高效共表达多种嵌合荧光融合蛋白的植物方法

摘要

我们开发了一种在植物中共同表达多种嵌合型荧光融合蛋白的新方法，以克服传统方法的困难。该方法利用含有多个功能上相互独立的蛋白表达盒的单个表达质粒，实现蛋白的共表达。

摘要

了解蛋白质在细胞内的时空亚细胞定位对其生理功能的研究至关重要。荧光蛋白及其融合蛋白的构建已被广泛用作直接观察细胞内蛋白质定位与动态变化的有效工具。在共表达目标蛋白后，将其与已知的细胞器标记蛋白进行比较尤为有用。然而，植物中传统的蛋白共表达方法通常需要多个独立的表达质粒，因而存在共表达效率低、表达水平差异大以及遗传杂交和筛选过程耗时较长等缺点。本研究中，我们描述了一种在植物中同时表达多个嵌合荧光蛋白的高效且新颖的方法。该方法通过使用包含多个半独立表达盒的单一表达载体，克服了传统方法的局限性。每个蛋白表达盒均含有独立的功能性蛋白表达元件，因此可根据不同的表达需求灵活调整。此外，利用优化的一步法反应即可完成表达质粒中DNA片段的组装与操作，无需额外的酶切与连接步骤，简便快捷。同时，该系统完全兼容当前基于荧光蛋白的生物成像技术与应用，如FRET和BiFC。为验证该方法的有效性，我们利用这一新系统共表达了荧光标记的液泡分选受体与分泌载体膜蛋白。结果表明，无论是通过瞬时表达还是遗传转化，这些蛋白的亚细胞定位均与以往研究结果一致。

引言

嵌合型荧光融合蛋白被认为是研究细胞内动态过程和亚细胞定位的有用工具，有助于进一步理解其生理功能和作用机制^1,2,3,4。共表达已知的细胞器标记蛋白与目标蛋白，对于更清晰地阐明目标蛋白在细胞内膜系统中的时空分布规律、定位特征及功能尤为有益^4,5,6,7,8。

一种嵌合型荧光融合蛋白可在植物中表达 通过 瞬时表达与稳定遗传转化，二者各有其优势与局限性^9,10,11瞬时表达蛋白是一种便捷的方法，包括通过基因枪轰击、聚乙二醇（PEG）介导或电穿孔介导的原生质体DNA瞬时表达 农杆菌介导的完整植物细胞叶片浸润，如图所示 图1A，B^{12,13,14,15,16}然而，在单个植物细胞中共同表达多种嵌合荧光融合蛋白需要使用多种独立表达质粒的混合物。因此，采用多个质粒在植物中进行蛋白共表达存在以下缺点：与单个质粒相比，多个质粒同时进入同一细胞的概率显著降低，导致共表达水平下降；此外，由于转入细胞的各类质粒数量具有不可控的随机性，会引起蛋白表达水平的差异。^17,18此外，在技术上很难将多个独立的表达质粒导入单个细胞中 农杆菌 用于蛋白共表达^9,10,11因此， 农杆菌介导的蛋白质瞬时表达通过浸润烟草叶片实现，每次仅能表达一个质粒，如图所示 图1B相比之下，表达荧光融合蛋白的转基因植物通常通过以下方式获得 农杆菌 携带一个双元转化载体。然而，介导基因转移并插入植物基因组的双元载体仅能表达一种荧光融合蛋白（图1B)^9,10,12同时表达多种嵌合荧光蛋白的转基因植物的创制需要多轮遗传杂交与筛选，所需时间从数月到数年不等，具体取决于共表达基因的数量。

已有多个先前的研究报道了在植物中利用单个表达载体共表达多种蛋白质的方法^19,20,21。然而，通常需要多轮的DNA分子与骨架载体的酶切消化和DNA连接反应，才能构建出用于蛋白质共表达或过表达的最终质粒。本文中，我们开发了一种新型且稳健的方法，用于在植物中共表达多种嵌合荧光蛋白。该方法高效便捷，可实现植物中多种蛋白质的共表达，适用于瞬时表达和稳定转化，且操作方式经典可靠。该方法采用一个包含多个功能上相互独立的蛋白表达盒的单载体进行蛋白共表达，从而克服了传统方法的诸多缺点。此外，该系统具有高度通用性，其DNA操作与组装通过一步优化反应即可完成，无需额外的DNA消化和连接步骤。其工作原理如图2所示。更重要的是，该系统完全兼容当前基于嵌合荧光融合蛋白的细胞、分子及生物化学研究方法。

