石蜡包埋细胞块免疫细胞化学法检测培养细胞中蛋白质表达水平

摘要

目前，当需要形态学信息时，固定细胞的免疫荧光染色是确定蛋白质表达水平的首选方法。本文提供的方案介绍了一种针对石蜡包埋细胞块进行免疫细胞化学染色的替代方法。

摘要

当需要同时获取形态学信息时，免疫荧光染色目前是测定细胞培养体系中蛋白质表达水平的首选方法。本文所介绍的针对石蜡包埋细胞块的免疫细胞化学染色方案，是针对非石蜡包埋固定细胞进行免疫荧光染色的一种极佳替代方法。在本方案中，采用凝血活酶-血浆法制备了来源于HeLa细胞的石蜡细胞块，并对两种增殖标志物CKAP2和Ki-67进行了免疫细胞化学检测。HeLa细胞的细胞核与细胞质形态在细胞块切片中均得到了良好保存。同时，免疫细胞化学染色中CKAP2和Ki-67的染色模式与石蜡包埋癌组织中免疫组织化学染色的结果非常相似。通过调整细胞培养条件（包括在无血清条件下对HeLa细胞进行预孵育），可在保留组织结构信息的同时评估相关效应。综上所述，对石蜡包埋细胞块进行免疫细胞化学染色是免疫荧光染色的一种极佳替代方案。

引言

在大多数实验室中，石蜡包埋的细胞块并不常用。相反，在亚细胞定位研究中通常使用固定后的培养细胞，而非石蜡包埋的细胞。对于这些固定的培养细胞，通常采用荧光标记而非显色剂进行检测。因此，免疫荧光染色目前是细胞培养研究中测定蛋白表达水平的首选方法¹。然而，免疫荧光染色所制备的切片只能在免疫荧光显微镜下观察，其成像结果可能与普通光学显微镜下的图像存在显著差异²。此外，免疫荧光染色切片的保存需要避免强光照射，且由于荧光信号的衰减，反复成像会导致荧光信号逐渐减弱³。石蜡包埋细胞块的免疫细胞化学染色结果与石蜡包埋组织的免疫组织化学染色结果非常相似⁴，并且易于转化为临床信息。因此，免疫细胞化学染色可成为一种极佳的替代方法。然而，细胞块制备技术在基础研究实验室中尚未普及。本实验方案旨在提供细胞块制备及免疫细胞化学染色的详细步骤，以促进该方法在细胞培养研究领域的应用。

细胞块制备与免疫细胞化学并非独特的方法，其在临床诊断和基础研究中已有应用^4,5。尽管已有多种细胞块制备方法被报道^4,6，但凝血活酶-血浆法具有操作简便、成本低廉且易于推广的优点。因此，本文所介绍的实验方案采用凝血活酶-血浆法^4,5,6,7,8，用于制备石蜡包埋的细胞块。

本研究展示了制备凝血活酶-血浆细胞块的详细步骤，以及使用两种增殖标志物进行免疫细胞化学检测的方法。其中一种标志物是细胞骨架相关蛋白2（CKAP2），最近被报道为有丝分裂标志物^9,10,11；另一种为Ki-67，是最广为人知的增殖标志物¹²。代表性方案见图1。

方案

本研究方案已获得韩国国家癌症中心机构审查委员会（NCCNCS-12-630）的批准。

1. 样品制备（30 分钟）

1. 培养HeLa细胞（CCL-2，ATCC）时，在100 mm培养皿中加入10 mL完全DMEM培养基（含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素）。为制备血清饥饿的HeLa细胞，按照先前研究所述¹¹，将汇合的HeLa细胞在不含胎牛血清的DMEM中孵育48小时。
2. 为使细胞脱落，先用2 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，然后每100 mm培养皿加入2 mL 0.25% EDTA胰蛋白酶溶液，于37 °C的CO₂培养箱中孵育2–3分钟。
3. 向培养皿中加入5 mL完全DMEM培养基以终止胰酶消化作用，将脱落的细胞转移至15 mL离心管中，随后在300 × g条件下离心10分钟，形成细胞沉淀。
4. 弃去上清液，用2 mL预冷的PBS重悬细胞沉淀，于300 × g离心10分钟，重复洗涤两次。
5. 弃去上清液后，向细胞沉淀中加入1 mL 95%乙醇，通过涡旋振荡使细胞沉淀与乙醇充分混匀。固定后的细胞置于冰上保存，直至进行细胞块制备。

