来自人脑组织的分离脑毛细血管可作为临床前模型，用于研究生理和病理生理条件下血脑屏障的功能。本文中，我们介绍了一种从新鲜人脑组织中分离脑毛细血管的优化方案。
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本文内容
摘要
摘要
在生理和病理生理条件下理解血脑屏障功能，对于开发新的治疗策略至关重要，这些策略有望增强药物向脑部的递送、改善脑保护并治疗脑部疾病。然而，研究人类血脑屏障功能具有挑战性，因此迫切需要合适的模型。在这方面，从人脑组织中分离出的脑微血管是一种独特的工具，可尽可能接近人类体内（in vivo）的真实情况来研究屏障功能。本文中，我们描述了一种优化的方案，能够以高得率、稳定的质量和纯度从人脑组织中分离微血管。该方法利用机械匀浆、密度梯度离心和过滤技术，从新鲜的人脑组织中分离微血管。分离后的人脑微血管可用于多种应用，包括通透性检测、活细胞成像以及基于免疫的检测，以研究蛋白质表达与功能、酶活性或细胞内信号传导。分离的人脑微血管是一种独特的模型，可用于阐明人类血脑屏障功能的调控机制。该模型有助于揭示中枢神经系统（CNS）疾病的发病机制，从而推动针对CNS疾病治疗策略的发展。
引言
血脑屏障是血液与大脑之间的一个高度受控的界面，决定着进入和离开大脑的物质。从解剖学角度看，血脑屏障由内皮细胞构成，形成复杂的连续毛细血管网络。从生理学角度看，该毛细血管网络在向大脑输送氧气和营养物质的同时，清除二氧化碳和代谢废物。重要的是，已有证据表明，血脑屏障的改变与多种病理状态相关，包括阿尔茨海默病、癫痫和脑卒中1,2,3,4,5,6,7脑内皮细胞还通过阻止药物进入大脑而成为治疗的屏障， 例如多形性胶质母细胞瘤肿瘤切除术后化疗8,9,10. 在这方面，分离的人类脑毛细血管代表了一种独特的 离体 紧密模拟血脑屏障特性的模型 体内 这使得研究人员能够在健康和疾病状态下研究屏障功能及其障碍。本文提供了一种从人脑组织中分离脑毛细血管的实验....
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方案
以下信息基于美国肯塔基州列克星敦市肯塔基大学当前的安全和监管标准。出于安全考虑，在处理人体组织前，请参阅所在机构的生物安全计划以及最新的法规和建议。
警告：人体组织可能含有经血液传播的病原体，包括人类免疫缺陷病毒（HIV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）及其他病原体。操作人体组织存在感染血源性病原体的风险。因此，在处理人体组织时，必须遵守特定的法规和安全规范，以保护实验室工作人员。在美国，操作人体组织需在生物安全二级（BSL-2）实验室中进行，并依照美国国立卫生研究院（NIH）第四部分IV-B-7条款、1970年职业安全与健康法案（OSHA Act of 1970）第5(a)(1)条款以及使用者所在机构的生物安全计划，采取相应的安全防护措施并接受培训。通常情况下，在开展涉及人体样本（组织、体液等）的研究之前，必须获得机构生物安全委员会（Institutional Biosafety Committee）和/或机构审查委员会（Institutional Review Board）的批准。所有操作人体样本的人员均须接受培训，培训内容包括基础实验室安全培训， 例如，化学卫生与实验室安全，以及有关生物安全、危险废物和人类血液传播病原体的专项培训。所有操作人类来源材料的人员均强烈建议在接触人类材料前接种乙型肝炎疫苗。操作人类来源材料时，工作人员必须佩戴特定的个人防护装备。 例如佩戴袖套、实验服和面罩，并始终戴手套。所有操作均在二级生物....
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结果
从人脑组织中分离得到的悬液富含人脑毛细血管（图1B），其中含有少量较大的血管、红细胞、其他单个细胞以及部分细胞碎片。部分毛细血管呈分支状，某些毛细血管腔内可见被截留的红细胞。典型的毛细血管直径为3–7 µm，长度约为100–200 µm，管腔开放；大多数毛细血管末端呈塌陷状态。通过共聚焦显微镜观察，分离的人脑毛细血管显示出完整、管状的结构和形态。图2A展示了一条具有附着周细胞且管腔内含红细胞的人脑毛细血管的代表性透射光图像。关于直径、大小和形态的所有观察结果均与既往关于分离脑毛细血管结构的报道一致12,17,18。图2B中的人脑毛细血管使用C219作为一抗（1 µg/mL）对P-糖蛋白（P-gp，绿色）进行免疫.......