方案

1. 引物设计策略与DNA扩增

1. 设计用于DNA片段分子克隆的引物。引物包含20 bp的基因特异性结合序列以及20至25 bp的5'端突出序列，后者为相邻DNA分子的互补重叠序列（示例见表1）。
   注意：各DNA片段的后续组装、不同蛋白表达盒之间的连接以及与最终表达载体的整合均依赖于相邻重叠序列的识别。
2. 通过标准PCR反应，使用相应的引物和高保真聚合酶扩增构建半独立蛋白表达盒所需的DNA片段，包括启动子、荧光报告基因、目的基因和终止子。
   注意：本研究中用于DNA扩增的模板来源于先前的研究^15,22,23。PCR反应的退火温度和延伸时间取决于引物和基因序列。

2. DNA 片段组装与蛋白表达盒的构建

1. 通过DNA电泳检测第一轮PCR产物的质量，并使用分光光度计进行定量。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测是否存在DNA降解和污染。PCR产物的OD260/OD280比值应在1.6至1.8之间。
2. 将不同的DNA片段（每个片段0.05–0.1 pmol）混合至新的PCR管中，终体积为5 µL。
   注意：将为同一蛋白表达盒设计的DNA分子混合至同一个PCR管中。避免将不同表达盒的DNA混合在一起，因为这会增加需要连接的DNA分子数量，从而降低DNA组装效率。
   注意：此处可暂停实验流程。
3. 配制5倍浓缩液 ISO 储存缓冲液：500 mM Tris-HCl，pH 7.5；50 mM MgCl₂；1 mM 脱氧核苷三磷酸（dNTP）；50 mM 二硫苏糖醇；25% 聚乙二醇（PEG）8000；以及 5 mM 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）。
4. 从400 µL 5x溶液配制1 mL 2x母液混合物 ISO 储存缓冲液，7.5 单位 T5 核酸外切酶，62.5 单位高保真 DNA 聚合酶，5,000 单位 Taq 聚合酶（参见 材料表），以及灭菌的双蒸水 H₂O.
   注意：本方法改编自以往的研究^24,25,26；这些体积应进行优化。
5. 每管分装 100 µL 2x 母液，于 -20 °C 保存。
   注意：2x 溶液反复冻融 主混合物可能导致DNA组装效率降低。
6. 向5 µL DNA混合物中加入15 µL 2x主混合液，于50 °C孵育60分钟。

3. 在植物中共同表达多个嵌合荧光融合蛋白的载体构建

1. 通过第二轮PCR，以第一轮等温组装反应的产物（0.5 - 1.0 µL）为模板，使用最外侧引物扩增整个半独立的蛋白表达盒例如， 1-FP35S 和 1-RNOS 用于表达盒 1。
   1. 在50 µL反应体系中使用1单位高保真聚合酶，进行30个循环（94 °C变性30秒，55 °C退火30秒，68 °C延伸2分钟），最后在68 °C延伸5分钟。
2. 将用于蛋白质瞬时表达和遗传转化的最终蛋白表达骨架载体pUC18和pCAMBIA1300线性化，方法是加入4单位 Sma 将反应体系调整至终体积10 µL，于25 °C孵育1–2小时。随后在65 °C孵育20分钟以灭活限制性内切酶。
3. 将等摩尔量的蛋白表达盒DNA分子与线性化终末载体混合，总体积为5 µL。随后加入15 µL 2x主缓冲液，于50 °C孵育60分钟，进行第二轮DNA重组。
4. 使用第二轮等温重组反应的终产物转化感受态细胞 E. coli 细胞（例如， DH5α）按照标准操作步骤进行²⁷通过菌落PCR和DNA测序对阳性克隆进行双重验证。从阳性克隆中提取质粒。 E. coli 使用小型质粒提取试剂盒提取质粒，并于 -80 °C 保存。
   注意：对于长期储存，溶解于TE缓冲液或双蒸水中的质粒应妥善保存₂O 比将它们保存在 E. coli 菌株

