昆虫精母细胞中染色体的显微操作

摘要

在本实验方案中，我们描述了用于显微操作的合适细胞的选择与制备方法，以及利用压电驱动显微操作仪在细胞内重新定位染色体的操作过程。

摘要

染色体的显微操作一直是阐明染色体排列、纺锤体检查点以及后期染色体运动机制的重要方法，对于理解细胞分裂过程中染色体运动的调控机制具有关键作用。一位技术娴熟的生物学家可以使用显微操作仪将染色体从纺锤体上分离，将染色体在细胞内重新定位，并利用尖端极细的玻璃针向染色体施加外力。尽管可以采用其他方法（如光镊或激光）对染色体进行扰动，但迄今为止，尚无其他方法能够在对细胞几乎无损伤的情况下，实现对数十至数百微米尺度上细胞组分的重新定位。

本文描述了用于染色体显微操作的合适细胞的选择与制备方法，重点介绍了蝗虫和蟋蟀精母细胞原代培养物的制备，以用于活细胞成像和显微操作。此外，我们展示了用于在细胞内移动染色体的微针的制备方法，以及使用连接玻璃微针的操纵杆控制压电式显微操作仪在分裂细胞内重新定位染色体的技术。一个示例结果展示了利用显微操作仪将一条染色体从初级精母细胞的纺锤体上分离并重新定位到细胞内的过程。

引言

显微操作技术揭示了染色体列队、纺锤体检查点以及后期染色体运动机制的部分内容。最早描述显微操作实验结果的出版物由 Robert Chambers 发表¹。Chambers 使用一种带有连接玻璃针的机械式显微操作器，对多种不同类型细胞的细胞质进行探查。遗憾的是，当时尚无可用的对比成像方法来观察活细胞中的染色体及其他许多细胞组分，因此 Chambers 的实验无法展示重新定位这些细胞组分所产生的效应。早期通过显微操作改变染色体位置的实验，曾使用 Chambers 装置在分裂后期细胞中扫过纺锤体中区，结果表明此类操作可改变蝗虫神经母细胞在后期时染色体臂的位置²。Nicklas 及其合作者首次实现了对染色体的精细显微操作，包括拉伸染色体³、将染色体从纺锤体上剥离并诱导其重定向^3,4、通过向染色体施加张力来稳定错误取向^5,6,7，以及测量分裂后期纺锤体产生的作用力^8,9。Nicklas 实验室的其他研究还表明，细胞质颗粒也可被操纵¹⁰，且中心体可通过显微操作重新定位¹¹。显微操作不仅可用于移动染色体和其他细胞组分，还可使用显微操作针在去膜细胞中干净地切断有丝分裂纺锤体¹²，或用于溶解核膜¹³。此外，相邻细胞也可通过显微操作实现融合^14,15。

利用显微操作技术可以开展多种有趣的实验，但令人惊讶的是，最初仅有极少数染色体生物学家开展过此类实验。造成这一现象的原因之一在于，通常用于研究染色体运动的脊椎动物组织来源的体外培养分裂细胞极难进行显微操作。这类培养细胞通常具有皮层细胞骨架，会"阻碍显微操作针的进入"，导致染色体无法被针触及，或针强行穿过细胞造成细胞破裂和死亡。我们以及其他使用显微操作技术的研究人员发现，节肢动物细胞更适合进行显微操作。节肢动物的精母细胞在卤代烃油层下易于铺展，且在细胞分裂期间其细胞膜下方的皮层细胞骨架明显较弱。因此，节肢动物的睾丸是获取减数分裂细胞（精母细胞）和有丝分裂细胞（精原细胞）的良好来源，其染色体易于进行显微操作。对一只在操作过程中固定的蝗虫精母细胞进行连续切片观察发现，操作针从未穿透细胞膜，而是细胞膜在针周围发生形变（Nicklas R.B.，个人通讯）。已有多种昆虫和蜘蛛类群的精母细胞成功实现了显微操作，包括蝗虫、螳螂、果蝇、摇蚊、蟋蟀、沫蝉、蛾类、黑寡妇蜘蛛、 cellar spiders（幽灵蛛）和圆网蛛等^{3,7,17,18,19,20,21,22}。昆虫来源的有丝分裂培养细胞也可进行显微操作。例如，蝗虫神经母细胞在原代培养中其染色体即可被方便地进行显微操作^2,23。我们推测，目前已有的一些源自Drosophila及其他昆虫的细胞系也可能适用于显微操作，尽管我们尚未在这些细胞中验证该技术。本文将介绍如何制备蝗虫和蟋蟀的分裂细胞以进行显微操作。蟋蟀全年均可从大多数宠物商店方便获得。蝗虫则通常仅在夏季容易获取，除非研究人员可接触实验室种群；但所用物种（Melanoplus sanguinipes）具有易于压平的细胞以及长而易于操作的染色体。

