基于改进多平台法的大鼠中心疲劳模型

摘要

在这里, 我们提出了一个使用改进的多平台方法 (MMPM) 来引入大鼠中心疲劳模型的协议。

摘要

本文采用改进的多平台法 (MMPM), 介绍了一种大鼠中心疲劳模型。多平台箱设计成一个水箱, 底部有狭窄的平台。模型鼠被投入了坦克并且在平台上站立了14小时 (18:00-8:00) 每天连续21天, 与空白控制小组设置为对比。建模结束时, 模型组大鼠表现出明显的疲劳状态。为了评估模型, 我们进行了几个行为测试, 包括开放场测试 (常), 高附加迷宫 (吸盘) 测试, 和详尽的游泳 (ES) 测试。结果表明: 模型大鼠焦虑、空间认知功能障碍、肌肉表现不佳、自愿活动减少, 证实了中枢性疲劳的诊断。中枢神经递质的变化也验证了结果。最后, 该模型成功地模拟了中心疲劳, 未来的研究与模型可以帮助揭示疾病的病理机制。

引言

疲劳是威胁人类健康的主要因素之一¹。在过去的几十年里, 各种研究已经证明疲劳是外围触发的, 但集中驱动, 总是伴随着情感和认知障碍。意大利生理学家 a. Mosso 首先提出了 "中心疲劳²" 这个词。它一般被定义为有限的自愿活动和认知功能障碍, 由于中枢神经系统的冲动传输功能障碍 (CNS)³。与周围肌肉疲劳相比, 中枢性疲劳强调中枢神经系统的变化, 以及由此产生的情绪/行为紊乱, 包括抑郁、焦虑、认知障碍和记忆力减退。一项研究表明, 许多因素会导致中枢性疲劳, 其中过度的体力活动和精神压力是相当不可缺少的⁴。至于发病机制, 如色氨酸-犬尿氨路径假说⁵解释某些途径的变化;然而, 还需要更深入的研究来揭示中枢性疲劳的中枢-周边相关性。

由于中心疲劳的基本机制尚不清楚, 有效的动物模型对进一步的研究具有十分重要的意义。现有的疲劳模型大多是由过度运动引起的, 如跑步机⁶和负重游泳⁷, 很少关注心理因素。为了更好地模拟中心疲劳的发展, 我们小组开发了 MMPM 的大鼠模型。在建模过程中, 老鼠仍然站在狭窄的平台上, 在多个平台盒长时间, 包括部分睡眠时间。与过度运动模型不同, MMPM 模型采用部分睡眠剥夺作为心理因素, 考虑到复杂的中枢性疲劳发病机制。

对于模型评价, 我们使用经常和测验来确定焦虑情绪和自愿活动。采用 ES 试验对周围肌肉的性能进行测量。此外, 我们采取大鼠的大脑和检测多巴胺 (DA)/血清素 (5 HT) 的内容, 在两个 hypothalamuses 观察中枢神经递质的差异。

下面提出的协议旨在模拟在人类生活中常见的情况下, 反复的体力活动和缺乏睡眠导致的中枢疲劳。然而, 通过调整模型的持续时间, 它可以用于许多其他领域, 如睡眠观察和应力研究。在今后的研究中, 我们希望这一模型能帮助发现更多的中枢神经系统变化及其与周边体系的联系, 揭示中枢性疲劳的发病机制。

方案

所有的动物都是按照中国关于实验室动物的道德使用和护理的法律来维护的。

1. 预建模前准备

1. 实验室准备
   1. 在实验前至少30分钟运行紫外线灯。
   2. 控制实验室温度在 25 3 摄氏度, 相对湿度约30% 左右。
   3. 打开实验室灯在6:00 和关闭在18:00 建立一个 12 h/12 h 光/暗循环。
2. 多平台箱结构
   1. 构造一个不透明的塑料罐, 不盖 110 x 60 x 40 厘米³。
   2. 固定十五个圆形平台 (h = 8 cm, d = 6.5 cm) 在坦克的底部, 有序地分布在三行和五列。在每个平台之间留出足够的空间, 各列之间大约有10厘米, 行之间有13厘米。
   3. 在水箱的侧面设置一个出水口, 并安装一个水龙头。
   4. 用一个挂在上面的食物盒做一个铁网盖。
3. 分组和住房大鼠
   注: 实验中使用8周大的雄性大鼠, 重约 200-210 克。在建模过程中, 老鼠成群地活着。
   1. 用记号笔数老鼠的尾巴根。
   2. 对大鼠进行称重, 排除极轻或重的老鼠, 将其余的随机分为模型和对照组。
   3. 把老鼠轻轻地放进干净的笼子里, 让他们适应实验室至少3天。提供充足的水和食物供应。