4. 利用基因枪轰击介导的瞬时共表达在植物中表达多种嵌合荧光融合蛋白

1. 准备烟草BY-2悬浮细胞 拟南芥 用于轰击的幼苗
   1. 在25 °C、130 rpm振荡条件下，每周继代培养两次，将BY-2细胞培养于Murashige和Skoog（MS）培养基中。用一张70 mm的灭菌滤纸过滤收集30 mL培养3天的BY-2细胞 通过 将真空压力设置为40 mbar，连接真空泵。
   2. 为防止细胞在后续步骤中干燥，在将滤纸放入培养皿前，先向培养皿中加入数滴BY-2细胞液体培养基。
   3. 将带有BY-2细胞的滤纸转移至新的培养皿（85 mm × 15 mm）中。
   4. 表面灭菌 拟南芥 用含有0.05% Tween 20的70%（v/v）乙醇溶液与（Col-0）种子混合，涡旋振荡处理10分钟。
   5. 使用台式离心机以最大速度离心种子2 s，弃去上清液，再用100%乙醇洗涤种子一次，持续30 s。在无菌操作台中，用移液器将种子转移至新的无菌滤纸上。随后将种子晾干，并铺展于½ MS琼脂平板上。
   6. 将培养板在 4 °C 下保存 48 小时，然后转移至植物生长培养箱中，培养条件设置为：16 小时光照 / 8 小时黑暗，光照强度 120 - 150 µmol m⁻² s⁻¹^-2 s^-1 强度，22 °C^.
   7. 将7天大的样本植株转移至新制的½ MS培养基平板中央直径为30 mm的区域，以提高轰击效率。
      注意：转移并放置植株到新的½ MS培养基平板时，应避免植株相互重叠。
   8. 在植物或组织表面加入数滴½ MS液体培养基，以保持湿度，防止后续步骤中植物干燥。
2. 用质粒DNA包被金颗粒。
   1. 涡旋震荡金微载体溶液，持续3分钟。准备一个新的1.5 mL离心管。
   2. 依次将以下溶液加入离心管中，并涡旋混匀：25 µL（1.5 mg）金颗粒，涡旋10 s；10 µL 25.46 mg/L 亚精胺，涡旋10 s；5 µL 1 µg/µL 质粒DNA，涡旋3 min；25 µL 277.5 mg/L CaCl₂₂ 溶液，涡旋振荡1分钟。
      注意：此步骤中需持续涡旋振荡。
   3. 使用台式离心机以最大速度离心5秒，使金微载体沉淀，然后小心吸走上清液，避免扰动沉淀。用200 µL无水乙醇洗涤沉淀，并通过涡旋振荡5–10秒重新悬浮。再次以最大速度离心5秒，移除乙醇。
   4. 将金颗粒重悬于18 µL无水乙醇中，并将6 µL颗粒悬液分装至三个宏载体的中央。静置使其自然干燥。
3. 通过粒子轰击将DNA转入植物中。
   1. 设置粒子递送系统参数如下：1100 psi、28 mm Hg 真空度、1 cm 间隙距离和 9 cm 粒子飞行距离。
   2. 在琼脂培养基平板上，于三个不同位置对细胞/植株进行三次轰击，轰击后立即将细胞/植株置于黑暗条件下培养。
      注意：操作粒子递送系统时需佩戴安全护目镜，因为该系统涉及高压气体和高速粒子。
4. 将轰击后的细胞/植株置于植物培养室中，在观察荧光信号前于黑暗条件下培养6至72小时。设置植物培养室条件为24小时黑暗、22 °C。
   注意：表达效率和荧光信号强度取决于启动子、基因以及植物/组织类型。

