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方法文章

构建多重人工细胞微环境阵列

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DOI：

10.3791/57377

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2018年9月7日

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1Institute for Integrated Cell-Material Sciences (WPI-iCeMS), Kyoto University, 2Department of Life Science and Technology, School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology, 3Biomaterials Center for Regenerative Medical Engineering, Foundation for Advancement of International Science, 4Faculty of Science and Natural Resources, Universiti Malaysia Sabah, 5Institute for Chemical Research, Kyoto University, 6Ecole Normale Supérieure

本文内容

摘要

本文描述了制备用于高通量操控模拟物理与化学信号的多重人工细胞微环境（MACME）阵列的详细方法 体内 细胞微环境，并利用单细胞分析技术鉴定人类多能干细胞（hPSCs）的最佳细胞环境。

摘要

细胞微环境包含多种信号，例如生长因子、细胞外基质以及细胞间相互作用。这些信号经过精密调控，在活体系统中对细胞功能的调节至关重要。尽管已有许多研究人员尝试探究环境因素与特定细胞功能之间的关联，但目前仍有许多未知之处，这主要是由于缺乏能够有效模拟此类环境信号的适当方法。 体外，同时测试不同环境线索对细胞的影响。本文报道了一种整合了微流控通道与纳米纤维阵列的平台，并结合高内涵单细胞分析，用于研究不同环境因素引起的干细胞表型变化。为展示该平台的应用，本研究聚焦于自我更新的人多能干细胞（hPSCs）的表型。本文介绍了构建多重人工细胞微环境（MACME）阵列过程中纳米纤维阵列和微流控结构的制备步骤。此外，还描述了单细胞分析的整体流程，包括细胞多荧光标记染色、多通道荧光成像及统计学分析等步骤。

引言

人类多能干细胞（hPSCs）1,2 可无限自我更新，并分化为多种组织谱系，有望彻底改变药物开发、细胞治疗、组织工程和再生医学领域3,4,5,6。然而，常规培养皿和微孔板并未设计用于在纳米至微米尺度上实现对细胞水平的精确物理和化学操控，而这一尺度对细胞扩增、自我更新和分化至关重要。为解决这一缺陷，已有研究探讨了细胞微环境在调控细胞命运决定和细胞功能中的作用4。近年来，越来越多的研究致力于在体外重建细胞微环境in vitro7,8。纳米和微米加工技术已通过调控化学9,10,11,12,13,14,15,16,17 和物理18,19,20 环境信号来构建这些微环境。迄今为止，尚无研究在单一平台上系统地探究化学和物理环境信号对细胞命运决定和功能的潜在机制。

本文介绍了一种基于简单设计原则的策略，用于建立一个稳健的筛选平台（图1）。首先，我们描述了通过纳米纤维阵列和微流控结构构建多功能人工细胞微环境的集成化平台的开发流程：多重人工细胞微环境（Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment, MACME）阵列（图1A 和 2A）。该纳米纤维阵列包含12种不同组合的纳米纤维材料和密度所构成的微环境。纳米纤维通过静电纺丝技术制备。所选用的纳米纤维材料包括聚苯乙烯（polystyrene, PS）21、聚甲基戊二酰亚胺（polymethylglutarimide, PMGI）22 和明胶（gelatin, GT）23，旨在测试其化学特性对细胞黏附及多能性维持的潜在影响（图2B）。通过调节静电纺丝时间来改变纳米纤维的密度，并根据其密度将生成的纳米纤维定义为DNF（其中D = XLow/Low/Mid/High）。微流控结构由聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane, PDMS）构成，包含48个细胞培养腔室，可沿96孔微孔板的标准尺寸排列。PDMS是一种生物相容性良好且允许气体交换的聚合物，广泛用于微流控装置的制造24。每个微流控通道设计为700 µm宽、8.4 mm长，两端各有一个进样口（表1）。培养腔室具有不同的高度（250、500 和 1000 µm），以调控初始细胞接种密度（0.3、0.6 和 1.2 × 105 个细胞/cm2），而该密度可能与人多能干细胞（hPSCs）的存活、增殖和分化相关25（图2C）。接种到腔室中的细胞数量与腔室底部上方的柱状密度成正比，因此通过将相同的细胞悬液引入不同高度的培养腔室，即可控制初始细胞接种密度。所有通道的设计高度均 ≥ 250 µm26，以尽量减少低氧张力27 和剪切应力28 对细胞的影响。通道高度250、500 和 1000 µm 分别简称为XCD，其中X = Low、Mid 和 High。具有不同纳米纤维密度和初始细胞接种密度的微环境被简写为 "材料_NF密度_细胞密度"（例如，GT_HighNF_HighCD：指由高密度GT纳米纤维和高初始细胞接种密度构成的微环境）。

随后，我们描述如何进行单细胞分析，以系统研究细胞在环境因素作用下的行为（图1B）。作为概念验证，我们确定了hPSC自我更新的最佳细胞环境，这是维持hPSC的关键功能（图1B）29。基于图像的细胞计数结合统计分析，可对单个细胞在不同细胞环境下的表型响应进行定量解读。在多种细胞功能中，本文提供了详细的实验流程，用于鉴定维持hPSC自我更新的最佳条件。