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讨论
本方案描述了从新鲜组织中分离完整且具有活性的人脑毛细血管的方法。在本节中，我们将详细讨论以下内容：1）方案的修改，2）常见错误的排查，3）该技术的局限性，4）相对于现有及其他血脑屏障模型，该模型的意义，以及5）分离的人脑毛细血管的潜在应用。
本文所述方案已针对 10 g 新鲜人脑额叶皮质组织进行了优化。然而，该方案可相对简便地进行如下修改：1）适用于多于或少于 10 g 的组织，2）适用于冷冻脑组织，或 3）适用于额叶皮质以外其他脑区的组织。首先，当使用多于或少于 10 g 的脑组织时，缓冲液体积可根据实际组织量按比例相应增加或减少。例如，若仅有 5 g 脑组织可用，则缓冲液体积应减半。其次，本文描述的毛细血管分离方法使用新鲜脑组织，但若无法获得新鲜组织，也可使用冷冻组织38。第三，本研究采用来自额叶皮质的新鲜脑组织，但若其他皮质脑区有足够组织，也可从中分离毛细血管。此外，亦可从非皮质脑区（e.g., 白质）分离毛细血管，但这些区域的细胞组成和毛细血管密度不同66
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢并致谢肯塔基大学阿尔茨海默病中心脑组织库的 Peter Nelson 博士和 Sonya Anderson，感谢他们提供所有人脑组织样本（美国国立卫生研究院资助编号：P30 AG028383，来自国家老龄化研究所）。我们感谢肯塔基大学信息技术服务部学术技术与教师参与中心的 Matt Hazzard 和 Tom Dolan 在图形处理方面的协助。本项目得到了国家神经疾病与卒中研究所资助编号 1R01NS079507（授予 B.B.）以及国家老龄化研究所资助编号 1R01AG039621（授予 A.M.S.H.）的支持。本内容仅由作者负责，不代表国家神经疾病与卒中研究所或国家老龄化研究所的官方观点。作者声明不存在竞争性财务利益。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>个人防护装备（PPE） | |||
| Diamond Grip Plus 乳胶手套，Microflex 中号 | VWR，美国宾夕法尼亚州拉德诺 | 32916-636 | 个人防护装备 |
| 一次性防护实验服 | VWR，美国宾夕法尼亚州拉德诺 | 470146-214 | 个人防护装备；由于人源材料的特性，建议使用一次性实验服 |
| 一次性面罩 | 赛默飞世尔科技公司，美国宾夕法尼亚州匹兹堡 | 19460102 | 个人防护装备；由于人源材料的特性，建议使用一次性面罩 |
| 安全材料 | |||
| Clavies 高温高压灭菌袋 8 x 12 | Thermo Fisher Scientific，美国宾夕法尼亚州匹兹堡 | 01-815-6 | |
| Versi Dry Bench Paper 18" × 20" | Thermo Fisher Scientific，美国宾夕法尼亚州匹兹堡 | 14-206-32 | 覆盖工作区域 |
| VWR 锐器容器系统 | 赛默飞世尔科技公司，美国宾夕法尼亚州匹兹堡 | 75800-272 | 用于使用过的手术刀 |
| 8.2% 漂白剂 Clorox 消毒剂 64 盎司 | 美国肯塔基州列克星敦英国供应中心 | 323775 | |
| <强>仪器设备 | |||
| 4 °C 冰箱 | Thermo Fisher Scientific，美国宾夕法尼亚州匹兹堡 | 13-986-148 | |
| Accume BASIC AB15 pH计 | 赛默飞世尔科技公司，美国宾夕法尼亚州匹兹堡 | AB15 | |
| Heidolph RZR 2102 Control | Heidolph，伊利诺伊州埃尔克格罗夫村，美国 | 501-21024-01-3 | |
| Sorvall LEGEND XTR 离心机 | Thermo Fisher Scientific，匹兹堡，宾夕法尼亚州，美国 | 75004521 | |
| Leica L2 体视显微镜 | 徕卡显微系统公司，美国伊利诺伊州巴芬格罗夫 | 用于去除脑膜 | |
| POLYTRON PT2500 匀浆器 | Kinematica AG，瑞士卢塞恩 | 9158168 | |
| Scale P-403 | Denver Instrument，美国纽约州博伊米亚 | 0191392 | |
| 标准微型搅拌子 | Thermo Fisher Scientific，美国宾夕法尼亚州匹兹堡 | 1151050 | |
| Thermo-Flasks 液氮杜瓦瓶 | Thermo Scientific，曼斯菲尔德，德克萨斯州，美国 | 11-670-4C | 用于冷冻组织？ |
| Voyager Pro 分析天平 | OHAUS，帕西帕尼，新泽西州，美国 | VP214CN | |
| 蔡司 Axiovert 显微镜 | Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, 美国 | 用于检测分离的毛细血管 | |
| <强>工具与玻璃器皿 | |||
