置光学显微镜下检查游动孢子的运动性以确保其活性。当游动孢子释放量高，大量游动孢子在孢子囊外游动时，表明培养物已准备好用于接种。
   2. 向每块平板加入 3 mL 陈化自来水或人工池水，将水倒入平板后在室温下孵育 10 分钟，使游动孢子释放到水中。孵育结束后，将游动孢子悬液倾入新的无菌容器中。
   3. 按照血球计数板制造商的说明估算游动孢子浓度。确定游动孢子悬液浓度后，用陈化自来水将其稀释至每 3 mL 含 1 × 10⁶ 个游动孢子的浓度。
3. 动物接种
   1. 将 3 mL 接种液混合物倾倒于各动物腹侧¹⁹，置于独立的 50 mL 容器中进行接种。让多余的接种液积聚在接种容器底部。每只动物在独立的接种容器中放置 24 小时以确保感染成功；24 小时接种结束后，将每只动物转移回已消毒的饲养箱。
      1. 使用体积分数为 13% 的商用漂白剂溶液对饲养箱进行消毒²⁰，用水至少冲洗两次，然后静置干燥不少于 24 小时。
   2. 对于 Bd 阴性对照组，采用与步骤 3.2–3.3 相同的方法进行模拟接种，但使用 5 mL 陈化自来水冲洗未接种 Bd 的琼脂平板，而非接种了 Bd 的琼脂平板。

4. TUNEL 检测

1. 对出现步骤1.3.1中所述壶菌病临床症状的动物实施安乐死，并对同等数量的 Bd阴性对照动物
2. 从每只动物身上采集皮肤样本（背部、腹部和大腿部）。将皮肤样本在4%（v/v）磷酸盐缓冲甲醛中固定2 h。较短且一致的固定时间可确保组织充分固定，同时有利于实现有效且准确的免疫组织化学染色。随后转移至80%乙醇中保存，直至包埋切片。
3. 按照标准方法将皮肤组织包埋于石蜡中以进行组织学制备²¹简要而言，实验步骤如下：
   1. 将组织置于梯度浓度的乙醇中脱水，并用二甲苯清除乙醇。将组织包埋于石蜡中，将每个个体的三个皮肤样本置于同一石蜡块中。
4. 使用切片机按照标准组织学制备方法对皮肤进行切片²¹将组织以5 µm厚度连续切片，然后贴附于亲水性玻璃载玻片上。每张载玻片上放置每种皮肤类型连续的4张组织切片。每个个体制备3张载玻片，每张载玻片均含有每种组织的4张连续切片。
5. 按以下顺序对玻片进行染色：
   1. 用苏木精对第一张玻片进行染色，随后进行伊红复染（H&E）&E）。此幻灯片用于可视化定位 Bd 皮肤内的孢子囊。
   2. 按照市售的TUNEL检测试剂盒对第二张载玻片进行染色，用于组织学制备，并遵循制造商提供的说明，如下所述。
      1. 首先，在 Coplin 染色缸中进行脱蜡：将切片用二甲苯洗涤三次，每次 5 分钟，每次更换新液；随后用 100% 乙醇洗涤两次，每次 5 分钟，每次更换新液。接着用 95% 乙醇洗涤一次，持续 3 分钟，再用 70% 乙醇洗涤一次，持续 3 分钟。最后用 PBS 洗涤一次，持续 5 分钟。
      2. 用新配制的蛋白消化酶（蛋白酶K，以PBS稀释至浓度为20 μg/mL）对组织进行预处理，直接加至载玻片上，孵育15分钟。在Coplin染色缸中用PBS洗涤两次，每次2分钟。
      3. 轻拍去除多余液体，将切片浸入盛有 PBS 配制的 3.0% 过氧化氢的考普林瓶中，室温下淬灭 2 分钟。用 PBS 漂洗两次，每次 5 分钟。
      4. 轻敲去除多余液体，然后每5 cm加入75 µL² 将平衡缓冲液直接加到载玻片上的组织上，孵育10秒。轻轻吸去切片周围多余的液体，然后每5 cm²加入55 µL² 含有具有活性的末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）酶。在37 °C下于湿化密闭容器中孵育1小时。
      5. TdT孵育后，将玻片放入盛有工作浓度终止/洗涤缓冲液的考普林瓶中，振荡15秒，室温孵育10分钟。用PBS洗涤三次，每次1分钟。轻拍去除多余液体。
      6. 将已升温至室温的抗地高辛配基偶联物（罗丹明）加入组织，每5 cm加入65 µL²在湿盒中室温孵育30分钟，避免光照。用PBS洗涤四次，每次2分钟。吸去多余液体。
      7. 最后，在载玻片上加入15 µL浓度为0.5–1 µg/mL的DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）封片介质，用作复染剂。随后加盖盖玻片，并用指甲油或橡胶胶水密封。由于该检测对光敏感，需将载玻片置于避光环境中干燥。
   3. 第三张载玻片采用TUNEL检测法染色，并用DAPI复染，每份样本均需设置阳性和阴性对照。
      注意：对照载玻片上的4个组织切片中，前2个为阳性对照重复样本，后2个为阴性对照重复样本。
      1. 对于阳性对照，无需执行步骤 4.5.2.2，而是使用 DN 缓冲液（30 mM Trizma base，pH 7.2，4 mM MgCl₂）对组织进行预处理₂，0.1 mM DDT），室温孵育5分钟。然后将DNase I溶于DN缓冲液中，终浓度为0.1 μg/mL，直接加至载玻片上，室温孵育15分钟。  然后，用5次去离子水洗涤载玻片₂每次洗涤3分钟，吸去多余液体。然后按照第4.5.2.3节的指示继续进行TUNEL检测。
      2. 对于阴性对照，不要向这些样品中加入末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）（如第4.5.2.4节所述）。
6. 实验完成后立即观察TUNEL切片。
   1. 使用荧光显微镜在200倍放大下，对每块皮肤切片随机间隔拍照，分别采用罗丹明染色滤光片（显示凋亡细胞，呈红色）和DAPI滤光片（显示所有细胞核，呈蓝色），以便生成细胞叠加图像。确保每份样本的每块皮肤切片至少拍摄100个细胞。将载玻片置于暗盒中，于-20 °C保存。
   2. 每张图像中计数细胞（蓝色DAPI染色）。确保每份皮肤切片至少计数100个细胞。若单张图像中细胞数不足100个，则继续计数另一张图像，直至每只动物每份皮肤切片的细胞总数达到至少100个。
   3. 接下来，在相同的图像中计数TUNEL阳性细胞的数量（红色罗丹明染色）。TUNEL阳性细胞指示凋亡，而非坏死或背景信号，表现为具有清晰细胞边界的单个细胞（细胞膜完整，无裂解）。有时细胞会收缩形成凋亡小体。
   4. 定位TUNEL染色中计数的区域，并分析其在H中的对应区域&E 染色的组织切片。确认 H&E 染色切片对应于位点 Bd 感染，以确保 Bd在TUNEL检测中计数凋亡细胞时，使用感染位点。

