Method Article

多路人工细胞微环境阵列的制备

DOI:

10.3791/57377

⸱

September 7th, 2018

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1Institute for Integrated Cell-Material Sciences (WPI-iCeMS), Kyoto University, 2Department of Life Science and Technology, School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology, 3Biomaterials Center for Regenerative Medical Engineering, Foundation for Advancement of International Science, 4Faculty of Science and Natural Resources, Universiti Malaysia Sabah, 5Institute for Chemical Research, Kyoto University, 6Ecole Normale Supérieure

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了用于制备多路人工细胞微环境 (MACME) 阵列的详细方法, 用于对模拟体内细胞微环境的物理和化学线索进行高通量操作, 并用单细胞分析方法确定人类多潜能干细胞 (hPSCs) 的最佳细胞环境。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

细胞微环境由多种线索组成, 如生长因子、细胞外基质和细胞间相互作用。这些线索是精心编排的, 是调节细胞功能在一个生活系统中的关键。虽然许多研究人员试图研究环境因素与所期望的细胞功能之间的相关性, 但仍有许多未知之处在。这主要是由于缺乏一个适当的方法来模仿这种环境线索的体外, 并同时测试不同的环境提示细胞。在这里, 我们报告一个综合平台的微流控通道和碳纤维阵列, 其次是高含量单细胞分析, 以检查干细胞表型改变的不同环境因素。为了证明该平台的应用, 本研究重点研究了自我更新的人多潜能干细胞 (hPSCs) 的表型。在这里, 我们提出了一个碳纤维阵列的准备程序和微流控结构制造的多复用人工细胞微环境 (MACME) 阵列。此外, 还介绍了单细胞分析、多荧光标记细胞染色、多荧光成像和统计分析的总体步骤。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

人类多潜能干细胞 (hPSCs)1,2自我更新无限和分化为各种组织血统, 这可能会革命性的药物开发, 细胞治疗, 组织工程和再生医学3,4,5,6. 然而, 一般文化菜肴和微量滴定板的设计并不是为了在细胞层面上精确的物理和化学细胞操作, 而纳米到微表的范围是细胞扩张的关键因素,自我更新和分化。为了解决这个缺点, 研究已经研究了细胞微环境在调节细胞命运决定和细胞功能方面的作用4。近年来, 越来越多的研究已经进行了重建细胞微环境的体外7,8。纳米和微加工工艺通过化学9、10、11、12、13的操作建立了这些微环境, 14、15、16、17和物理18、19、20环境提示。到目前为止, 还没有报告系统地调查在单个平台内对细胞命运决定和功能的化学和物理环境线索的基本机制。

在这里, 我们引入了一个基于简单设计原则的策略来建立一个健壮的筛选平台 (图 1)。首先, 我们描述了使用碳纤维阵列和微流控结构创建多功能、人工细胞微环境的集成平台的开发过程: 多路人工细胞微环境 (MACME) 阵列(图 1A和2A)。碳纤维阵列在碳纤维材料和密度的不同组合中有12种不同的微环境。静电纺丝是用来制造纳米纤维的。碳纤维材料, 如聚苯乙烯 (PS)21, polymethylglutarimide (PMGI)22, 和明胶 (GT)23, 旨在测试其化学性质, 这可能影响细胞黏附和维护干细胞 (图 2B)。碳纤维密度随静电纺丝时间的改变而变化, 生成的纳米纤维根据其密度 (DNF, D = XLow/低/中/高) 来定义。微流控结构由烷48细胞培养室组成, 可沿96井微板块的标准尺寸定位。是一种生物相容和气体可交换聚合物, 通常用于制造微流控器件24。每个微流控通道设计为700µm 宽和8.4 毫米长, 其边缘有两个入口 (表 1)。分庭有不同的高度 (250, 500 和1000µm) 来操纵初始细胞播种密度 (0.3, 0.6, 1.2 x 10 细胞/厘米 5), 这可能与生存, 增殖和分化的 hPSCs2(图 2C)。进入腔室的细胞数量与室底板上的柱密度成正比, 从而控制了初始细胞播种密度, 并将同一细胞悬浮液引入不同高度的培养室。所有通道的设计是≥ 250-µm-高26 , 以尽量减少低氧张力27和剪切应力28对细胞的影响。通道高度为250、500和1000µm, 这里缩写为 XCD, 分别为 X = 低、中、高。不同碳纤维密度和初始细胞播种密度的环境被缩短为 "Material_NF density_Cell 密度" (如 GT_HighNF_HighCD: 一种以高密度 GT 纳米纤维和高初始细胞播种为特征的环境;密度)。

