方法文章

高灵敏度检测由患者来源结肠肿瘤类器官经GFP慢病毒转导培养后产生的微转移灶

DOI：

10.3791/57374

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2018年6月14日

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1Department of Coloproctological Surgery, Juntendo University Faculty of Medicine, 2Department of Molecular Pathogenesis, Juntendo University Faculty of Medicine, 3Atopy Research Center, Juntendo University Faculty of Medicine, 4Department of Oral Pathobiological Science and Surgery, Tokyo Dental College, 5Department of Gastroenterology, Juntendo University Faculty of Medicine

本文内容

摘要

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为了实现对播散性人结直肠癌（CRC）细胞在组织中定植的高灵敏度检测，本文展示了一种在将PDX来源的CRC类器官细胞注射到受体小鼠之前，高效转导绿色荧光蛋白（GFP）慢病毒颗粒的方案，并通过立体荧光显微镜进行观察。

摘要

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尽管目前在人类结直肠癌（CRC）治疗方面已取得进展，但对于CRC晚期仍缺乏有效的根治性疗法。为应对这一临床挑战，研究人员已开发出多种临床前模型，包括利用长期建立的人源癌细胞系构建的肿瘤异种移植小鼠模型以及多种携带肿瘤的转基因小鼠模型。这些模型可在一定程度上模拟人类癌瘤的特征，但往往无法充分重现人类恶性肿瘤的关键特征，如侵袭和转移。因此，人们一直期待能够更准确反映人类结直肠癌恶性进展的替代模型。

本文展示了通过将患者来源的结直肠癌（CRC）小组织片段经手术分离后皮下植入，从而建立患者来源的肿瘤异种移植模型（PDX）。结肠PDX模型在体内生长，并在组织病理学上与患者原发肿瘤相似。然而，在PDX模型中，常规的远端器官横切面检测仅能发现极少数的自发微转移灶。为了促进对肿瘤向远端器官转移播散的检测，我们从结肠PDX中分离出肿瘤类器官细胞进行体外培养，并在将其注射至重度免疫缺陷的NOD/Shi-scid IL2Rγnull（NOG）小鼠前，用GFP慢病毒进行感染。原位注射的PDX来源CRC类器官细胞在受体小鼠中稳定形成表达GFP的原发性肿瘤。此外，通过荧光显微镜可明显检测到这些小鼠肺组织中出现表达GFP的自发性微转移病灶。此外，经脾内注射CRC类器官细胞可频繁诱导肝脏定植。综上所述，这些结果表明，经GFP标记的PDX来源CRC类器官细胞可在侵袭-转移级联这一多步骤过程中实现可视化检测。本文所述实验方案包括建立人源CRC的PDX模型，以及利用GFP慢病毒颗粒转导相应的CRC类器官细胞并进行三维培养。

引言

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结直肠癌（CRC）是全球癌症相关死亡的第二大原因1。晚期疾病患者对传统疗法反应不足，表明目前尚无法有效根治CRC。为了开发更有效的治疗策略，已建立了多种模拟CRC特征的临床前小鼠模型。由于操作简便且易于处理，多种CRC细胞系已被广泛用于构建肿瘤异种移植模型。然而，长期培养癌细胞系常常导致在特定培养条件下具有较强增殖能力的独特细胞亚群被选择出来，从而造成实验结果不可靠，并在临床前药物研发中带来重要局限性。

未经培养 体外，通过将患者来源的结直肠癌组织经手术切除后植入动物模型，也已建立了患者来源的肿瘤异种移植模型（PDXs）2,3,4PDX 模型被广泛认为能够重现其来源患者肿瘤中的主要组织病理学特征和遗传改变。此外，通过在三维条件下培养，建立了由肿瘤细胞簇组成的患者来源肿瘤类器官，该培养条件高度模拟了原始肿瘤的生物学特性5,6这些肿瘤类器官还被应用于高通量药物筛选，从而有助于设计个体化治疗方案5然而，肿瘤组织内可能存在显著异质性的结直肠癌细胞群体。特定的结直肠癌细胞群....

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方案

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患者提供了书面知情同意书，且本项目已获得顺天堂大学医学院研究伦理委员会的批准。小鼠实验也已获得顺天堂大学医学院动物研究伦理委员会的批准。

1. 在免疫缺陷小鼠中建立结直肠癌PDX模型

建立结直肠癌PDX模型的实验步骤（步骤1）如图1A所示。

  1. 在患者肿瘤手术切除后立即处理原发性结直肠癌组织。
  2. 在50 mL锥形管中，用30 mL冰上预冷的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻振荡洗涤原代结直肠癌组织数次，并将组织置于冰上保存。
  3. 使用无菌镊子将组织置于10 cm培养皿中，用无菌剪刀尽可能彻底地去除坏死区域，并将实体瘤组织剪切成小块（5 × 5 × 5 mm）3 使用无菌剃须刀片按尺寸切割。
    注意：坏死区域通常比周围区域更白、更软且更易碎。
  4. 使用无菌镊子将肿瘤小块置于6孔板中2 mL冰预冷的无菌PBS中。
  5. 在无菌条件下饲养6周龄NOD/Shi-scid IL2Rγ null（NOG）重度免疫缺陷小鼠-无特定病原体-无菌条件
  6. 使用小动物吸入式麻醉装置通过异氟烷吸入麻醉小鼠，并用70%乙醇对皮肤进行消毒。确保呼吸频率和深度正常，且无趾夹反射，以确认麻醉效果充....