5. 通过共表达多种嵌合荧光蛋白生成稳定转基因拟南芥 农杆菌介导的转化

1. 将根癌农杆菌（Agrobacterium）感受态细胞（PMP90）置于冰上解冻，静置30分钟，然后向感受态细胞中加入2 µL双元载体（100 - 200 ng）（如上制备）。将混合物置于冰上孵育10分钟。
2. 将混合物转移至预冷的0.1 cm电穿孔比色皿中。将比色皿插入电穿孔系统，并按以下参数进行电穿孔：1.6 kV、600 ohms、25 µF。
3. 电穿孔后立即向比色皿中加入1 mL SOC液体培养基，用移液器将细胞转移至新的1.5 mL离心管中，并在28 °C、200 rpm的水平摇床上孵育120分钟。
4. 在室温下以2,348 × g离心5分钟，弃去大部分上清液，用移液器枪头轻轻重悬沉淀的细胞，将其涂布于含有50 mg/L潮霉素B的LB平板上，于28 °C培养2 - 3天。
5. 采用花浸法²⁸将含有双元载体pCAMBIA1300（整合了多个蛋白表达盒）的根癌农杆菌（Agrobacterium）转化拟南芥（Arabidopsis thaliana）Col-0植株，以获得稳定遗传的转基因植株。
6. 通过将转基因拟南芥种子与含0.05% Tween 20的70%（v/v）乙醇混合进行表面灭菌。涡旋振荡10分钟。使用台式离心机以最大转速离心2秒，沉淀种子，弃去上清液，并用100%乙醇洗涤一次，持续30秒。
7. 在无菌操作台中将种子移至无菌滤纸上。随后，使其在空气中干燥，并转移至含潮霉素B的½ MS琼脂平板上，用于筛选阳性后代。
8. 将平板在4 °C下孵育2天，然后转移至植物培养室中继续培养7天。
9. 通过荧光显微镜检测荧光信号，筛选7天龄的存活幼苗，随后将阳性植株转移至土壤中，进一步筛选纯合植株。

6. 药物治疗

1. 进行药物处理时，将每种药物在液体MS培养基中稀释至其适当的工作浓度，再与细胞或植株共同孵育。
   1. 渥曼青霉素处理：将渥曼青霉素粉末溶于DMSO中，配制1 mM的储存液，并将储存液于-20 °C保存。将植物细胞或幼嫩植株转移至含有16.5 µM渥曼青霉素的液体MS培养基中，成像前孵育30 - 45分钟。
   2. 布雷菲德菌素A（BFA）处理：将BFA粉末溶于DMSO中，配制1 mM的储存液，并将储存液于-20 °C保存。将植物细胞或幼嫩植株转移至含有10 µg/mL BFA的液体MS培养基中，成像前孵育30 - 45分钟。

7. 共聚焦显微镜成像与蛋白质亚细胞共定位分析

1. 将幼嫩植株或悬浮细胞转移至常规载玻片上，轻轻加盖盖玻片，用于标准共聚焦激光扫描显微镜成像。使用以下设置：63X 水镜（数值孔径 1.4），背景值为 0，增益为 700，像素大小为 0.168 mm，检测器为光电倍增管。GFP 标记蛋白在 485 nm 处激发，于 525 nm 处检测荧光信号；RFP 标记蛋白在 514 nm 处激发，于 575 nm 处检测荧光信号。
2. 使用 Image J 软件（https://imagej.nih.gov/ij/）及此前所述的 Pearson-Spearman 相关性（PSC）共定位插件计算荧光信号的共定位比率⁸。结果中显示 Pearson 相关系数或 Spearman 等级相关系数（图 4）。所得 r 值范围为 -1 至 1。0 表示两种信号之间无明显相关性，+1 和 -1 分别表示两种信号完全正相关和完全负相关。