随后, 我们描述了如何进行单细胞分析, 系统地调查细胞的行为, 以应对环境因素 (图 1B)。作为概念证明, 我们确定了 hPSC 自我更新的最佳细胞环境, 这是 hPSC 维护的关键功能 (图 1B)29。基于图像的细胞术, 其次是统计分析, 允许对细胞环境的个体细胞表型反应进行定量解释。在多种细胞功能中, 本文提供了一个详细的程序来确定保持 hPSC 自我更新的最佳条件。

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. MACME 阵列的制作

注: 所有材料和设备都列在材料表中。

  1. 碳纤维阵列和微流控结构模具的掩模制备
    1. 使用3维计算机图形软件包 (表 1) 创建用于微流控结构的碳纤维阵列和模具的三维 (3D) 掩码图像。
      注:3D 图像由3D 打印机读取和打印。打印的掩码和模具具有与在步骤1.1.1 中使用图形软件定义的3D 图像相同的尺寸。
    2. 使用3D 打印机在这些设计的基础上打印掩码和模具。
      注:在该协议中, 采用了30的 UV 固化树脂喷墨式3D 打印机。打印机分辨率为 635 x 400 dpi 和15µm, 分别为 x、y 和 Z, 但实际 X、y 分辨率约为四倍。
  2. 碳纤维阵列准备 (图 3A)
    1. 为静电纺丝制备聚合物溶液。
      1. 用四氢呋喃稀释 13% PMGI 液体 9% (瓦特/v)22。
      2. 溶解 0.08 g 的 PS (数字平均分子量 (锰): 13万) 在 THF: 甲基酰胺 (1:1 体积比)21, 并添加 THF: 甲基酰胺, 使体积达到最后1毫升 (8% (w/v) PS 解决方案)。
      3. 在水中溶解0.1 克 GT: 乙酸乙酯 (1:1. 6:2. 1 体积比), 加水: 醋酸: 乙酸乙酯, 使体积达到最终1毫升 (10% (w/v) GT 溶液), 如所述23、31。
    2. 使用磁控溅射机, 在聚苯乙烯 (PS) 底板 (127.7 x 85.5 毫米) 上沉积一个 5 nm 厚度的薄铂层, 在静电纺丝装置中充当阴极。
    3. 将每个聚合物溶液装入5毫升的注射器中, 配备23克不锈钢钝针。
    4. 将注射器放在注射器泵上, 并将针头固定在12厘米外, 与静电纺丝装置的收集器分开。
    5. 将注射器针连接至高压电源, 并将其设置为11伏。
    6. 设定泵浦率为0.2 毫升/小时。
    7. 保持温度和湿度在30摄氏度和 < 30% (v/v)。
    8. 在台阶1.2.2 上, 把面罩放在底板上。
    9. 通过改变静电纺丝时间 (例如, 20、60、90和 180s), 在底板上通过具有不同密度的掩孔制造纳米纤维。
    10. 从底板上取下面罩。
      注意.乙醇可以喷洒在静电纺丝 GT 纳米纤维上, 然后去除面罩, 以避免剥离 GT 纳米纤维与面具。
    11. 重复步骤 1.2. 4-1. 2.10 直到完成碳纤维阵列制造。
    12. 将碳纤维阵列放置在干燥中25摄氏度, 以蒸发剩余溶剂。
    13. 交联 GT 纳米纤维与0.2 米 1-乙基 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide 盐酸盐 (EDC) 和 0.2 M n-琥珀 (NHS) 在乙醇在25°c 4 h23。
    14. 用 99.5% (v/v) 乙醇和真空干燥在25摄氏度为16小时冲洗 GT 纳米纤维两次。
  3. 微流控结构的制备 (图 3B)
    1. 混合2克的聚硅烷固化剂和20克的基 (1:10 重量比;前)。24
    2. 将预混合材料倒入步骤1.2 中制造的模具上。
    3. 将预聚硅烷混合物干燥为30分钟。
    4. 在65摄氏度的烤箱中, 以16小时的温度固化预混合料。
  4. MACME 阵列的装配 (图 3B)
    1. 剥离从模具中固化的1.3.4 结构, 用 70% (v/v) 乙醇清洗。
    2. 在该结构的底部处理大气电晕放电32。
      注:在本协议中, 电晕在3层或4次的整个表面上用一个 "方便的" 电晕放电装置排出。用大气电晕放电代替氧等离子体处理, 改变表面粘附。
    3. 快速装配碳纤维阵列的结构。
    4. 烤箱烘烤在 65°C 2 天。