5. Caspase 3/7 检测

1. 从每只动物（包括暴露于Bd和未感染Bd的个体）中每周采集一次脚趾尖样本，持续至接种后第3周，之后每两周采集一次直至实验结束，每次最多采集8个脚趾尖。
   1. 使用火焰灭菌的剪刀在第二指节处剪下脚趾尖，放入1.5 mL微量离心管中，并立即在-80 °C下冷冻保存。
2. 从冷冻的脚趾样本中提取蛋白质。
   1. 将样本置于含有两颗不锈钢珠（3.2 mm）的1.5 mL螺口微量离心管中，加入100 µL样品缓冲液（25 mM HEPES，pH 7，5 mM MgCl₂）。使用珠磨仪以最大速度进行4次珠磨处理，每次1分钟，每次间隔在冰上放置3分钟。裂解完成后，在4 °C下以12,000 x g离心5分钟。收集上清液用于后续检测。
3. 使用Bradford法测定每个样本的蛋白浓度。
   1. 在384孔板中，将10 µL蛋白提取物与10 µL Bradford试剂混合，在室温下孵育2分钟。每个样本设两个复孔，并同时设置一系列5倍稀释的BSA标准品。使用吸光度酶标仪在595 nm波长下读取吸光值。
4. 若脚趾尖样本过小（根据步骤4.3.1中Bradford测定结果，蛋白浓度接近最低标准值，或所采样的蛙总重量低于3 g），可改用拍照估算皮肤表面积的方法对样本进行标准化处理，而非采用Bradford法。
   1. 在为caspase检测提取蛋白前，使用倒置光学显微镜以40倍放大倍数拍摄每个脚趾尖的照片。
   2. 使用计算机图像分析软件分析脚趾样本，通过估算脚趾面积进行测量：沿脚趾剪切样本边缘绘制轮廓线，由图像软件计算该轮廓内的面积，再将此面积乘以π（3.14），从而估算出三维皮肤样本的表面积（因为管状结构的外表面积等于长度乘以横截面周长，即π×直径）。
5. 进行caspase 3/7活性检测。
   1. 在384孔发光检测板中，每孔加入10 µL commercially available caspase 3/7试剂和10 µL蛋白提取物。每个样本设三个复孔。
   2. 缓慢振荡酶标板15秒以混匀试剂。将板避光孵育30分钟，室温条件下进行。使用发光酶标仪测定发光信号。