| Finnpipette II 移液器 1-5 mL | Thermo Fisher Scientific，美国宾夕法尼亚州匹兹堡 | 21377823T1 | 将毛细管从滤膜上冲洗下来 |
| Finnpipette II 移液器 100-1,000 µL | Thermo Fisher Scientific，美国宾夕法尼亚州匹兹堡 | 21377821T1 | 用 BSA 重悬沉淀 |
| Pipet Boy | Integra，美国新罕布什尔州哈德逊 | 739658 | |
| 50 mL Falcon 管，每架 25 个，每箱 500 个 | VWR，美国宾夕法尼亚州拉德诺 | 21008-951 | |
| EISCO 手术刀片 | Thermo Fisher Scientific，美国宾夕法尼亚州匹兹堡 | S95938C | 研磨脑组织 |
| PARAFILM | VWR，美国宾夕法尼亚州拉德诺 | 52858-000 | 覆盖烧杯和容量瓶 |
| 赛默飞世尔科技 Finntip 移液器吸头 5 mL | 赛默飞世尔科技公司，美国宾夕法尼亚州匹兹堡 | 21-377-304 | 冲洗毛细管以去除滤膜上的残留物 |
| 60 mL 带鲁尔锁的注射器 | 赛默飞世尔科技公司，美国宾夕法尼亚州匹兹堡 | BD309653 | 与连接环一起使用，用于过滤毛细管 |
| 手术刀柄 #4 | Fine Science Tools，美国加利福尼亚州福斯特市 | 10060-13 | 用于切碎 |
| Dumont 镊子 #5 | Fine Science Tools，美国加利福尼亚州福斯特城 | 11251-10 | 用于去除脑膜 |
| 波特-埃尔维耶姆组织研磨器 | Thomas Scientific，美国新泽西州斯韦兹伯勒 | 3431E25 | 50 mL 体积，清除率：150–230 μm |
| 邓氏匀浆器 | VWR，美国宾夕法尼亚州拉德诺 | 62400-642 | 15 mL 体积，通透范围：80–130 μm |
| Spectra/Mesh 编织滤网（300 µm) | Spectrum Laboratories，美国加利福尼亚州兰乔多明格斯 | 146424 | 用于过滤毛细管悬浮液，以去除可能残留的脑膜组织 |
| pluriStrainers（孔径：30 µm) | pluriSelect生命科学公司，德国莱比锡 | 43-50030-03 | |
| 连接环 | pluriSelect生命科学公司，德国莱比锡 | 41-50000-03 | 可重复使用多次 |
| 1 L 容量瓶 | 用于分离缓冲液的配制 | ||
| 1 L 烧杯 | 用于制备1% BSA | ||
| 搅拌子 | 用于制备1% BSA和Ficoll® | ||
| 肖特瓶（60 mL） | 用于制备Ficoll® | ||
| 冰桶 | 保持所有物品低温 | ||
| 100 mm 培养皿 | 用于脑组织的切碎 | ||
| 组织培养细胞刮刀 | VWR，美国宾夕法尼亚州拉德诺 | 89260-222 | 离心后去除上清液 |
| <强>化学品 | |||
| BSA Fraction V，A-9647 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | A9647-500g | 用含钙的DPBS配制2+ && Mg2+ 前一天准备。制备过程中避免产生气泡。4℃保存。使用前缓慢搅拌10分钟。 |
| 含钙的DPBS2+ && Mg2+ | Hyclone | SH30264.FS | DPBS - 分离缓冲液的一部分 |
| Ficoll PM400 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | F4375 | 精确测量在此步骤中非常重要。将样品称量至含有搅拌子的瓶子中。加入DPBS后剧烈振荡。4℃冰箱过夜，次日早晨溶液将变得澄清。使用前轻轻搅拌10–15分钟。使用前始终置于冰上保存。 |
| 葡萄糖（D-(+)葡萄糖） | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | G7528 | 葡萄糖（D-(+)葡萄糖）浓度：5 mM |
| 氢氧化钠标准溶液 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | 71474 | 调节DPBS的pH值 |
| 丙酮酸钠 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | P2256 | 浓度：1 mM |
参考文献
- Aronica, E., et al. Expression and cellular distribution of multidrug resistance-related proteins in the hippocampus of patients with mesial temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 45 (5), 441-451 (2004).
- Hartz, A. M., et al.
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