我们采用两种方法量化患壶菌病青蛙的表皮细胞死亡。首先，使用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法（TUNEL） 原位 组织学分析以确定临床感染动物与未感染动物之间的差异；其次，通过caspase 3/7蛋白分析，对感染过程中细胞凋亡进行时间序列研究。
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摘要
摘要
两栖动物在全球范围内正经历严重的生物多样性丧失，其中主要原因是传染病壶菌病。该疾病由真菌病原体引起 Batrachochytrium dendrobatidis (Bd），会感染并破坏蛙类表皮；然而，其病理变化尚未被明确表征。细胞凋亡（程序性细胞死亡）既可被病原体利用以损伤宿主组织，也可作为宿主抵抗疾病、清除病原体的防御机制。本研究中，我们采用两种不同的检测方法——末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法（TUNEL）和caspase 3/7检测，对感染与未感染动物的表皮细胞死亡情况进行定量分析。在TUNEL检测中，利用腹部、背部和大腿皮肤组织，我们观察到表皮细胞中存在细胞死亡现象 原位 对临床感染动物和未感染动物进行荧光显微镜观察，比较其细胞死亡情况。为了确定感染过程中表皮细胞凋亡水平的变化，我们在8周内每两周采集一次趾尖组织样本，提取蛋白质后采用caspase 3/7检测试剂盒定量分析样本中的酶活性，并将caspase 3/7活性与感染负荷进行相关性分析。TUNEL检测可用于细胞死亡的定位分析。 原位但每个样本的成本较高且耗时较长。半胱天冬酶3/7（caspase 3/7）检测适用于大样本量和时间序列实验。然而，由于蛙类趾尖活检样本较小，通过 Bradford 法等蛋白定量方法进行样本标准化时可获得的提取物有限。因此，我们建议通过趾部活检照片分析估算皮肤表面积，以避免在样本标准化过程中消耗提取物。
引言
两栖动物目前正经历着所有脊椎动物类群中最严重的全球生物多样性丧失之一1。导致这一衰退的主要原因是由真菌病原体Batrachochytrium dendrobatidis, Bd引起的致命性皮肤疾病——壶菌病2。该病原体浅表感染表皮，可能导致皮肤功能紊乱，进而引发严重的电解质流失、心脏骤停甚至死亡3。目前，针对Bd的多种潜在宿主免疫机制正在被研究，例如抗菌肽4,5、皮肤细菌群落6、免疫细胞受体7,8以及淋巴细胞活性9,10。然而，很少有研究探讨表皮细胞凋亡和细胞死亡是否是抵抗这种致命病原体的一种免疫机制。
细胞死亡，无论是通过凋亡（程序性细胞死亡）还是坏死（非程序性死亡），在表皮中均可能是一种病理表现 Bd 感染。先前的研究表明 Bd 感染可能诱导细胞凋亡，因为当皮肤外植....
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方案
詹姆斯·库克大学批准了动物伦理申请，P. corroboree 的申请编号为 A1875，L. v. alpina 的申请编号为 A1897 和 A2171。
1. 动物饲养与监测
- 将动物单独饲养，提供适合该物种的环境，并制定适当的供水、喂食和清洁计划。每天检查动物状况。
- 使用来自人工繁育设施捐赠的成年个体，包括极危物种Pseudophryne corroboree（用于TUNEL检测，第4节）和濒危物种Litoria verreauxii alpina（用于Caspase 3/7检测，第5节）。将动物维持在15–18 °C环境中，底材使用苔藓和碎石，每日用反渗透水喷雾保湿，每周喂食三次肠道富集的蟋蟀。
- 每周对每只个体采集一次数据。按照步骤2.1所述方法对个体进行Bd拭子取样。使用天平称量每只动物的体重，精确至0.1 g，并使用数显卡尺测量其吻肛长（SVL），精确至0.01 mm。
- 接种后（如第3节所述），应每天检查动物是否出现感染的临床症状（皮肤异常脱落、食欲减退、腿部发红、精神萎靡或翻正反射延迟），并遵守动物伦理指南。若动物出现临床症状和明显病态，应实施安乐死。
- 使用过量三卡因甲磺酸盐（MS222）实施安乐死（在陈化自来水中配制0.1% w/v ....
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结果
TUNEL 检测
感染动物中TUNEL阳性细胞数量多于未感染的对照动物。 原位 感染组与对照组动物中TUNEL阳性细胞的分布位置存在差异。在对照组动物中，TUNEL阳性细胞在真皮层和表皮层中呈均匀分布，且水平较低（见 图1A），但在感染动物中，TUNEL阳性细胞在表皮中更为常见（图1B）。感染部位（如H&E染色的载玻片）上观察到成团的 Bd 孢子囊分散分布于大腿和腹侧皮肤切片中，背部皮肤切片中未见。而TUNEL阳性细胞则更集中于感染细胞所在部位及其紧邻区域。图1C），在表皮以及比该位置更深的表皮层中也出现了更广泛的TUNEL阳性细胞 Bd 居住于. 在 Bd 感.......