2. 将干细胞加载到 MACME 阵列中

  1. 对于 H9 人类胚胎干细胞 (干细胞) 的常规培养, 保持细胞在异的化学定义培养基 hPSC 维护33补充10µM Y-27632 岩石抑制剂34 (命名 hPSC 培养基) 在35毫米细胞培养用基底膜凝胶基质 (MG) 涂敷的盘子。
  2. 通过细胞每4到7天使用重组胰蛋白酶样蛋白酶。
  3. 用99.5% 乙醇消毒 MACME 阵列, 将其装入腔内10分钟, 然后取出乙醇。重复此步骤3次。
  4. 引进12µL 毫克, 10 µg/毫升及其与受精 (钒氮), 0.1% (w/v) GT 进入控制培养室, 并孵化的商会在37°c 为 1 h 在房间表面涂上它们。
    注:在本协议中, MG、钒氮和 GT 被选作细胞黏附和培养的参考蛋白。由于 MG 和钒氮是用于维持 hPSC 自我更新的标准细胞培养基质, 它们被用作阳性对照;二维 GT 涂层 (2DGT) 或非涂层 (NC) 被用作负控制。
  5. 在 MACME 阵列中引入预热 hPSC 介质。在37摄氏度孵化出30分钟的房间。
  6. 洗 H9 人类胚胎干细胞培养在一个35毫米菜与 DPBS, 添加0.5 毫升的重组胰蛋白酶样蛋白酶的菜肴和孵化37摄氏度1分钟, 并仔细吸入只有上清液混合蛋白酶。
    注:在吸入步骤, 细胞没有分离。
  7. 立即加入 hPSC 培养基, 轻轻地将培养基放在盘子表面上, 反复将细胞分离, 转移到15毫升的锥形管上。
  8. 离心机在 200 x g 的3分钟内吸出上清, 并在预热的 hPSC 培养基中悬浮细胞。
  9. 将细胞悬浮液12µL (1.2 x 106细胞/毫升) 引入每个微流控腔。
    注:使用微将细胞从另一个腔室引入。由于被播种到腔室的细胞数量与室底的柱密度成正比, 即使使用相同细胞悬浮的样品, 初始细胞播种密度也可以控制。确保吹打的完成。加载后, 用棉尖棒从腔内取出多余的介质。MACME 阵列与常用的实验室吸管和自动吸管系统兼容, 不需要任何特殊设备。
  10. 每12小时改变 hPSC 培养基, 培养4天。
    注:介质 (1.6、3.2 和6.4 µL) 的恒定体积通过使用不同大小的分庭来维持。在静态条件下培养细胞, 以最小化剪切应力, 除了细胞培养培养基的交换35,36。