2. 用 MMPM 建模

注: 该过程从18:00 开始, 第二天以8:00 为单位, 每天总计14小时, 超过21天。为了避免干扰因素, 同一个人需要进行整个实验, 同时穿着相同的实验室大衣。实验中使用了10只大鼠。

1. 把油箱放在平坦的表面,例如地板上。然后用大约7厘米的温暖 (25 3 °c) 的水填满油箱, 在平台平坦的下面大约1厘米。
2. 准备足够的食物和饮料为所有的老鼠在坦克1天。把饲料和水放进食物盒里, 把它挂在盖子上。
   注意: 一些聪明的老鼠学会在食物盒上休息。如果是的话, 把他们送回坦克。
3. 把模型组的老鼠从笼子里拿出来, 抓住它们的尾巴, 然后轻轻地放进油箱里。在水中发射所有的老鼠, 而不是平台来激发他们对水的恐惧。确保每只老鼠都有一个平台站立, 而控制组的老鼠留在他们原来的笼子里, 有足够的食物和水。
4. 把油箱盖上监视老鼠以避免意外伤害。如果一只老鼠在水中停留超过1小时而不爬上平台, 从油箱中取出, 然后从测试中取下。
5. 14小时后, 把模型鼠从水箱里拿出来, 用烘干机擦干头发。如果老鼠的尾巴褪色, 就重新标记。把老鼠送回原来的笼子里, 给他们提供足够的食物和水。
6. 冲洗油箱的每个角落。抬高油箱一侧, 打开水龙头流出污水。
7. 用75% 乙醇喷雾消毒油箱, 并将其暴露在紫外线照射下。

3. 模型评估: 行为测试

注意: 所有的测试都是在行为实验室进行的。在测试期间不允许噪音和额外光线, 以避免干扰。如果可能, 请使用同一个人进行每次测试。图像处理中灰度识别需要深色外套和手套。执行经常第一, 因为它对老鼠的行为影响最小。

1. 经常
   1. 在打开的字段框上检查录音机, 确保它正确地连接到工作站上, 并覆盖盒子的每个角落。调整照明以消除框中的阴影。
   2. 把老鼠搬进他们原来的笼子里的行为实验室。允许他们在测试前至少适应1小时。
   3. 用75% 乙醇清洁和消毒盒子, 以确保以前的实验没有留下任何粪便或气味。
   4. 从笼子里取出一只老鼠的背部, 轻轻地放进盒子的中央区域。迅速撤退的武器从箱子, 以免阻止射击。
   5. 输入老鼠的号码, 开始录音。计数和记录大鼠垂直活动的频率, 包括饲养和攀登。
   6. 5分钟后, 停止录音, 把老鼠从盒子里拿出来, 把它还给笼子。
   7. 重复步骤 3.1.3 3.1.6 直到所有的老鼠都完成了测试。
2. EPM
   1. 对经常 (步骤 3.1.1 3.1.2) 执行预检和驯化步骤。
   2. 把老鼠从笼子里拿回来, 轻轻地放到两只胳膊的接合处。把老鼠朝左张开的手臂, 并迅速离开, 以免阻止射击。
   3. 输入老鼠的号码, 开始录音。计数和记录不同臂入口的频率。如果老鼠在测试中掉下迷宫, 把它捡起来送回迷宫。记录数据分析的详细信息。
   4. 5分钟后, 停止录音, 把老鼠拿出来, 把它还给笼子。
   5. 去除粪便, 用75% 乙醇擦拭迷宫, 消除前鼠的气味。
   6. 重复步骤 3.2.2 3.2.5 直到所有的老鼠都完成了测试。
3. ES 试验
   1. 填充泳池 (70 x 30 x 110 厘米³) 与 80 cm 温暖 (25 @ 3 °c) 水。
      注: 如果水箱中有恒温器, 水温应设定在37摄氏度左右, 这与大鼠的体温相似。如果没有, 将其设置为室温以保持其恒定。
   2. 给每只有针束的老鼠装上重物, 然后轻轻地把它绑在尾巴根部。负荷重于大鼠体重的10%。
   3. 抓住一只老鼠的尾巴, 把它扔进泳池。如果老鼠蜷缩或附着在墙上, 把它们分开, 把它们驱回水中。
   4. 开始计时的时候, 当老鼠被放进水中, 停止时间时, 它的疲惫, 这是证明是失败的水与嘴和鼻子在水下超过十年代。
      注意: 有时, 疲惫和溺水突然发生。一定要有足够的实验者记录和保存的动物在同一时间。
   5. 把筋疲力尽的老鼠从水中取出, 不要打断别人。干他们的头发, 重新标记他们的数字, 并把他们送回笼子。
   6. 一组完成后, 更换水箱中的水。在所有的老鼠都完成后, 清空泳池, 用乙醇和紫外光清洁和消毒。

