原发性肾组织节段的显微解剖及其与新型无支架构建技术的整合

摘要

组织工程化肾脏结构为解决器官短缺及透析带来的有害影响提供了一种方案。本文描述了一种从小鼠肾脏中显微解剖分离皮质-髓质节段的实验方案。这些节段被植入无支架的细胞结构中，形成肾脏类器官。

摘要

目前，肾移植已成为终末期肾病的主流治疗方法。然而，等待移植的患者约有96,000人，其中仅有四分之一能够成功接受移植，因此迫切需要为器官功能衰竭患者提供替代治疗方案。为了减少透析带来的有害后果及其引发的整体医疗成本，目前正积极开展研究，以寻找器官移植以外的替代方案。可植入的组织工程化肾细胞结构便是替代丧失肾功能的一种可行方法。本文首次描述了从小鼠肾脏中进行显微解剖以分离存活的皮髓质肾段的方法。这些肾段能够快速整合到无支架的内皮细胞-成纤维细胞结构中，从而在植入后迅速与宿主血管系统建立连接。成年小鼠的肾脏取自活体供体，随后在体视显微镜下进行显微解剖，获取直径为200–300 µm的肾段。仅需一个肾脏所获取的原代肾段即可构建多个肾组织结构。该方法展示了一种可能从原本会被废弃的器官中挽救功能性肾组织的技术路径。

引言

慢性肾脏病（CKD）是当前全球主要的公共卫生挑战之一¹。在美国，CKD 的患病率超过总人口的14%，其中超过60万名美国人患有最严重的形式——终末期肾病（ESRD）²。目前针对 ESRD 患者的治疗选择包括透析和肾移植。尽管每年约有2.5万名患者接受肾移植手术，但每年新增等待移植的患者数量巨大，导致等待救命器官的患者与实际接受移植的患者之间存在显著差距³。透析不仅对寿命和生活质量产生严重的负面影响，还伴随着惊人的经济负担。2014年，美国医疗保险为 ESRD 患者支付的索赔总额超过300亿美元²。由于器官供应有限，且需要透析的患者数量未见明显下降趋势，因此寻找透析和移植替代方案的研究显得尤为重要。即使能够相对短暂地延缓透析的开始时间，也能显著增加患者的生命质量调整年数和生产力，同时推迟与透析相关的费用支出^4,5,6。

目前，组织工程与再生医学实验室正在研究针对功能性组织缺损（如终末期肾病中的情况）的各种解决方案，研究方法多种多样，包括基于支架的类器官构建，以及利用脱细胞器官结构进行细胞植入的全器官工程等^7,8,9,10,11。然而，利用边缘性或废弃肾脏重建复杂肾结构的研究尚处于初步阶段。事实上，约有20%的移植用获取肾脏因各种原因被废弃^12,13。这些潜在移植物中的功能性肾组织可被加以利用，并整合到一个或多个组织工程构建体中。先前的研究已证明使用这些废弃器官的可行性，例如将肾脏用于获取细胞外基质以服务于组织工程目的^14,15。然而，极少有研究将健康肾脏中的原代肾单位组织用于组织工程目的^16,17,18。

Kim 等此前描述的一种方法涉及从健康大鼠肾脏中分离"肾段"，随后将其接种于聚乙醇酸（PGA）支架上以构建组织工程结构¹⁶。然而，该方法未详细说明具体的解剖操作步骤，且肾段是通过精细剪碎结合过滤的方式获得。本文介绍对该方案的一项改进，同样可获得具有完整肾元结构的离散肾段，但改用显微解剖技术。该操作在活体成年小鼠上进行肾切除术，随后将肾脏转移至解剖显微镜下，去除肾包膜并进一步解剖组织。使用小口径30½ G针头作为切割工具，同时也作为解剖过程中的辅助引导，因为针头直径与目标肾段直径一致。所分离的（本例为小鼠）肾段在体外培养中保持活性，并可与无支架的内皮-成纤维细胞复合结构整合¹⁹。此类复合结构此前已被用于其他器官的组织工程构建，包括生物人工胰腺²⁰。