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讨论
我们探讨了表皮细胞凋亡和细胞死亡作为致命性疾病壶菌病的潜在病理机制或疾病抗性机制的可能性 Bd 易感物种。我们采用两种方法评估表皮细胞死亡，即TUNEL检测法 原位 表皮细胞死亡分析及半胱天冬酶3/7检测用于监测感染过程中表皮细胞死亡情况。我们发现，细胞死亡和凋亡与感染负荷相关，且在感染部位细胞死亡显著升高。在感染早期，表皮中凋亡水平下降，但随着感染组织内病原体负荷增加，凋亡水平随之上升。
细胞凋亡可通过多种不同方法进行检测，每种方法均有其优势与局限性。为了验证研究结果，采用多种检测手段来研究细胞凋亡和细胞死亡至关重要。在本研究中，我们采用了两种不同的检测方法来探究患壶菌病青蛙表皮细胞的死亡与凋亡情况。首先，我们尝试使用TUNEL检测法评估细胞死亡 原位该检测方法耗时较长，每份样品的成本较高，且载玻片必须立即读取，因为荧光信号会迅速衰减。尽管存在这些局限性，该方法的结果仍具有较高的可靠性。 原位 实验对于进一步理解宿主-病原体相互作用的机制至关重要。通过该方法可确定定位信息，在本研究中，真菌感染部位出现高水平的.......
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
感谢以下人员在饲养和数据收集方面提供的帮助：D. Tegtmeier、C. De Jong、J. Hawkes、K. Fossen、S. Percival、M. McWilliams、L. Bertola、M. Stewart、N. Harney 和 T. Knavel；以及 M. Merces 在解剖方面的协助。我们还要感谢 M. McFadden、P. Harlow 和塔龙加动物园（Taronga Zoo）对高山蛙（L. v. alpina）的繁育工作，以及 G. Marantelli 对喧蛙（P. corroboree）的繁育支持。感谢 F. Pasmans 和 A. Martel 在细胞凋亡检测方面的建议，感谢 C. Constantine、A. Kladnik 和 R. Webb 在TUNEL检测中的协助，以及 T. Emeto 和 W. Weßels 在caspase 3/7 检测方案和试剂盒方面的帮助。本稿件和实验方案改编自 Brannelly et al 2017 年发表于 Peer J22。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| POLARstar Omega | BMG Labtech | 化学发光酶标仪 | |
| 384孔平底透明板 | Corning | 3707 | |
| 384孔低边白色平底板 | Corning | 3570 | |
| 细菌用琼脂（Oxoid） | Fisher | OXLP0011B | |
| 10%中性缓冲福尔马林（Formal-Fixx） | Fisher | 6764254 | |
| 乳糖肉汤（Oxoid） | Fisher | OXCM0137B | |
| 碳酸氢钠 | Fisher | BP328-500 | |
| Tricane-S（MS-222） | Fisher | NC0872873 | |
| 胰蛋白胨 | Fisher | BP1421-500 | |
| 牛血清白蛋白 | Invitrogen | 15561020 | |
| 无菌人造丝拭子 | Medical Wire & Equipment | MW-113 | |
| ApopTag 红色原位细胞凋亡检测试剂盒 | Merck Millipore | S7165 | |
| Coomassie Bradford 试剂 | Pierce | 23200 | |
| Caspase Glo 3/7 | Promega | G8090 | |
| HEPES缓冲液 | Sigma Aldrich | H0887-20ML | |
| 氯化镁 | Sigma Aldrich | 1374248-1G | |
| 酶解明胶水解物 | Sigma-Aldrich | G0262 | |
| PBS（磷酸盐缓冲液），pH 7.2（1X） | Thermo/Life | 20-012-043 | |
| Prepman | Thermo/Life | 4318930 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444556 | |
| Parafilm封口膜 | Bemis | PM996 | |
| Clorox漂白剂 | Clorox | ||
| 乙醇，200度，分子生物学级 | Fisher | BP2818500 | |
| ZEISS Axio Scan 荧光显微镜 | Carl Zeiss | 荧光显微镜 | |
| 3.2 mm不锈钢珠 | BioSpec | 11079132SS | |
| 引物 ITSI-3 Chytr（5′-CCTTGAT ATAATACAGTGTGCCATATGTC-3′） | Taqman | 引物和探针的个性化设计 | |
| 引物 5.8S Chytr（5′-TCGGTT CTCTAGGCAACAGTTT-3′） | Taqman | 引物和探针的个性化设计 | |
| 小沟结合探针 Chytr MGB2（5′-CGAGTCGAAC-3′） | Taqman | 引物和探针的个性化设计 | |
| Rotor-Gene qPCR 仪器 | Qiagen | qPCR仪 | |
| 1.5 ml 微量离心管 | Fisher | 02-681-372 | |
| 细胞培养培养皿 | Nunc | 263991 | |
| Mini-beadBeater 锆硅酸盐珠，0.5 mm | BioSpec | 11079105Z |
参考文献
- Stuart, S. N., et al. Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide. Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).
- Skerratt, L. F., et al. Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs. EcoHealth. 4, 125-134 (2007).
- Voyles, J., et al.
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重印与许可