4. 模型评估: 中枢神经递质检测

1. 麻醉大鼠腹腔内注射10% 水合氯醛 (3 毫升/千克) 直到昏迷。
2. 斩首老鼠。
3. 沿后内侧线进行纵切口, 打开颅骨两侧, 露出大脑。把头骨翻过来, 把大脑移开, 把大脑放在冰袋上。
4. 分离并除去下丘脑, 它是位于大脑基底中央部分的菱形区域, 与周围组织有明显的边界。把它放在不育的管子里, 用液氮冷冻。把所有的样品都存放在-80 摄氏度的冰箱里。
5. 用高效液相色谱法 (HPLC)⁸测定下丘脑中 DA 和 5 HT 的含量。

结果

我们用 MMPM 描述了一种大鼠中心疲劳模型。24只大鼠随机分为对照组和模型组, 每组12只大鼠。该模型装置设计成一个水箱, 底部有狭窄的平台 (图 1)。模型鼠每天在平台上站立14小时, 包括部分睡眠时间, 21 天 (图 2)。

行为测试是在建模后进行的, 以评估大鼠的情绪和物理变化。通常的结果 (图 3) 表明, 与对照组相比 (n = 10), 在模型大鼠 (n = 10) 的饲养运动和自愿活动的平均速度 (p < 0.05, p < 0.01) 显著下降, 和外环入口的延迟明显增加 (p < 0.01)。该测试 (图 4) 显示, 21...

讨论

MMPM 最初设计为睡眠剥夺⁹。老鼠被发射到水箱里, 平台固定在底部。由于对水的本能的恐惧, 老鼠仍然站在平台上, 没有睡眠发生。研究表明, 不同时间的睡眠剥夺导致大鼠行为和情绪的变化, 包括认知障碍¹⁰, 消极情绪¹¹, 中心疲劳。一些研究人员证明, 采用单平台法 (SPM) 的慢性睡眠剥夺可诱发中枢性疲劳, 并有认知障碍和社会障碍¹²。其他研究表明, 连续几天间歇性剥夺会导致情绪紊乱和中枢性疲劳, 这可以用内啡肽¹³治疗。我们以前的研究证明, 与5天14天相比, 21 天的剥夺导致更多的中枢性疲劳, 而不是与压力相关的情绪障碍¹⁴。MMPM 的许多因素可能导致中枢性疲劳, 包括长时间站立、狭小的遮蔽空间、单调乏味和重复的环境以及缺乏睡眠。睡眠剥夺与中枢性疲劳之间的潜在相关性可能与下丘脑-垂体-肾上腺 (HPA) 轴在不同的水平, 其中单胺类神经递质的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
多平台睡眠剥夺水箱	定制，由北京中医药		110cm x 60cm x 40cm。底部有 15 个塑料小平台。小平台直径 6.5 cm，高 8 cm
Wistar 大鼠	北京威通利华实验动物科技公司	许可证号 SYXK（北京）2016-0011	使用 32 只 Wistar 健康雄性大鼠，8 周龄 （200-210 g）
安捷伦 1100LC 高效液相色谱仪	安捷伦	G1379A， G1311A， G1313A， G1316A	G1379A、G1311A 型色谱泵、G1313A 自动进样器、G1316A 柱温箱
DECADE II SDC 电化学检测器	荷兰 ANTEC 公司		玻碳电极、Ag/AgCl 参比电极、工作站 （Clarity CHS）
Biofuge Stratos 高速冷冻离心机	HERAEUS
VCX130 超声波压裂仪	SONICS
ACS-ZEAS 电子秤	Phos Technology Development，北京。		称量大鼠的体重可精确到 0.1g。
开场箱	定制，由北京中医药		开场木箱  100 cm x 100 cm x 40 cm，内壁和底部为灰色。底部分为 25 个等面积的方格，每个方格为 20cm x 20cm，沿外墙的 16 个格子是外格，其他 9 格子是中央格子。摄像机安装在中间值的上方。
高架Plus-maze	Beijing Zhongshi德创科技发展有限公司		十字架的张开手臂和合拢手臂由 30 厘米 x 5 厘米 x 15 厘米组成，中心区域为 5 厘米 x 5 厘米，中心上方装有摄像头，高 45 厘米。
老鼠游泳桶。	振华生物仪器设备有限公司 安徽，中国		塑料桶的体积为 70cm x 30cm x 110cm，用于大鼠游泳。
测温	世雅仪器有限公司， 常州， 中国.		控制水温
小型水泵	鑫诚科技有限公司， 成都，中国		用于水箱和游泳行为。
Ethovition3.0 行为软件。	Nuldus，荷兰		大鼠行为视频的测量分析。