方案

以下所述的所有动物手术操作均在南卡罗来纳医科大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准后方可实施，且仅在获得批准后才进行动物手术或使用任何动物组织。

1. 小鼠肾切除术

1. 佩戴外科口罩和无菌帽，以最大限度降低污染风险。在设置过程中保持无菌状态 手术区域
   1. 在手术台上铺放非孔型手术单。
   2. 将已灭菌的器械包打开，放置于无菌手术单上。肾切除术所需的器械包括3把小型止血钳、带齿精细镊子、无齿精细镊子和直型虹膜剪。
   3. 在手术台中央放置另一块无孔手术单。
   4. 在15 mL无菌锥形管中配制5 mL含钙和镁的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS），并添加1%青霉素/链霉素。将该溶液置于冰上，放置于手术台旁。
2. 从动物饲养中心获取一只8至12周龄的C57BL/6小鼠（雄性或雌性）。
3. 将小鼠放入麻醉诱导室，使用3.5%吸入式异氟烷进行诱导。随后为小鼠佩戴鼻罩，以2%异氟烷维持麻醉。
   1. 在整个手术过程中，通过评估足部反射（用力捏压脚趾）定期监测麻醉深度是否足够。
4. 使用脱毛膏去除腹部躯干区域的所有毛发。用蒸馏水冲洗该区域，确保腹部所有毛发均已清除。
5. 将小鼠置于无菌手术台上，仰卧于上方非开孔洞巾下。剪取一块 2 x 2 cm² 在覆盖小鼠腹部的手术巾上开一个小窗。
6. 使用无菌纱布或棉球将聚维酮碘涂抹于腹部，随后使用70%乙醇。
7. 使用带齿精细镊子和虹膜剪，在3 - 4处进行操作 沿腹正中线左侧0.5 cm处作一与正中线平行的垂直腹部皮肤切口
   注意： 若需摘除右肾，则切口位于中线右侧0.5 cm处。
   1. 用无齿精细镊子夹住腹膜，用虹膜剪刀剪开以进入腹腔。用止血钳夹住皮肤和腹膜的上下侧缘，向侧方施加张力以增强暴露。
   2. 将肠内容物轻柔地移至腹腔右侧，以暴露左肾。轻柔牵拉肾脏，使其从腹腔中抬出。
   3. 用止血钳夹住左肾肾门处，使用虹膜剪剪断输尿管及肾血管。
   4. 将左肾置于含1%青霉素/链霉素的DPBS溶液中，冰上保存。
   5. 将装有肾脏的离心管转移至无菌组织培养操作台。将肾脏从15 mL锥形离心管转移至60 mm培养皿中（图1）。用5 mL含钙和镁的DPBS冲洗两次。将肾脏悬浮于5 mL DPBS中，置于60 mm培养皿内。
      1. 另准备一个60 mm培养皿，加入5 mL DPBS，用于显微解剖步骤。
   6. 根据批准的IACUC动物实验方案，在获取肾脏后通过开胸术和放血法处死小鼠。