结果

TUNEL 检测

感染动物中TUNEL阳性细胞数量多于未感染的对照动物。 原位 感染组与对照组动物中TUNEL阳性细胞的分布位置存在差异。在对照组动物中，TUNEL阳性细胞在真皮层和表皮层中呈均匀分布，且水平较低（见 图1A），但在感染动物中，TUNEL阳性细胞在表皮中更为常见（图1B）。感染部位（通过H观察到）&E染色的载玻片）观察到成团聚集 Bd 孢子囊分散分布于大腿和腹侧皮肤切片中，背部切片中则未见。而TUNEL阳性细胞则更集中于感染细胞所在部位及其紧邻区域。图1C），在表皮以及比该位置更深层的表皮层中，TUNEL阳性细胞的分布也更为广泛 Bd 居住于. 在 Bd ...

讨论

我们探讨了表皮细胞凋亡和细胞死亡作为致命性疾病壶菌病的潜在病理机制或疾病抗性机制的可能性 Bd 易感物种。我们采用两种方法评估表皮细胞死亡，即TUNEL检测法 原位 表皮细胞死亡分析及半胱天冬酶3/7检测用于监测感染过程中表皮细胞死亡情况。我们发现，细胞死亡和凋亡与感染负荷相关，且在感染部位细胞死亡显著升高。在感染早期，表皮中凋亡水平下降，但随着感染组织内病原体负荷增加，凋亡水平随之上升。

细胞凋亡可通过多种不同方法进行检测，每种方法均有其优势与局限性。为了验证研究结果，采用多种检测手段来研究细胞凋亡和细胞死亡至关重要。在本研究中，我们采用了两种不同的检测方法来探究患壶菌病青蛙表皮细胞的死亡与凋亡情况。首先，我们尝试使用TUNEL检测法评估细胞死亡 原位该检测方法耗时较长，每份样品的成本较高，且载玻片必须立即读取，因为荧光信号会迅速衰减。尽管存在这些局限性，该方法的结果仍具有较高的可靠性。 原位 实验对于进一步理解宿主-病原体相互作用的机制至关重要。通过该方法可确定定位信息，在本研究中，真菌感染部位出现高水平的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
POLARstar Omega	BMG Labtech		化学发光酶标仪
384孔平底透明板	Corning	3707
384孔低边白色平底板	Corning	3570
细菌用琼脂（Oxoid）	Fisher	OXLP0011B
10%中性缓冲福尔马林（Formal-Fixx）	Fisher	6764254
乳糖肉汤（Oxoid）	Fisher	OXCM0137B
碳酸氢钠	Fisher	BP328-500
Tricane-S（MS-222）	Fisher	NC0872873
胰蛋白胨	Fisher	BP1421-500
牛血清白蛋白	Invitrogen	15561020
无菌人造丝拭子	Medical Wire & Equipment	MW-113
ApopTag 红色原位细胞凋亡检测试剂盒	Merck Millipore	S7165
Coomassie Bradford 试剂	Pierce	23200
Caspase Glo  3/7	Promega	G8090
HEPES缓冲液	Sigma Aldrich	H0887-20ML
氯化镁	Sigma Aldrich	1374248-1G
酶解明胶水解物	Sigma-Aldrich	G0262
PBS（磷酸盐缓冲液），pH 7.2（1X）	Thermo/Life	20-012-043
Prepman	Thermo/Life	4318930
TaqMan Fast Advanced Master Mix	ThermoFisher	4444556
Parafilm封口膜	Bemis	PM996
Clorox漂白剂	Clorox
乙醇，200度，分子生物学级	Fisher	BP2818500
ZEISS Axio Scan 荧光显微镜	Carl Zeiss		荧光显微镜
3.2 mm不锈钢珠	BioSpec	11079132SS
引物 ITSI-3 Chytr（5′-CCTTGAT ATAATACAGTGTGCCATATGTC-3′）	Taqman		引物和探针的个性化设计
引物 5.8S Chytr（5′-TCGGTT CTCTAGGCAACAGTTT-3′）	Taqman		引物和探针的个性化设计
小沟结合探针 Chytr MGB2（5′-CGAGTCGAAC-3′）	Taqman		引物和探针的个性化设计
Rotor-Gene qPCR 仪器	Qiagen		qPCR仪
1.5 ml 微量离心管	Fisher	02-681-372
细胞培养培养皿	Nunc	263991
Mini-beadBeater 锆硅酸盐珠，0.5 mm	BioSpec	11079105Z