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方法文章

大型动物模型中肝脏组织上血浆凝固性的评估 体内

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DOI：

10.3791/57355

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2018年8月4日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Bonn, 2Institute for Laboratory Animal Science & Experimental Surgery, RWTH Aachen University, 3Department of Anesthesiology, RWTH Aachen University

本文内容

摘要

本文介绍一种用于实验性评估肝组织中血浆凝固的方案 体内在猪模型中，采用激光多普勒法检测微循环，通过组织学方法测量凝固深度，使用红外测温仪和热成像相机测定凝固部位温度，并通过爆破压力实验记录导管封合效果。

摘要

等离子凝固作为一种电灼术，数十年来在肝脏手术中用于封闭大范围肝切除术后较大的肝切面，以预防后期出血。然而，等离子凝固对肝组织的确切作用尚缺乏充分研究。在我们的猪模型中，可接近临床应用条件来观察凝固效应。采用联合激光多普勒血流仪与分光光度计，可在8 mm组织深度无创地记录凝固过程中微循环的变化，从而提供关于止血效果的量化信息，超越主观临床判断。在凝固前后使用红外测温仪测定凝固部位温度，并在凝固过程中使用热成像相机进行监测；由于设备上限限制，无法测量气体束流的温度。凝固深度通过组织切片经苏木精/伊红染色后，在显微镜下利用物镜测微尺校准后进行测量，从而精确反映功率设置与凝固深度之间的关系。由于等离子凝固设备无法封闭较大的血管，因此密封效果主要在胆管上进行评估。通过离体器官进行爆破压力实验，以排除血压相关因素的影响。

引言

氩离子凝固术（APC）是一种在腹部外科手术中已广泛应用三十多年的器械1,2它是通过封闭肝脏切面以防止术后出血，从而在大范围肝切除术后实现继发性止血的标准技术。3等离子凝固是一种特殊形式的射频电凝，通过电离气体形成的电弧传递电能。作为一种非接触式技术，它可提供单极电热止血，其优势在于可防止电极与组织粘连。4电离气体束会自动导向电阻最低的区域，当因干燥导致电阻升高时，气束便会转向其他尚未干燥的区域。这可产生均匀且有限的凝固深度。5,6影响凝血效果的因素包括激活时间、凝血设备的功率设置以及探头与组织之间的距离。氦气是另一种可用于等离子凝血的载气。7近期的临床研究主要关注临床结果，而非组织学和功能学发现3,8,9，而实验研究则侧重于 体外 研究10 或离体灌注器官实验11.

本方案可在接近临床应用的大型动物模型中，使用标准的人用设备在猪身上研究血浆凝固的效果：微循环通过激光多普勒血流仪和分光光度计进行无创评估，这两种仪器是该适应证的常规临床工具12,13。凝固过程中的温度变化通过红外测温仪和热成像相机进行监测。凝固深度通过采集组织样本后，对苏木精-伊红染色的组织切片进行组织学分析来测定。为与其他止血方法进行比较，还进行了爆破压力实验。与先前描述的技术14不同，这些实验在离体器官上进行，以排除血压相关的影响。除了上述对血浆凝固局部效应的研究外，还可在此猪模型中进行常规血液检测。

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方案

动物实验遵循德国相关法律法规以及《实验动物护理原则》（美国国立卫生研究院出版物第8版，2011年）。已获得德国北莱茵-威斯特法伦州自然保护、环境与消费者保护局（Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Germany）的官方许可。

1. 动物

  1. 使用饲养在开放式笼具中的雌性德国陆地品种猪（体重 25–30 kg）。
  2. 每组使用 5 只动物（氩气组和氦气组）。
  3. 实验前至少让动物适应环境一周。术前禁食 24 小时，但可自由饮水。

2. 麻醉

  1. 在诱导麻醉前10分钟，通过肌肉注射给予动物氯胺酮（15 mg/kg体重[BW]）、赛拉嗪（10 mg/kg BW）和阿托品（0.1 mg/kg BW）进行预处理。
  2. 通过将22号套管插入耳缘静脉建立外周静脉通路。
  3. 通过静脉注射2 mg/kg体重的丙泊酚诱导全身麻醉。
  4. 将动物置于仰卧位，在颈静脉沟处做一条长约2 cm的纵向皮肤切口。通过钝性分离皮下组织暴露静脉，插入套管，随后插入Seldinger导丝。
  5. 撤出套管，沿导丝置入14 Fr导管，随后撤出导丝。将导管连接至延长管，并用绑带或缝线固定导管。
  6. 拉出舌头并插入直型喉镜，用喉镜前端下压会厌，经声门插入气管导管。将气囊置于声门下方并充气。
  7. 以40%氧气、呼吸频率20–26次/分钟、潮气量10 ml/kg进行通气，维持呼气末二氧化碳分压在36–42 mm Hg之间。
  8. 以1–1.5%浓度的异氟烷和3–4 µg/kg/h浓度的芬太尼维持麻醉。
  9. 初始以4 mL/kg/h的速度输注乳酸林格液，开腹术后增至8 mL/kg/h的恒定输注速率。