少数生物学家开展显微操作实验的另一个原因是，能够良好移动染色体的显微操作仪在市场上极为罕见。我们发现，由操纵杆控制的压电式显微操作仪可实现针尖的无振动、无漂移、无滞后运动，即操纵杆的移动与针尖的移动完全同步；然而，其他类型的显微操作仪也可成功推动细胞内的染色体。Ellis 和 Begg^25,26 设计的显微操作仪非常适合染色体显微操作，尽管其采用的是较早的技术。目前市面上可获取的压电式显微操作仪在电生理学研究中被广泛使用；但这些设备通常不配备操纵杆控制。操纵杆控制对于实现成功显微操作所需的平滑运动至关重要，因此应定制操纵杆，以便将目前可获得的压电式显微操作仪应用于染色体显微操作。性能最佳的操纵杆控制型压电式显微操作仪具备直接位置控制功能，即操纵杆的移动直接转化为针尖的对应运动。

一种新设计的压电微操作器可由市售易更换的部件和一些小型3D打印组件构成，适用于染色体微操作²⁴。该微操作器具有可调节的灵敏度、手动粗调定位功能，且针尖运动无振动、漂移或滞后现象，并可实现对针尖位置的直接控制。科研人员可根据在线提供的说明自行构建该微操作器²⁴。以下是制备初级精母细胞培养物以及对该培养物中细胞内的染色体进行微操作的方法。

方案

1. 用于显微操作的原代昆虫精母细胞培养物的制备

1. 载玻片制备
   1. 取一块尺寸为 75 mm × 25 mm 的玻璃载玻片，其中心位置有一个直径为 20 mm 的圆形孔洞。
      注意：这些载玻片由单片窗玻璃切割而成，大小与标准载玻片相同，中心带有圆孔。
   2. 将一块 25 mm × 25 mm 的 #1.5 盖玻片通过本生灯火焰灼烧 2 秒。
   3. 在玻璃载玻片的圆孔边缘涂抹真空脂。
   4. 将盖玻片覆盖在圆孔上，如图 1所示。轻轻按压，确保形成严密的密封。
   5. 翻转载玻片，向解剖槽内加入卤代烃油。
2. 显微镜观察用精母细胞培养物的制备
   注意：此处描述的方法使用蚱蜢或蟋蟀细胞进行培养。其他节肢动物的睾丸组织也可采用类似方法进行培养。
   1. 获取未成熟雄性蟋蟀（或蚱蜢）。将活体昆虫置于冰箱中约 2 分钟，使其低温麻醉。使用解剖剪沿腹部纵轴方向，在翅芽后方平行剪开背侧体壁。用手轻轻挤压腹部，使睾丸从外骨骼切口处挤出（图 2）。
   2. 用镊子将分离出的睾丸放入盛有卤代烃油的解剖槽中。
   3. 如有需要，可在解剖显微镜下观察睾丸。使用尖头镊子将其分割成更小的组织块，去除覆盖在睾丸表面的脂肪组织，并继续用尖头镊子将睾丸组织充分分散（图 3A 和 3B）。将睾丸内容物在盖玻片表面的油下展开（图 3C）。
   4. 继续展开睾丸内容物，直至展开区域肉眼几乎不可见（图 3C）。如需要，可使用额外加有油的解离槽。