2. 细胞块制备（1小时30分钟）

1. 为制备冻存血浆分装样品，从健康供体血液中收集EDTA抗凝血浆，于13,000 × g离心10分钟。收集上清血浆，将200–400 µL分装至微量离心管中。将分装样品于-80 °C保存至使用。当冻存血浆分装样品准备就绪后，取出并置于37 °C孵育5分钟以融化血浆。
2. 将固定后的细胞于700 × g离心10分钟，弃去上清液。
3. 将细胞沉淀与2滴（约200 µL）血浆、2滴促凝血酶原激酶和2滴0.025 M氯化钙混合，然后通过移液器吹打混匀。
4. 在室温下静置混合物10分钟，使其形成细胞凝块，如图2A所示。随后，用PBS冲洗凝块两次，每次通过移液管加入并吸除PBS。典型的白色细胞凝块如图2B所示。
5. 用福尔马林润湿一片滤纸，将细胞凝块包裹在预先润湿的滤纸中。然后用镊子将凝固的混合物放入组织包埋盒中，如图2C所示。
6. 将组织包埋盒置于含有50 mL缓冲福尔马林（PBS中含10%福尔马林）的玻璃瓶中，在4 °C固定过夜。

3. 组织处理与石蜡包埋（过夜）

1. 将含有福尔马林固定的细胞凝块的组织盒放入组织处理机中过夜处理，操作步骤如前所述¹¹。组织处理的目的是在石蜡包埋前去除水分并对固定后的细胞进行预处理。若研究中无需组织处理，则按照表1所示的组织处理程序进行操作。
2. 打开加热式包埋工作站，60分钟后检查其中金属模具内是否有熔融石蜡（图2D）。
3. 从组织盒中取出已成型的细胞凝块，并将其置于金属模具内的熔融石蜡中。
4. 将未加盖的新组织盒放入金属模具中，使细胞凝块位于熔融石蜡中央，然后向组织盒及金属模具中倒入更多熔融石蜡。接着，将石蜡在冷台上冷却30–60秒，使其凝固。
5. 将组织盒从金属模具中分离。此时，石蜡细胞块已准备好用于免疫细胞化学检测。图2E中的箭头指示了石蜡包埋细胞块中包埋的细胞凝块位置。

4. 免疫细胞化学载玻片的制备（1 小时）

1. 检查石蜡包埋细胞块中细胞凝块的位置，使用切片机将细胞块切成 3 - 4 µm 厚的切片。将石蜡切片置于经硅烷处理的载玻片上，如图 2F所示。
2. 将切片载玻片放入 37 °C 的烘箱中 30 分钟，使切片牢固附着于载玻片上。

5. 细胞块的免疫细胞化学（6 小时）

注意：对于细胞块切片的免疫细胞化学染色，可使用多种试剂盒（参见材料表）。这些试剂盒因修饰方式不同，其灵敏度和特异性也各不相同。

1. 将切片置于 50 mL 二甲苯中孵育 4 分钟，以脱蜡。
2. 将载玻片在 100% 乙醇中孵育 2 分钟进行脱水，随后在 95% 乙醇中孵育两次，再在 80% 乙醇中孵育 2 分钟。然后，用流水冲洗 10 分钟以去除乙醇。
3. 进行抗原修复时，将载玻片放入含有 40 mL Tris-EDTA 修复缓冲液（pH 9.0）的容器中，在加热设备中煮沸 30 分钟。
4. 用流水冲洗载玻片，然后在 4 °C 条件下用 95% 乙醇孵育 10 分钟。随后，使用 Pap 笔在载玻片上标记细胞染色区域，以便于识别。
5. 在含 0.2% Tween 20 的 Tris 缓冲盐水（TBS-T）中清洗载玻片，并在室温下用过氧化氢阻断剂（见材料表）孵育 15 分钟，以消除残留的过氧化物酶活性。然后，在 TBS-T 中清洗三次，每次 2 分钟。
6. 通过将一抗稀释于蛋白阻断剂中制备稀释抗体溶液（见材料表）。例如，CKAP2 一抗可按 1:100 稀释，Ki-67 抗体可按 1:500 稀释。随后，在每张载玻片上加入 100 µL 稀释后的一抗溶液，室温孵育 1 小时。
7. 在 TBS-T 中清洗五次，每次 2 分钟，然后在避光条件下于室温下用试剂盒中的增强剂孵育 15 分钟。
8. 在 TBS-T 中清洗四次，每次 2 分钟，然后加入 2 滴 HRP 聚合物（辣根过氧化物酶标记的二抗），室温孵育 30 分钟。
9. 在 TBS-T 中清洗五次，每次 2 分钟，然后加入 100 µL 二氨基联苯胺（DAB）溶液（见材料表），孵育 3 分钟。
10. 在 TBS-T 中清洗两次后，加入 100 µL 苏木精溶液（由 100 µL 苏木精与 600 µL 蒸馏水混合而成），孵育 1 分钟。
11. 在 TBS-T 中清洗一次后，依次在 95% 乙醇中孵育 2 分钟，再浸入 95% 乙醇一次，随后浸入 100% 乙醇两次进行脱水。然后，将载玻片置于盛有 40 mL 二甲苯的玻璃瓶中孵育 5 分钟。
12. 待载玻片中的二甲苯完全挥发干燥后，加盖相应的盖玻片。
13. 使用光学显微镜观察染色结果。