3. 手术与血浆凝固

  1. 将动物仰卧位放置在标准手术台上。
  2. 使用手术棉签涂抹标准外科消毒剂（2-丙醇 45 g/100 g，1-丙醇 10 g/100 g，联苯-2-醇 0.2 g/100 g）对皮肤进行消毒，共进行3次。
  3. 使用手术刀从剑突至耻骨行广泛的腹正中切口，并安装手术拉钩。
  4. 打开等离子凝固装置，根据所用的载气打开氩气或氦气瓶。调节气体流量至 3 L/min。根据需要选择凝固装置的输出功率。
    注意：两种惰性气体氩气或氦气均可用于等离子凝固，凝固效果相似。详见参考文献7。
  5. 按照先前描述的方法7对左肝叶进行等离子凝固。使用钛制模具（方形开孔 1 × 1 cm2）标准化凝固区域。探头距离保持 1 cm，凝固时间为 5 秒。不同功率设置下的凝固可并排进行，相邻凝固区域之间间距为 5 mm（图 1）。
  6. 为获取肝脏，切断所有肝周韧带连接。游离并切断肝门结构，位置位于十二指肠上曲上方，保留较长的门静脉和胆总管。在肝脏上方和下方切断下腔静脉，取出肝脏器官。
  7. 肝脏获取后，通过静脉注射戊巴比妥（0.16 g/kg 体重）对猪实施安乐死。
  8. 进行爆破压力实验时，使用锐利剪刀切除左内叶肝脏约一半组织。对切面进行等离子凝固（输出功率 100 W）或使用纤维蛋白胶封闭切面（图 2）。

4. 微循环测量

注意：激光多普勒光谱法可通过测量红细胞运动引起的多普勒频移来确定组织中的血流。激光信号与运动红细胞的数量相关。激光多普勒光谱法已在临床中应用（例如移植医学），并经过多次验证15。

  1. 打开激光多普勒血流仪和分光光度计。使用平面探头。
  2. 记录血流和流速的基线值。保存或记录数值。
  3. 按照3.5节所述进行凝固操作。
  4. 将平面探头置于凝固部位，测量血流和流速。再次保存或记录数值。
  5. 对凝固装置的所有功率设置重复上述步骤。

5. 温度测量

  1. 开启系统（热成像相机、笔记本电脑和红外测温仪），并在进行测量前至少预热1小时。
  2. 调整热成像相机对准凝固部位的焦距和视野范围。可使用1024 × 768像素的空间分辨率检测红外序列，温度分辨率高于20 mK。注意，凝固区域及其受热传导影响的周围组织应位于视野中央。
    注意：为获得最佳空间分辨率，应尽可能使该区域占据更多像素。
  3. 使用热成像相机记录等离子凝固器在肝脏表面进行凝固过程的影像，持续2分钟。
  4. 使用热成像分析软件分析图像序列：定义感兴趣区域。
    注意：软件将计算相应平均温度随时间的变化过程。

6. 凝固深度测量

  1. 用锋利的剪刀切除左侧中叶肝脏。
  2. 切除厚度为 1 cm 的凝固区域，并切成 3 mm 厚的纵向组织段用于后续处理。
  3. 用中性 10% 缓冲福尔马林在 4 °C 下固定组织样本过夜。将石蜡加热至高于熔点 2 °C，包埋组织切片，并过夜处理。
  4. 进行苏木精-伊红（H&E）染色。
    1. 依次将组织浸入二甲苯（2 次）、100% 乙醇（EtOH）、95% EtOH、70% EtOH 和去离子 H2O 中，每次 2 分钟，以脱蜡并水化组织。
    2. 用 Mayer 苏木精溶液对组织样本染色 3 分钟。
    3. 随后用自来水冲洗 5 分钟。
    4. 用伊红溶液对组织染色 3 分钟。
    5. 再依次用 95% EtOH（2 次）和二甲苯各冲洗 3 分钟，最后用常规封片介质封片。
  5. 开启系统（显微镜连接的相机及成像软件），以 40X 放大倍数观察所有切片。
  6. 以 40X 放大倍数拍摄物镜测微尺的图像。在“物镜”窗口中点击“重新校准”按钮，选择手动校准。在测微尺图像上绘制一条代表 100 µm 的线段，在弹出的对话框中输入 0.1 mm，然后点击“确定”。
  7. 在“视图>分析控制>注释与测量”窗口中选择“长度”工具，用鼠标测量从肝脏表面至凝固边缘的距离，导出或记录结果。在同一张切片的另一位置重复测量。
    注意：凝固深度可通过正常肝细胞索与坏死区之间的清晰边界进行区分，坏死区表现为胞质皱缩、核固缩及出血区域。
  8. 取两次测量结果的平均值。