2. 用于肾段分离的小鼠肾脏显微解剖

1. 在此部分操作中继续采用无菌技术，包括佩戴无菌手套、外科口罩和无菌帽，以尽量降低污染风险。
   1. 在体视显微镜平台及其左右两侧区域铺设无菌敷料，以形成器械的无菌区域。在显微镜调焦旋钮上覆盖塑料粘性保护膜，并喷洒70%乙醇。打开双管蛇形灯，照亮载物台。
   2. 打开无菌器械包（无齿精细镊子、手术刀柄、#15 手术刀片、两把直止血钳、两根 30½ 号空心针），置于无菌巾上。立即将 #15 刀片安装至手术刀柄，并将每根针的针座/针 hub 与一把止血钳连接，制备成针状解剖器械以供后续使用，如图所示 图1.
2. 将分别装有肾脏组织的DPBS和仅含DPBS的60毫米培养皿从组织培养操作台转移至显微镜区域。
   1. 将60 mm培养皿置于物镜下，打开皿盖以暴露肾脏。将盛有DPBS的培养皿放置于无菌区域一侧，以备后续使用。
   2. 移动培养皿，使仅观察到肾脏的前表面或后表面即将肾脏较大的扁平面朝下，另一面接触培养皿底部。此步骤中将放大倍数调至3.2–4倍。用非优势手持无齿精细镊子，从肾脏的下极和上极附近刺入并将其固定在培养皿上。
   3. 用非优势手固定肾脏。用优势手持15号刀片，去除暴露表面透明的纤维囊层。从肾脏暴露表面最表层削去约0.5 mm，以彻底去除残留的囊膜。
   4. 使用#15刀片从去囊区域切下一倒置的锥形组织，大小约为2 mm³ 大小。取出仅含有DPBS的60-mm培养皿，将组织块放入干净的培养皿中。弃去肾脏的剩余部分。
   5. 将放大倍数降低至1.5–2.0倍，用于后续解剖操作。使用两把止血钳-针头器械作为切割工具，将组织碎片逐步切割成更小的片段，直至组织片段的尺寸小于或等于针尖的直径。肾组织2 mm³ 大小将产生超过50个节段，完全解剖后。
   6. 将含有肾组织段的60 mm培养皿转移至组织培养操作台。用1000 µL移液器吸除DPBS。加入5 mL DMEM，添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素。
   7. 在37 °C培养箱中培养3天，或立即植入细胞构建物中。

3. 肾段细胞结构的构建

1. 培养正常人真皮成纤维细胞（NHDF）和人脂肪微血管内皮细胞（HAMEC）数周，以获得每构建体所需的 7.2 × 10⁵ 个成纤维细胞和 1.8 × 10⁵ 个内皮细胞。在组织培养罩内，将成纤维细胞与内皮细胞按适当比例（4:1）接种至琼脂糖模具中的棒状孔中，以形成无支架的前血管内皮-成纤维细胞构建体（SPEC），具体方法如 Czajka et al¹⁹ 之前所述。
2. 准备无菌止血钳、30½ G 针头以及一端为平头的无菌刮铲。
   1. 从含有肾段的 60 mm 培养皿中移除大部分培养基，注意避免吸除肾段。
   2. 佩戴手术放大镜以辅助观察肾段的植入过程。
   3. 用刮铲末端轻轻刮取 60 mm 培养皿底部，获取 10–15 个肾段，并均匀分布于刮铲尖端。将刮铲尖端尽可能靠近已接种 SPEC 的孔边缘放置。
   4. 用另一只手持止血钳-30½ G 针头装置，将每个肾段从刮铲尖端转移至孔边缘。用针头轻柔地将每个肾段推入孔中，直至其略微浸入先前接种的细胞悬液中。
   5. 在 FGM-2/EGM-2/DMEM 培养基（2:1:1 比例，总体积 2.5 mL）中培养肾段-SPEC 构建体。每 24 小时更换一次培养基，持续 3 天。在 72 小时后将构建体从模具中取出，并进行固定或速冻处理以备后续分析。

结果

本方案描述的方法可从每块锥形、体积为2 mm³的肾组织中获得约50段肾组织片段。经处理和成像的肾组织片段中，肾小管和肾小球成分的比例各不相同（见图2）。将完整的组织片段用于检测，在三天内每隔24小时测定各片段的活性一次。绿色荧光的钙黄绿素-AM（calcein-AM）在具有细胞内酯酶活性时存在，提示细胞存活；红色荧光的溴化乙锭同型二聚体-1（ethidium homodimer-1）则在细胞质膜完整性丧失时出现。尽管这些组织片段为完整的三维结构，但通过共聚焦显微镜观察，可明显看到检测试剂已实现显著渗透（见图3）。

使用相同的细胞活力检测法进一步表征各片段的尺寸均一性。将片段置于带有凹槽的载玻片上，并在无任何机械外力作用于片段任一维度的情况下加盖盖玻片。片段自由悬浮，在加入细胞活力/毒性检测试剂30分钟后进行成像。...