结果

在来自石蜡包埋细胞块的苏木精-伊红染色切片中（图3A、B），大多数细胞的细胞核和细胞质结构完整，表明当前实验方案对形态学结构的保存效果良好（图3A）。在免疫细胞化学染色中，如先前报道所述¹⁰，CKAP2 阳性信号出现在凝集的染色质、有丝分裂纺锤体及细胞质中（图4）。Ki-67 染色则如预期出现在细胞核内（图4）。只有那些在凝集染色质中呈现 CKAP2 染色的细胞（见 图4A、B 中箭头所示）为有丝分裂细胞。在完全培养基中孵育后制备的高有丝分裂活性的 HeLa 细胞中，可见大量 CKAP2 阳性细胞（图4A）。相比之下，血清饥饿处理的 HeLa 细胞中 CKAP2 阳性细胞较少（图4B）。大多数高有丝分裂活性的 HeLa 细胞呈 Ki-67 阳性（图4C）。相反，在血清饥饿处理的 HeLa 细胞中，Ki-67 阳性率仍高达约 50%（图4D）。这些结果与先前一项研究的报道高度一致^11，提示 CKAP2 在癌细胞中可能比 Ki-67 更可靠地作为增殖标志物。

在制备不良的细胞块中，细胞核与细胞质分离，从而导致形态学保存效果差。固定细胞在冰箱中孵育时间超过过夜可能导致此类不良结果。另一个重要问题是，尽管细胞形态良好，但免疫细胞化学染色效果不佳。当细胞凝块较小时，该问题更常出现。通常，染色强度不均，如图3B所示；但当细胞凝块较大时，染色不均的可能性显著降低。因此，在本方案中，我们增加了血浆、组织凝血活酶和氯化钙的用量，以形成较大的细胞凝块。

图1：细胞块制备流程图。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 2：石蜡细胞块制备示意图。 （A）试管中的凝血活酶-血浆细胞凝块。（B）经 PBS 洗涤后的 TP 细胞凝块。（C）置于湿润滤纸上的细胞凝块。（D）组织包埋工作站，内含熔融石蜡。金属模具（箭头）盛装熔融石蜡以待凝固。（E）包埋于石蜡中的细胞凝块（箭头），即石蜡包埋细胞块。（F）位于涂覆载玻片中部的薄层石蜡切片。请点击此处查看该图的放大版本。

图 3：细胞块制备及其通过苏木精-伊红染色和免疫染色进行的质量验证。 （A）石蜡包埋细胞块切片中 HeLa 细胞的苏木精-伊红染色图像。（B）制备不良的石蜡包埋细胞块切片在免疫细胞化学中 Ki-67 染色不规则。比例尺分别为（A）100 μm 和（B）200 μm。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：HeLa细胞石蜡包埋细胞块的免疫细胞化学染色。 （A）高有丝分裂活性条件下CKAP2的染色。（B）血清饥饿条件下CKAP2的染色。（C）高有丝分裂活性条件下Ki-67的染色。（D）血清饥饿条件下Ki-67的染色。标尺为100 μm。箭头指示CKAP2阳性细胞。请点击此处查看该图的放大版本。

步骤	步骤序号	溶液	时间/温度
脱水	1	70% 酒精	15 min/RT
	2	80% 酒精	15 min/RT
	3	95% 酒精	15 min/RT
	4	100% 酒精	15 min/RT
透明	1	二甲苯	60 min/4 °C
	2	二甲苯	10 min/RT
	3	二甲苯	10 min/RT
	4	二甲苯	10 min/RT
*RT，室温

表1. 组织处理流程。

讨论

在固定培养细胞上进行免疫荧光染色是目前在保留细胞形态学信息的同时确定蛋白质表达水平的首选方法¹。然而，石蜡包埋细胞块的免疫细胞化学也是一种极佳的替代方法。本实验方案中详细描述了石蜡包埋细胞块的制备及免疫细胞化学的完整操作步骤，我们希望该方法能够促进免疫细胞化学在细胞研究中的应用。