7. 爆破压力测量

  1. 启动系统（自动泵、压力计）。根据步骤 3.7 准备肝组织样本。
    注意：使用两个通过三通阀连接的并联泵。单个泵无法达到 1,500 mm Hg 的最高压力。
  2. 用剪刀在肝蒂部位分离门静脉、肝总动脉和胆管。使用无损伤钳夹闭门静脉，并用 4-0 单丝缝线结扎；同样使用无损伤钳夹闭肝总动脉，并用 4-0 单丝缝线结扎。
  3. 将 Ch-16 导管插入胆总管，并用 2-0 丝线结扎。将导管连接至自动泵，安装带压力计的三通阀（图 3）。
  4. 用生理盐水填充灌注注射器。
  5. 以 99 mL/h 的流速启动自动泵。
  6. 观察肝脏切面和压力计是否有渗漏，并记录破裂压力。
    注意：为便于识别渗漏，可在生理盐水中加入专利蓝（2 mL 专利蓝 + 18 mL 生理盐水）。通过观察压力计上压力消失的时间点，可更易判断破裂压力。

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结果

微循环：通过微循环变化可展示该止血诊断设备在血浆凝固后的应用效果。毛细血管血流（以任意单位（AU）表示）从基线值 142.7 ± 76.08 AU 下降至设备输出功率为 25 W 时的 57.78 ± 49.57 AU，进一步降至 50 W 时的 48.5 ± 7.26 AU，并在 100 W 时降至 5.04 ± 1.31 AU（图 4）。

温度：凝固部位的温度使用热成像相机进行测量（图5）。仅使用红外测温仪记录到微小的温度变化。红外测温仪显示基础温度为 32.42 ± 2.27 °C。使用 25 W 功率凝固后，温度为 33.33 ± 1.81 °C。使用 50 W 激光进行凝固时，温度为 31.17 ± 2.13 °C。在使用最大功率 100 W 进行凝固后，温...

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讨论

肝脏手术的啮齿类动物模型已建立很长时间16。然而，大型动物模型具有某些优势：可直接使用人类的标准手术器械，无需显微外科设备；手术技术与临床应用相似；标准的临床评估方法也可直接应用于实验。例如，可直接开展常规的临床血液检测，无需特殊的实验室检测方法（图10）。

猪是心肺研究的合适实验动物，因为其生理特征与人类非常相似17。由于在体型、肝段结构和组织学方面与人类相似，猪也是实验性肝外科研究的标准实验动物之一18。选择猪模型评估血浆凝血功能，是因为该模型具有多种优势（与人类生理相似，且可评估标准临床设备）7。与外科技术不同，麻醉管理难以直接类推应用。尤其是气道管理可能较为困难17。猪从门齿到声门的距离较长，且其解剖结构与人类不同，使得经验不足的研究人员进行经口插管操作较为困难。此外，面罩通气在...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
赛拉嗪 20 mg/mLVetoquinol GmbHXylapan
氯胺酮 100 mg/mLCeva GmbHCeva Ketamine Injection
阿托品 100 mg / 10 mLDr. Franz Köhler Chemie GmbHAtropinsulfat Köhler 100mg Amp.
丙泊酚Fresenius Kabi GmbHPropofol 1% MCT Fresenius
芬太尼KG Rotexmedica GmbHFentanyl 0,5mg Rotexmedica
异氟烷Abbot GmbHForene 100% (V/V) 250 mL
乳酸林格氏液Baxter Deutschland GmbH钠 131 mmol/L，钾 5 mmol/L，钙 2 mmol/L，氯 111 mmol/L，乳酸 29 mmol/L
外科消毒剂Schülke & Mayr GmbHKodan Tinktur forte gefärbt 1l 104804
电动显微镜Nikon Instruments EuropeEclipse TE2000-E
显微镜相机Nikon Instruments EuropeDigitalsight DS-Qi1Mc
成像软件Nikon Instruments EuropeNIS elements Vers. 4.40
等离子凝固器Söring GmbHCPC-1000
氩气Linde AGArgon 4.8 
氦气Linde AGHelium 4.8
O2CLEA Medizintechnik GmbHO2C Version 1212配备 LF-2 或 LF-3 探头
红外测温仪VoltcraftVOLTCRAFT IR 260-8S
热成像相机InfraTec GmbHVarioCAM HD head 820
热成像分析软件InfraTec GmbHIRBIS 3
迈耶苏木精溶液Merck 1.09249
伊红溶液VWR International GmbHMerck 1.09844
Masterflex L/S 易装型蠕动泵Cole-Parmer Instrument Company型号 7518-10
输注泵B. Braun Melsungen AGPerfusor secura FT
数字压力计Greisinger electronicGMH 3161
50 mL 输注泵注射器B. Braun Melsungen AG货号 8728810 F
输注管路，IV 型标准，PVC 鲁尔锁B. Braun Melsungen AG货号 8722960
三通旋塞阀，Dicofix C35CB. Braun Melsungen AG货号 16494 C
丝线 2-0，3 公制Resorba货号 H5F
Vicryl 4-0 缝合包EthiconV1224H
0.9% 氯化钠溶液B. Braun Melsungen AG

参考文献

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