高效共表达多种嵌合荧光融合蛋白的植物方法

摘要

我们开发了一种在植物中共同表达多种嵌合型荧光融合蛋白的新方法，以克服传统方法的困难。该方法利用含有多个功能上相互独立的蛋白表达盒的单个表达质粒，实现蛋白的共表达。

摘要

了解蛋白质在细胞内的时空亚细胞定位对其生理功能的研究至关重要。荧光蛋白及其融合蛋白的构建已被广泛用作直接观察细胞内蛋白质定位与动态变化的有效工具。在共表达目标蛋白后，将其与已知的细胞器标记蛋白进行比较尤为有用。然而，植物中传统的蛋白共表达方法通常需要多个独立的表达质粒，因而存在共表达效率低、表达水平差异大以及遗传杂交和筛选过程耗时较长等缺点。本研究中，我们描述了一种在植物中同时表达多个嵌合荧光蛋白的高效且新颖的方法。该方法通过使用包含多个半独立表达盒的单一表达载体，克服了传统方法的局限性。每个蛋白表达盒均含有独立的功能性蛋白表达元件，因此可根据不同的表达需求灵活调整。此外，利用优化的一步法反应即可完成表达质粒中DNA片段的组装与操作，无需额外的酶切与连接步骤，简便快捷。同时，该系统完全兼容当前基于荧光蛋白的生物成像技术与应用，如FRET和BiFC。为验证该方法的有效性，我们利用这一新系统共表达了荧光标记的液泡分选受体与分泌载体膜蛋白。结果表明，无论是通过瞬时表达还是遗传转化，这些蛋白的亚细胞定位均与以往研究结果一致。

引言

嵌合型荧光融合蛋白被认为是研究细胞内动态过程和亚细胞定位的有用工具，有助于进一步理解其生理功能和作用机制^1,2,3,4。共表达已知的细胞器标记蛋白与目标蛋白，对于更清晰地阐明目标蛋白在细胞内膜系统中的时空分布规律、定位特征及功能尤为有益^4,5,6,7,8。

一种嵌合型荧光融合蛋白可在植物中表达 通过 瞬时表达与稳定遗传转化，二者各有其优势与局限性^9,10,11瞬时表达蛋白是一种便捷的方法，包括通过基因枪轰击、聚乙二醇（PEG）介导或电穿孔介导的原生质体DNA瞬时表达 农杆菌介导的完....

方案

1. 引物设计策略与DNA扩增

1. 设计用于DNA片段分子克隆的引物。引物包含20 bp的基因特异性结合序列以及20至25 bp的5'端突出序列，后者为相邻DNA分子的互补重叠序列（示例见表1）。
   注意：各DNA片段的后续组装、不同蛋白表达盒之间的连接以及与最终表达载体的整合均依赖于相邻重叠序列的识别。
2. 通过标准PCR反应，使用相应的引物和高保真聚合酶扩增构建半独立蛋白表达盒所需的DNA片段，包括启动子、荧光报告基因、目的基因和终止子。
   注意：本研究中用于DNA扩增的模板来源于先前的研究^15,22,23。PCR反应的退火温度和延伸时间取决于引物和基因序列。

2. DNA 片段组装与蛋白表达盒的构建

1. 通过DNA电泳检测第一轮PCR产物的质量，并使用分光光度计进行定量。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测是否存在DNA降解和污染。PCR产物的OD260/OD280比值应在1.6至1.8之间。
2. 将不同的DNA片段（每个片段0.05–0.1 pmol）混合至新的PCR管中，终体积为5 µL。
   注意：将为同一蛋白表达盒设计的DNA分子混合至....