3. 定量单细胞分析

  1. 板上荧光细胞染色
    注:    为了分析自我更新 hPSCs 的表型变化, 本协议选择了该协议的三个关键型式标记: OCT4、5-乙炔 2 '-脱氧尿苷 (教育局) 和蛋白 V, 以测定干细胞、增殖和凋亡的状态。分别 (图 2b)。4 ', 6-diamidino-2-苯基吲哚 (DAPI) 用于识别细胞核。OCT4 是干细胞的关键转录因子之一。
    1. 在 hPSC 培养基 MACME 阵列中孵化 H9 干细胞, 辅以10µM, 37 °c 30 分钟。
    2. 洗后与蛋白结合缓冲 (10 毫米 HEPES (pH 7.4), 140 毫米氯化钠, 2.5 毫米 CaCl2), 染色的细胞与橙色荧光染料-蛋白 V 共轭在20°c 15 分钟。
    3. 固定在 pbs 的细胞与 4% (v/v) 多聚甲醛在20°c 15 分钟, 然后冲洗细胞与 PBS 两次。
    4. Permeabilize 细胞使用 PBS 与 0.3% (v/v) 海卫 X-100 在20°c 16 小时。
      注:多聚甲醛削弱了塑料基板和一个微流控流体结构之间的粘结。因此, 在步骤3.2.1 的阵列上, 也可以在这一步之后执行。
    5. 用红色荧光染料叠氮化物在三基反应缓冲器中孵育细胞, 在20摄氏度时为30分钟。
    6. 孵化细胞在阻塞缓冲 (PBS 与 5% (v/v) 正常山羊血清, 5% (v/v) 正常驴血清, 3% (w/v) 牛血清白蛋白, 0.1% (v/v) Tween-20, 和 0.1% (瓦特/v) n-月桂-β-maltoside) 在4摄氏度为 16 h。
    7. 孵育在 PBS 与 0.5% (v/v) 海卫 X-100 溶液和人 OCT3/4 抗体 (鼠 IgG) 在4°c 为 16 h。
    8. 用绿色荧光染料标记驴抗鼠 IgG (H + L) 在37°c 培养60分钟。
    9. 孵育在 PBS 与 DAPI 在20°c 30 分钟。
    10. 用 pbs 替换 pbs DAPI。
    11. 保持 MACME 阵列在4°c, 直到图像采集。
  2. 图像采集 (图 4)
    1. 剥离 MACME 阵列中的微流体结构。
    2. 从 MACME 阵列中取出残余 PBS, 将 pbs 中的 90% (v/v) 甘油应用于细胞, 并将盖玻片在染色细胞上。
    3. 将板块倒置在倒置荧光显微镜的舞台上。
    4. 使用由显微镜成像软件控制的所有机动组件 (舞台、过滤器、快门和焦点系统) 自动获取12位彩色图像。
      注意.在这个协议中, 曝光时间被调整到接近最大强度值 (最高像素强度: 4096), 但没有饱和度, 对于每个图像, DAPI, OCT4, 蛋白 V 和教育局。
  3. 计算机引导图像处理与荧光信号量化 (图 5)
    注意:    下面的单元格图像分析是根据前面描述的方法37进行的。
    1. 将彩色图像转换为灰度。
    2. 计算每个 DAPI 图像的单个阈值, 并使用 "大津" 方法, 并将在阈值之上的像素分类为背景和前景。确保前景值对应于 DAPI 的荧光强度。
      注:图像分析过程包含5步骤;识别 DAPI 图像中的主要对象, 分别识别 OCT4、蛋白 V 和教育局图像中的次要对象, 以及测量物体的强度。图 3提供了图形用户界面 (GUI) 在图像处理设置上的图像。
    3. 测量每张图像上 OCT4 和教育局的荧光强度。
    4. 用传播方法确定染蛋白 V 的区域, 并量化荧光强度。
  4. 3.4. 单细胞成像中单个细胞表型可视化的统计分析
    1. 通过居中和缩放这些变量, 使每个表型标记的输入荧光强度正常化, 从而赋予它们同等的权重。
    2. 使用用于统计计算和图形的软件环境执行自组织映射 (SOM) 分析, 如以前的研究38、39所述。
      1. 创建25个 SOM 节点, 其中有四个 "码本" 向量, 对应于四个标记、DAPI、蛋白 V 和 OCT4 的荧光强度。
      2. 将每个微环境中的单个细胞分配到一个 "获胜的" (最相似的) 节点, 并绘制为单元格频率, 根据该值, 获胜节点的本书向量使用加权平均更新, 其中权重为学习率 (在这里, 0.05 作为默认值)。
        注:从包含少于1000个单元格的分庭中省略数据, 因为包含几个单元格的数据集没有提供统计上相关的 SOM 结果。
    3. 利用聚类软件40中基于皮尔逊关联的平均联动方法, 对 SOM 节点值进行无监督层次聚类。
    4. 将群集数据呈现到树和热图视图41中。