免疫细胞化学相较于免疫荧光染色具有多项优势。免疫荧光染色通常需要使用新鲜培养的细胞，而石蜡包埋的细胞块可在室温下保存数年¹³。此外，利用常规用于人体组织免疫组织化学的相同抗体，可在细胞块上进行免疫细胞化学检测，从而研究细胞内蛋白的表达模式⁴。 Furthermore，通过在不同药物预孵育条件下或不同培养条件下处理细胞，免疫细胞化学还可用于研究蛋白水平或翻译后修饰的变化¹¹。

与免疫细胞化学染色的优点相比，制备石蜡包埋的细胞块耗时较长且成本较高¹⁴。此外，大多数研究实验室缺乏该技术的经验，在此类情况下技术误差较为常见。最常见的问题包括细胞形态保存不良以及石蜡细胞块切片上的免疫细胞化学染色效果差或不均匀。通过在最佳细胞条件下制备细胞块，并使用足量溶液形成细胞凝块，可避免上述及其他大多数问题。

作为本实验方案的示例，制备了HeLa细胞的细胞块，并对两种增殖标志物CKAP2和Ki-67进行了免疫细胞化学染色，方法如前所述¹¹。在免疫细胞化学实验中，通过在含胎牛血清和不含胎牛血清的培养基中孵育细胞，观察血清饥饿处理的影响。这些制备好的石蜡包埋细胞块可用于大量不同抗体的检测，因为仅需每张切片4–5 µm厚的细胞块切片即可制备多张载玻片。因此，可在不同实验条件下，使用多种不同抗体评估其表达模式。CKAP2和Ki-67在癌组织中的免疫染色模式已有报道^9,10,11,12，且免疫细胞化学染色结果易于评估，因其染色模式与免疫组织化学结果高度相似。

总之，石蜡包埋细胞块的免疫细胞化学染色可作为免疫荧光染色的优良替代方法；此外，该方法在基础研究中可简便、可靠地用于细胞系的表达谱分析，同时保留形态学信息。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HeLa 细胞	ATCC	HeLa（ATCC CCL-2
Ki-67 抗体	赛默飞世尔科技	RM-9106-S1
石蜡	Leica	39601006
二甲苯	Fisher Scientific	1330-20-7,100-41-4
乙烯醇	GD Chem	DJ16016
苏木精	安捷伦	10118581
DAB Quanto 试剂盒	赛默飞世尔科技	TA-125-QHDX，QHCX 170405
UltraVision LP 检测试剂盒	赛默飞世尔科技	PBQ141209, LPB141209, LPH141210	免疫细胞化学试剂盒；含蛋白质封闭剂
TintoRetriever 压力锅	Bio SB 公司	BSB 7008
Tris缓冲盐水	iNtRON Biotechnology	IBS-BT008
Tween 20	USB公司	115106
组织因子	Neoplastin Cl Plus	NC0591432
Tris-EDTA 修复缓冲液	诊断生物系统	E625-A
胰蛋白酶EDTA	赛默飞世尔科技	25200056
胎儿 胎牛血清（FBS）	Hyclone 实验室公司	SH30910.03
DMEM	Hyclone 实验室公司	SH30243.01
抗生素-抗真菌素，100X	赛默飞世尔科技	15240062
Ultra vision 过氧化物阻断剂 H2O2	赛默飞世尔科技	02Q141212
封片剂	赛默飞世尔科技	363313
Pap-Pen	Vector Laboratories	H-4000
滤纸	GE Healthcare Life Sciences	1001-0155
氯化钙	Sigma-Aldrich	21115-100ml
磷酸盐缓冲液	PAA Laboratories	H21-002
甲醛	Daejung	50-00-0
15 ml 离心管	SPL Life Sciences	50015
组织处理盒	Simport	M492-5
100 mm 培养皿	BD 生物科学	08-772E
载玻片	Muto Pure Chemicals	140712
盖玻片	Marienfeld	2262817
玻璃 Zar	Hyunil Lab-Mate	HIP-1027
离心	Eppendorf	5810R
II 级层流罩	赛默飞世尔科技	1300 系列 A2
CO2 培养箱	赛默飞世尔科技	A2系列
组织处理仪	Leica BioSystem	TP1020
切片机	赛默飞世尔科技	HM340E
显微镜	Olympus	CX-21
石蜡包埋工作站	赛默飞世尔科技	EC 350-1，EC 350-2
组织切片浴槽（圆形）	细胞迁移路径	HCP-JAW-0100-00AEU
通风橱	Hanyang Scientific Equipment Co. Ltd.	FH-150