结果

我们开发了一种在植物中协同表达多种嵌合荧光融合蛋白的稳健且高效的方法。该方法突破了传统方法需使用多个独立质粒进行蛋白共表达的局限，如图所示 图1A，B， 通过 瞬时表达或稳定遗传转化。在这一新方法中，我们构建一个包含多个蛋白表达盒的单一表达载体，以实现多种蛋白的同时共表达。图1C，D）。蛋白表达盒可凭借其自身用于蛋白表达所必需的DNA元件实现半独立功能。因此，每个蛋白表达盒均可根据不同的蛋白表达需求进行独立定制。对于最终的蛋白共表达载体而言，其中的蛋白表达盒发挥着基础作用 "乐高" 可便捷地进行修饰、重建和替换的元件。此外，该方法还可简便地实现DNA分子的组装、多个蛋白表达盒的连接，以及DNA片段与最终目的载体的整合，从而共表达嵌合型荧光融合蛋白。 通过 一种优化的等温扩增方法 体外 无需额外的DNA消化和连接步骤即可.......

讨论

本文展示了一种在植物中稳定共表达嵌合型荧光融合蛋白的新方法。该方法适用于瞬时表达和遗传转化，并且与当前基于荧光蛋白的生物成像、分子及生化应用和技术兼容^9,10,13。此外，该方法克服了传统方法使用多个独立表达质粒进行蛋白共表达时所面临的困难。相比之下，本方法采用单一表达载体，其中包含多个蛋白表达盒，每个表达盒均具有独立的启动子、荧光标签、目标蛋白和终止子。而且，各个蛋白表达盒可独立调控，以满足不同的表达需求，例如使用特定启动子，或实现荧光蛋白与目标蛋白的N端或C端嵌合融合。因此，蛋白表达盒在质粒中发挥着类似于基本"Lego"元件的作用，可半独立地工作。此外，该系统还具有高度的灵活性，通过一步式等温重组反应即可轻松实现基因编辑、替换和组装，无需额外的酶切和连接步骤。我们通过测试不同浓度的T5核酸外切酶、Phusion DNA聚合酶和Taq聚合酶，优化了等温重组反应的效率，具体如步骤2.4所述。此外，建议用于一步式等温重组反应的每种DNA片.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
KOD-FX 聚合酶	TOYOBO	KFX-101
Sma I	NEB	R0141L/S/V
Tris-HCl	BBI	A600194-0500
MgCl2	BBI	A601336-0500
dNTP	NEB	#N0447V
DTT	BBI	C4H10O2S2
PEG 8000	BBI	A100159-0500
NAD	BBI	A600641-0001
T5 核酸外切酶	Epicentre	T5E4111K
Phusion 高保真 DNA 聚合酶	NEB	M0530S
Taq DNA 聚合酶	NEB	B9022S
Murashige 和 Skoog 基本盐混合物（MS）	Sigma	M5524
乙醇	BBI	A500737-0500
Tween 20	BBI	A600560-0500
琼脂	BBI	A505255-0250
亚精胺	BBI	A614270-0001
金微载体颗粒	Bio-Rad	165-2263	1.0 µm
CaCl2	BBI	CD0050-500
宏载体	Bio-Rad	165-2335
破裂盘	Bio-Rad	165-2329
阻挡网	Bio-Rad	165-2336
胰蛋白胨	OXOID	LP0042
酵母提取物	OXOID	LP0021
NaCl	BBI	A610476-0001
KCl	BBI	A610440-0500
葡萄糖	BBI	A600219-0001
潮霉素 B	Genview	AH169-1G
渥曼青霉素	Sigma	F9128
布雷菲德菌素 A	Sigma	SML0975-5MG
二甲基亚砜（DMSO）	BBI	A600163-0500
T100 梯度PCR仪	Bio-Rad	1861096
培养箱	松下	MLR-352H-PC
PSD-1000/He 基因枪系统	Bio-Rad	165-2257
基因脉冲仪	Bio-Rad	1652660
电穿孔杯	Bio-Rad	1652083
台式离心机	Eppendorf	5427000097
共聚焦显微镜	蔡司		LSM 7 DUO (780&7Live)
NanoDrop 2000/2000c 分光光度计	赛默飞世尔科技	ND-2000
EPS-300 电泳电源	天能	EPS 300
荧光显微镜	麦克奥迪	MF30
琼脂糖	BBI	A600234
氨苄青霉素	BBI	A100339
乙二胺四乙酸	BBI	B300599