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MACME 阵列: 设计和制造:结合碳纤维技术, 我们利用微流控细胞培养和筛选技术, 以前使用的确定最佳条件 hPSC 自我更新或分化35,36 (图 1)。这非常适合于建立强健的高通量细胞检测方法, 因为细胞培养室和条件是精确可控和可扩展的42,43,44。在这里, 碳纤维阵列是由一个简单的碳纤维沉积方法, 静电纺丝与 3 d-打印掩模。微流控部分是用3维印刷模制作的, 通过多次试验和误差, 方便地设计了硐室结构。MACME 阵列是结合两个部分和包含48环境, 提供不同的生物物理和生物化学的线索, 通过不同的组合碳纤维 ECMs (3 种碳纤维材料和4不同密度或4控制基质蛋白)...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该协议的第一个筛选方法, 建立一个健全的文化系统, 以维护合格的 hPSCs。首先, 我们描述了如何使用与碳纤维阵列 (MACME 阵列) 集成的微流控设备来准备一个具有不同人工 ECMs 和细胞播种密度的平台。第二, 以定量图像为基础的单细胞分型进行50 , 以评估个别细胞结局和行为改变的独特的生物化学和生物物理特征。在该协议中, 在高初始细胞播种密度条件下, 由 GT 碳纤维和正控 ECM 蛋白组成的环境具有未分化状态的特征;快速增殖45和稳定的 OCT4 表达51。这种观察表明, 与 "细胞细胞外基质" 和 "细胞细胞" 相互作用有关的分子机制会影响 hPSCs 的干细胞。

这个策略可以根据用户的目的进行定制。例如, 通过重新设计微流控结构的形状和模式, 可以为各种实验设置调整单元格操作和吞吐量。作为提高吞吐量的另一条途径, 每个房间的入口和出口位置按照96孔板的微板块标准设计, 由生物分子科学协会标准化;因此, 自动机器人液体分配器...