讨论

用于构建活体肾组织结构的方法在所使用的细胞类型和生物材料方面存在广泛差异，且许多方法在文献中已过时或表征不充分⁷。尽管目前有许多研究采用干细胞策略或将肾脏结构的各个组分单独重建，但从细胞悬液出发人工重建一个包含超过26种不同分化细胞类型的完整器官，这一设想仍极具挑战性²¹。这可能是为何其他研究转向采用肾组织片段进行组织工程应用的原因。如上所述，先前已有将肾组织片段分离后接种于PGA支架上的研究报道¹⁶。然而，该研究中描述的组织片段分离方法细节极少，且未对分离后的片段进行任何时长的培养以评估其活性。本文所述方法结合细胞活性检测显示，至少在72小时时间点，肾组织片段的部分区域仍维持着活性，此结果此前尚未见报道。此外，该方法具有可产生尺寸相对可预测的组织片段的优势。同时，这些方法为改善衰竭肾功能提供了具有临床转化潜力的途径，主要体现为一种可行的技术方案——从原本将被丢弃的器官中分离出原代肾组织片段。

在方法开发过程中，最大的挑战首先是找到合适尺寸...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无孔无菌巾	Busse Hospital Disposables	696
带孔无菌巾	Busse Hospital Disposables	697
Halsted 蚊式止血钳，5个弯曲	Miltex	Mil-7-4	"在文稿中称为“Hemostat”"
超精细带齿Graefe镊，弯曲型	Fine Science Tools	11155-10	带齿精细镊
超精细Graefe镊，锯齿状（无齿）	Fine Science Tools	11152-10	无齿精细镊
精细剪刀——碳化钨材质	Fine Science Tools	14568-09	虹膜剪刀
含泵碘伏外科洗手液，聚维酮碘 7.5%	Purdue Products L.P.	67618-151-17
无菌棉纱布垫（4" × 4"）	Fisher Healthcare	22-415-469
杜尔贝科磷酸盐缓冲液	Corning	21-030-CV
青霉素/链霉素溶液，100倍浓缩	Corning	30-002-Cl
异氟烷，USP标准	制造商：Piramal，经销商：McKesson	2254845
Nair脱毛剂	Nair	22600-23307	文中称为脱毛乳膏
200 proof乙醇	Decon Laboratories	2705	稀释为70%乙醇溶液
BioLite 60 mm细胞培养皿	Themo-Scientific	130181
Press'n Seal保鲜膜	Glad	12587-70441	用于体视显微镜
SZX16体视显微镜	Olympus	SZX16
光纤照明器	Cole Parmer	41720-20
自支撑双光源导光管，23"长鹅颈管	Cole Parmer	EW-41720-60
3号手术刀柄	Miltex	Mil-4-7
无菌肋背碳素钢刀片，刀片尺寸15	Bard-Parker	371115
31½号针头	ThermoFisher Scientific	14-826F	Becton Dickinson 305106
杜尔贝科改良伊格尔培养基	Corning	10-017-CV
胎牛血清（100%）	Atlas Biologicals	FS-0500-AD
正常人真皮成纤维细胞	Lonza	CC-2511
人脂肪微血管内皮细胞	Sciencell Research Laboratories	7200
外科手术放大镜（2.5倍）	Orascoptic	(N/A) 定制订单
FGM-2（成纤维细胞基础培养基，添加FGM-2 SingleQuots）	Lonza	CC-3131, CC-4126
EGM-2（内皮细胞基础培养基，添加EGM-2 SingleQuots）	Lonza	CC-3156, CC-4176
哺乳动物细胞活/死细胞活力/细胞毒性检测试剂盒	ThermoFisher Scientific	L3224
抗细胞角蛋白-18抗体	Abcam	ab668
山羊抗小鼠IgG，Alexa Fluor 633标记	ThermoFisher Scientific	A-21052
山羊抗兔IgG，Alexa Fluor 546标记	ThermoFisher Scientific	A-11010
抗血管性血友病因子抗体	Abcam	ab6994
牛血清白蛋白-异硫氰酸荧光素偶联物	Sigma Aldrich	A9771-50MG
Hoescht 33342	BD Pharmingen	561908
背景抑制剂（Background Buster）	Innovex Biosciences	NB306