结果

我们开发了一种在植物中协同表达多种嵌合荧光融合蛋白的稳健且高效的方法。该方法突破了传统方法需使用多个独立质粒进行蛋白共表达的局限，如图所示 图1A，B， 通过 瞬时表达或稳定遗传转化。在这一新方法中，我们构建一个包含多个蛋白质表达盒的单一表达载体，以实现多种蛋白质的同时共表达图1C，D）。蛋白表达盒具有半独立功能，包含自身蛋白表达所需的DNA元件，因此可根据不同的蛋白表达需求，对每个蛋白表达盒进行独立定制。在最终的蛋白共表达载体中，这些蛋白表达盒作为基本的“乐高”元件，可方便地进行修饰、重构和替换。此外，该系统还提供一种替代性策略，可简便实现DNA分子的组装、多个蛋白表达盒的连接，以及DNA片段与最终目的载体的整合，从而实现嵌合型荧光融合蛋白的共表达 通过 一种优化的等温扩增方法 体外 无需额外的DNA消化和连接步骤即可完成重组反应。...

讨论

本文展示了一种在植物中稳定共表达嵌合型荧光融合蛋白的新方法。该方法适用于瞬时表达和遗传转化，并且与当前基于荧光蛋白的生物成像、分子及生化应用和技术兼容^9,10,13。此外，该方法克服了传统方法使用多个独立表达质粒进行蛋白共表达时所面临的困难。相比之下，本方法采用单一表达载体，其中包含多个蛋白表达盒，每个表达盒均具有独立的启动子、荧光标签、目标蛋白和终止子。而且，各个蛋白表达盒可独立调控，以满足不同的表达需求，例如使用特定启动子，或实现荧光蛋白与目标蛋白的N端或C端嵌合融合。因此，蛋白表达盒在质粒中发挥着类似于基本"Lego"元件的作用，可半独立地工作。此外，该系统还具有高度的灵活性，通过一步式等温重组反应即可轻松实现基因编辑、替换和组装，无需额外的酶切和连接步骤。我们通过测试不同浓度的T5核酸外切酶、Phusion DNA聚合酶和Taq聚合酶，优化了等温重组反应的效率，具体如步骤2.4所述。此外，建议用于一步式等温重组反应的每种DNA片...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
KOD-FX 聚合酶	TOYOBO	KFX-101
Sma I	NEB	R0141L/S/V
Tris-HCl	BBI	A600194-0500
MgCl2	BBI	A601336-0500
dNTP	NEB	#N0447V
DTT	BBI	C4H10O2S2
PEG 8000	BBI	A100159-0500
NAD	BBI	A600641-0001
T5 核酸外切酶	Epicentre	T5E4111K
Phusion 高保真 DNA 聚合酶	NEB	M0530S
Taq DNA 聚合酶	NEB	B9022S
Murashige 和 Skoog 基本盐混合物（MS）	Sigma	M5524
乙醇	BBI	A500737-0500
Tween 20	BBI	A600560-0500
琼脂	BBI	A505255-0250
亚精胺	BBI	A614270-0001
金微载体颗粒	Bio-Rad	165-2263	1.0 µm
CaCl2	BBI	CD0050-500
宏载体	Bio-Rad	165-2335
破裂盘	Bio-Rad	165-2329
阻挡网	Bio-Rad	165-2336
胰蛋白胨	OXOID	LP0042
酵母提取物	OXOID	LP0021
NaCl	BBI	A610476-0001
KCl	BBI	A610440-0500
葡萄糖	BBI	A600219-0001
潮霉素 B	Genview	AH169-1G
渥曼青霉素	Sigma	F9128
布雷菲德菌素 A	Sigma	SML0975-5MG
二甲基亚砜（DMSO）	BBI	A600163-0500
T100 梯度PCR仪	Bio-Rad	1861096
培养箱	松下	MLR-352H-PC
PSD-1000/He 基因枪系统	Bio-Rad	165-2257
基因脉冲仪	Bio-Rad	1652660
电穿孔杯	Bio-Rad	1652083
台式离心机	Eppendorf	5427000097
共聚焦显微镜	蔡司		LSM 7 DUO (780&7Live)
NanoDrop 2000/2000c 分光光度计	赛默飞世尔科技	ND-2000
EPS-300 电泳电源	天能	EPS 300
荧光显微镜	麦克奥迪	MF30
琼脂糖	BBI	A600234
氨苄青霉素	BBI	A100339
乙二胺四乙酸	BBI	B300599