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Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢京都大学 iCeMS 的 Nakatsuji 教授提供人类 ES 细胞。我们还感谢东京理工大学的圆山教授在使用原子力显微镜方面的支持。日本促进科学学会慷慨提供资金 (jsp; 22350104、23681028、25886006和 24656502);新能源和工业技术发展组织 (尼德) 和泰尔茂生命科学基金会也提供了资金。iCeMS 由日本教育、文化、体育、科学和技术部 (下个) 世界总理国际研究中心倡议支持。这项工作的一部分是由京都大学纳米技术中心和 AIST 纳米处理设施的支持, 在 "纳米技术平台项目" 赞助的日本下个。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
聚苯乙烯 （PS）Sigma#182435平均分子量：290,000，平均锰：130,000
聚甲基戊二酰胺 （PMGI）MicroChemG113113
明胶 （GT）SigmaG2625来自猪皮，A 型
Sylgard 184 有机硅弹性体套件Doe Corning Toray#1064291PDMS 固化剂和有机硅弹性体基是该套件的组件。
OpenSCAD这是一款免费的 3D 计算机图形软件 （http://www.openscad.org/），用于设计微流体设备的模具。
AutoCAD 2014Autodesk这是一款 3D 计算机图形软件 （https://www.autodesk.com/products/autocad/overview），用于设计用于纳米纤维阵列制备的掩模。
3D 打印机、AGILISTA-3000Keyence
UV 固化树脂、AR-M2Keyence这是 Agilista 用于 3D 打印的。
乙酸Sigma#338826≥99.99%
乙酸乙酯Sigma#270989无水物，99.8%
四氢呋喃 （THF）Sigma#401757
MSP-30T真空装置磁控溅射机
Nunc OmniTrayThermo Fisher Scientific#242811这是一个聚苯乙烯底板，在其上创建纳米纤维阵列。该板尺寸通常为 127.7 x 85.5 毫米。
枪式电晕放电机Shinko Electric &仪器CFG-500这个方便的设备用于在协议中的步骤 1.5 "MACME 阵列的组装"中产生电晕以激活 PDMS 层的底面。
5 mL 注射器TerumoSS-05SZ
不锈钢钝针（23 号）Nipro#2166外径和长度分别为 0.6 和 32 毫米。
高压电源TechDempaz
1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺，盐酸盐DojindoW001
N-羟基琥珀酰亚胺Sigma#56480
基质胶 hESC 合格基质康宁#354277该蛋白质在方案中被称为基底膜凝胶基质。
CellAdhere 玻连蛋白，人，溶液STEMCELL Technologies#07004
TeSR-E8STEMCELL Technologies#05940用于维持人 ES 和 iPS 细胞的无饲养层、无异种成分的培养基
Y-27632Wako Pure Chemical Industries#253-00513
TrypLE Express 酶 （1X），酚红Thermo Fisher Scientific#12605028这是一种重组胰蛋白酶样蛋白酶，用于分离贴壁哺乳动物细胞。
Click-iT EdU 成像试剂盒，含 Alexa Fluor 647 叠氮化物、Thermo Fisher ScientificC10086平板荧光染色中对增殖细胞进行荧光标记，按照该试剂盒的产品手册进行。
膜联蛋白 V，Alexa Fluor 594 偶联物Thermo Fisher ScientificA13203
4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI）Thermo Fisher ScientificD1306
Oct-3/4 抗体 （C-10）Santa Cruz Biotechnologysc-5279
驴抗小鼠 IgG H&L （DyLight 488）abcamab96875这是一种用于平板荧光细胞染色的二抗。
ECLIPSE Ti-E尼康这是一款倒置荧光显微镜，配备 CFI Plan Fluor 4×/0.13 NA 物镜（尼康）、CCD 相机（ORCA-R2，滨松）、汞灯（Intensilight，尼康）、XYZ 自动载物台（带编码器的 Ti-S-ER 电动载物台，尼康）和四个荧光通道的滤光片立方体（DAPI、GFP HYQ、TRITC、Cy5;Nikon）
NIS-Elements Advanced ResearchNikon这是一款用于自动图像采集的显微镜成像软件。
CellProfiler，版本 2.1.0这是一款用于细胞图像分析 （http://cellprofiler.org/） 的免费开放软件。
RSOM 分析由该软件的 kohonen 软件包执行。这是免费提供的 （https://www.r-project.org/）。
Cluster 3.0这是开源集群软件 （http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm）。使用此软件执行无监督分层聚类。
Java TreeView此开源软件 （http://jtreeview.sourceforge.net/） 用于将聚类数据可视化为热图和树状图。
H9 人胚胎干细胞WiCell 干细胞库WA09
在

References

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