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结果

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一名76岁女性患者经手术切除一例原发性结直肠腺癌，病理诊断为中分化，TNM分期为IIIa期，术后接受化疗。免疫组织化学染色显示，原发性结直肠癌细胞对癌胚抗原（carcinoembryonic antigen）、Ki-67、广谱细胞角蛋白（pan-cytokeratin）和E-钙黏蛋白（E-cadherin）呈阳性反应。将切除的肿瘤组织片段皮下植入NOG小鼠，建立结肠癌PDX模型。随后从这些小鼠皮下生长的结肠PDX组织中分离出结直肠癌类器官细胞进行体外培养。该结直肠癌类器官在人工细胞外基质上连续传代过程中能够稳定形成多细胞簇。由于肿瘤类器官在组织学和遗传学特征上能够反映患者原发肿瘤的特性5,6我们尝试建立一种小鼠模型，以实现 体内 在转移扩散过程中以高灵敏度检测结直肠癌类器官细胞。为实现这一目标，将结直肠癌类器官感染GFP慢病毒，从而使几乎所有类器官均呈现强烈的GFP荧光信号（图2A

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讨论

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尽管结直肠癌PDX模型已被广泛用于研究原发性肿瘤的生长，但该模型是否同样适用于肿瘤转移的研究，目前尚未完全阐明。在已报道的多种结肠PDX模型中，肝脏和肺部的自发性转移灶也极难检测到4,10。为了以高灵敏度检测微转移灶，我们建立了一种实验方案：在将PDX来源的结直肠癌类器官进行原位或静脉注射至受体小鼠之前，先将其转导GFP慢病毒颗粒。值得注意的是，我们证实该方法能够高灵敏度地检测到结直肠癌类器官来源的微转移灶，无论其为自发形成还是实验诱导，均可在远端器官中被发现。

实验方案中的关键步骤包括：在传代过程中轻柔吹打结直肠癌类器官，以维持其在人工细胞外基质上完整的球状结构，避免发生失巢凋亡。此外，通过超速离心浓缩制备高滴度的慢病毒颗粒，对于实现结直肠癌类器官接近100%的GFP阳性率也至关重要。 另外，建议在感染后10–14天内将GFP标记的结直肠癌类器官移植至受体小鼠体内。感染后若扩增时间过长，可能会导致GFP表达较弱的类器官被选择性富集。

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披露

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作者无潜在利益冲突需披露。

致谢

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本研究得到了顺天堂大学青年研究者奖（2013年、2014年和2015年）对Y.O.的资助，联合项目奖（2013年和2014年）对K.M.的资助，以及日本文部科学省科学研究费补助金（16K15625资助Y.K.，16K15598资助M.G.）。我们特别感谢结直肠外科与分子病理学系全体成员在讨论和实验技术方面提供的宝贵支持。我们还感谢近野博幸博士（滨松医科大学）、北岛英树博士（国际医疗福祉大学）在小鼠原位移植手术方面提供的慷慨技术指导，以及日野良贤博士（千叶癌症中心）在肿瘤类器官培养技术方面给予的技术建议。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
NOD/Shi-scid IL2Rγ null (NOG) 小鼠日本神奈川中央实验动物研究所在无菌和特定病原体-free条件下饲养6周龄雄性小鼠
伤口夹
2×10 mm		日本Natsume制造公司#C-21-S使用前高压灭菌
Hamilton注射器
针头规格：22号		东京科学，日本用70%乙醇和无菌PBS消毒
6孔板BMBio#92006
12孔板BMBio#92412
15 ml锥形管住友贝克莱特MS-57150
50 ml锥形管住友贝克莱特MS-57500
微量离心管Eppendorf#0030120086使用前高压灭菌
血细胞计数板Erma#03-202-1
40μm细胞筛Corning#352340
Matrigel基底膜基质Corning#354234分装后于-20°C保存。
使用前置于冰上
Ⅰ型胶原酶Sigma#C1030将Ⅰ型胶原酶配制成150 mg/ml的1×PBS溶液。分装后于-20°C保存，可保存长达1年
AccutaseInnovate Cell Technologies#5V2623A4°C保存
含GlutaMAX™的DMEM/F-12培养基Gibco#105650184°C保存。使用前于37°C预热
Cell banker 1plusZENOAQ#6284°C保存。1个月内使用完毕
青霉素Gibco#151401224°C保存。1个月内使用完毕
链霉素Gibco#151401224°C保存。1个月内使用完毕
hEGFPEPROTECH#AF-100-15-20°C保存。当日使用时加入培养基
Y27632（ROCK抑制剂）Wako#253-00591-20°C保存。当日使用时加入培养基
培养基GibcoDMEM/F-12含GlutaMAX™补充剂，并添加5% FBS、100 U/ml青霉素和100 µg/ml链霉素。
4°C保存。1个月内使用完毕。
CRC类器官培养基
含1%或5% FCS		DMEM/F-12含GlutaMAX™补充剂（Gibco #10565018），并添加1%或5% FCS、100 U/ml青霉素、100 µg/ml链霉素、2 ng/ml hEGF和10 µM Y27632（ROCK抑制剂）。
4°C保存。1个月内使用完毕。
FuGENE 6转染试剂Roche11814 443001
Minisart 0.45 µm滤器Sartorius stedim17598-K
5 ml聚丙烯离心管Beckman Coulter326819
PRRL-GFP载体由Robert A. Weinberg博士惠赠
pCMV-VSV-G由Robert A. Weinberg博士惠赠
pCMV-dR8.2 dvpr由Robert A. Weinberg博士惠赠
SW55Ti摆动桶转子Beckman Coulter
蔡司Axioplan 2体视荧光显微镜Zeiss

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Siegel, R., Desantis, C., Jemal, A. Colorectal cancer statistics, 2014. CA Cancer J Clin. 64 (2), 104-117 (2014).
  2. Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 9....

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