2. 显微操作

1. 微针的制备
   1. 将一根（外径0.85 mm，内径0.65 mm）玻璃管的一端置于本生灯火焰中。以形成150°角的方式拉伸玻璃管末端，使其延伸出一段细长的窄径玻璃管。在细径区域折断玻璃管，使从弯角延伸出的细管部分长度约为10 mm（图4A）。
   2. 使用显微操作仪（可自制，参考Powell²⁷，或使用市售产品——见材料表），将玻璃针尖接触加热的铂丝以熔化针尖处的玻璃。使玻璃针与显微操作仪的铂丝之间形成约45°角（图4B）。在关闭铂丝加热的同时，将玻璃针从热铂丝上拉离，从而在玻璃针末端形成长度≤1.5 mm的细尖。
      注：针尖直径难以精确测量，但此长度的针尖通常可制成坚固且具有一定柔韧性的微针，适用于显微操作。也可使用微电极拉制仪制备具有合适尖端直径的玻璃毛细管（实验者需尝试不同的拉制程序，以获得适合本实验的坚固而柔韧的微针）。该针可置于与上述方法所制操作针形状相似的针夹中。
2. 显微操作仪的定位
   1. 将制备好的载玻片置于倒置相差显微镜的载物台上。找到正在分裂的细胞，并将其置于视野中央。使用尽可能低的放大倍数对细胞进行调焦。
      注：我们使用了16倍相差物镜。
   2. 将微针安装在显微操作仪的针夹上。
   3. 手动将微针置于显微镜光路中，使针尖被光线照亮（图5B）。
   4. 将显微镜调焦至细胞所在焦平面之上的若干焦平面处。
   5. 使用操纵杆控制器在低灵敏度下多次调整微针位置，以在X轴和Y轴方向上找到针尖的投影阴影。持续微调位置，直至针尖位置可见。沿Z轴方向调整针的位置，直至针尖清晰对焦。
   6. 重新对细胞进行调焦，然后将显微镜焦点移至细胞平面上方，使细胞刚好处于失焦且不可见的状态。再次调整微针位置，使其针尖在此焦平面上清晰对焦。
   7. 根据需要调整显微镜的放大倍数。
      注：我们使用100倍、数值孔径（NA）1.4的相差物镜进行显微操作。
   8. 在使用高倍物镜对细胞完成对焦后，再次将显微镜焦点调至细胞平面上方，使细胞刚好失焦且不可见。切换至较高灵敏度设置，重新调整微针位置，使其针尖在细胞平面上方的焦平面中清晰对焦并居中。
   9. 重新对细胞进行调焦，并调整其位置以保持其位于视野中心。此时微针已准备就绪，可用于显微操作。
3. 染色体的显微操作
   1. 采用与高倍镜下精细定位相同的灵敏度设置，使用操纵杆控制微针，在细胞内推动染色体移动。保持针尖位于细胞平面之上。
   2. 若需牵拉或移动某条染色体，应先对靠近细胞顶部的染色体进行调焦。
      注：此类染色体更易于操作；若操作靠近盖玻片的染色体，则微针容易与盖玻片摩擦，导致细胞破裂，实验终止。
   3. 调节操纵杆上的Z轴，使针尖清晰对焦，然后使用操纵杆在X和Y方向上移动针尖。将针尖直接置于目标染色体上，并沿所需方向推动，以实现对染色体的重新定位。
   4. 根据推动的距离，可对染色体施加张力，或施加足够张力使其从纺锤体上脱离。一旦染色体脱离纺锤体，可将其置于细胞内的任意位置。

结果

图6展示了对两个相邻的蝗虫初级精母细胞进行显微操作的示例，体现了显微操作可能应用的多种情况。本实验使用倒置相差显微镜完成。0:00（时间格式为分:秒）图像显示了操作前的两个细胞。在底部细胞中，一条染色体受到显微操作针施加的张力（0:05；黑色箭头），随后完全从纺锤体上脱离（0:10；黑色箭头）。在底部细胞中的另一条染色体（6:25；黄色箭头）被推向该细胞的一个纺锤极（7:05；黄色箭头），然后被移出主纺锤体区域（7:10；黄色区域）。本实验中所有被操作的染色体（黄色和黑色箭头）均通过显微操作针持续轻推，阻止其重新附着到纺锤体上，从而防止新的纺锤体连接形成。部分图像中可见显微操作针投下的阴影，但针尖本身通常不可见。这些图像表明，利用显微操作可以实现对染色体的重新定位、施加张力以及从纺锤体上脱离。染色体在其前中期、中期和后期均可从纺锤体上脱离，但后期染色体极难脱离。

讨论

通过练习，移动细胞内的染色体可变得轻而易举。既要足够坚硬又要尖端足够细的显微操作针难以制备 "掌握诀窍" 制作精细的显微注射针需要技巧，但这种能力也需通过练习获得。若针头过于纤细，以至于在卤代烃油中移动时发生变形，则无法有效推动细胞内的染色体。若针头过于钝拙，其尖端清晰可见且直径达到染色体宽度的1/3或更大，极有可能导致细胞死亡。因此，制备出足够精细以推动染色体、又不至于过于钝拙而杀死细胞的针头，是本实验方案的关键步骤。

当使用健康的生物体进行精母细胞制片，并选择靠近细胞顶部表面的染色体进行显微操作时，通常能够获得成功。若尝试操作靠近盖玻片表面的染色体，常常会导致显微操作针与盖玻片发生摩擦，进而刺破细胞，导致实验终止。只要细胞未被刺破或未出现其他损伤，细胞应能在显微操作后存活。细胞死亡可轻易判断，表现为染色体迅速聚集形成团块。经显微操作的细胞通常可存活至后期和胞质分裂阶段，我们已成功完成长达6小时的显微操作实验。

尽管显微操作技术的学习曲线较为陡峭，且需要配备相应的设备，但能够以精确的方式手动重定位细胞组分具有...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
VWR 微型盖玻片	VWR	48366 249	25 mm × 25 mm，1.5 号
道康宁高真空润滑脂	VWR	AA44224-KT
KEL-F 油 #10	俄亥俄河谷特种化学品公司	10189
不锈钢显微解剖剪	Sigma-Aldrich	S3271-1EA
Dumont #5 精细镊子	精细科学工具公司	11254-20
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