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方案

1. MACME 阵列的制备

注意：所有材料和设备均列于材料表中。

  1. 纳米纤维阵列掩模制备及微流控结构模具制备
    1. 使用三维计算机图形软件包创建用于纳米纤维阵列的掩模和微流控结构模具的三维（3D）图像表1).
      注意： 3D 图像由3D打印机读取并打印。打印出的掩膜和模具与在步骤1.1.1中使用图形软件定义的3D图像具有相同的尺寸。
    2. 使用3D打印机打印基于这些设计的掩模和模具。
      注意： 在本方案中，使用了一种类似喷墨的3D打印机，并采用可紫外光固化的树脂30打印机分辨率为635 × 400 dpi，X、Y 和 Z 方向分别为15 µm，然而实际的X、Y分辨率大约低四倍。
  2. 纳米纤维阵列制备（图3A)
    1. 制备用于静电纺丝的聚合物溶液。
      1. 将13%的PMGI液体用四氢呋喃按9%（w/v）稀释22.
      2. 将0.08 g聚苯乙烯（数均分子量（Mn）：130,000）溶解于四氢呋喃：二甲基甲酰胺（1:1 体积比）混合溶剂中21，加入四氢呋喃：二甲基甲酰胺使总体积达到最终的1 mL（8% (w/v) PS溶液）。
      3. 将0.1 g GT溶于水:乙酸:乙酸乙酯（1:1.6:2.1，体积比）混合液中，并用水:乙酸:乙酸乙酯（1:1.6:2.1，体积比）定容至1 mL，得到10% (w/v) GT溶液，具体操作如所述23,31.
    2. 使用磁控溅射仪，在聚苯乙烯（PS）基板（127.7 × 85.5 mm）上沉积一层5 nm厚的铂薄膜，该基板在静电纺丝装置中用作阴极。
    3. 将每种聚合物溶液装入配备23-G不锈钢钝头针头的5 mL注射器中。
    4. 将装有针头的注射器放置并固定在静电纺丝装置的收集器前方12 cm处的注射泵上。
    5. 将注射器针头连接至高压电源，并设置电压为11 kV。
    6. 设定泵速为 0.2 mL/h。
    7. 保持温度和湿度为 30 °C 和 < 30%（v/v）
    8. 将口罩置于步骤1.2.2中准备好的基板上。
    9. 通过改变静电纺丝时间（例如 20、60、90 和 180 s），在掩膜不同密度的孔中于基板上制备纳米纤维。
    10. 从基板上取下掩模。
      注意。 在移除掩模前，可将乙醇喷洒在电纺GT纳米纤维上，以避免GT纳米纤维随掩模一同被剥离。
    11. 重复步骤 1.2.4 至 1.2.10，直至完成纳米纤维阵列的制备。
    12. 将纳米纤维阵列置于25 °C的干燥器中16小时，以蒸发残留溶剂。
    13. 在25 °C下，使用0.2 M 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）和0.2 M N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的乙醇溶液对GT纳米纤维交联4小时23.
    14. 用99.5%（v/v）乙醇冲洗GT纳米纤维两次，25 °C真空干燥16 h。
  3. 微流控结构的制备（图3B)
    1. 将2 g PDMS固化剂与20 g PDMS基础剂混合（1:10质量比；预混PDMS）。 24
    2. 将预混的PDMS混合物倒入1.2步中制备的模具中。
    3. 将预混的PDMS混合物置于真空干燥器中脱气30分钟。
    4. 将预混的PDMS混合物在65 °C的烘箱中固化16小时。
  4. MACME阵列的组装（图3B)
    1. 剥离在步骤1.3.4中固化的PDMS结构，并用70%（v/v）乙醇清洗。
    2. 对PDMS结构底面进行大气压电晕放电处理32.
      注意： 在此方案中，电晕放电在一层表面进行3至4次 "便捷的" 电晕放电装置。用大气压电晕放电替代氧等离子体处理，以改变表面粘附性。
    3. 快速组装带有纳米纤维阵列的PDMS结构。
    4. 在65°C下烘烤2天。

2. 将hESCs加载至MACME阵列

  1. 常规培养 H9 人胚胎干细胞（hESCs）时，将细胞维持在无异源成分的化学成分明确的 hPSC 维持培养基中33，并添加 10 µM Y-27632 ROCK 抑制剂34（称为 hPSC 培养基），培养于经基底膜凝胶基质（MG）包被的 35 mm 细胞培养皿中。
  2. 使用重组类胰蛋白酶每 4 至 7 天传代一次细胞。
  3. 用 99.5% 乙醇对 MACME 阵列进行灭菌处理：将乙醇加入各腔室中孵育 10 分钟，随后去除乙醇；重复此步骤 3 次。
  4. 向对照培养腔室中分别加入 12 µL MG、10 µg/mL 玻连蛋白（VN）和 0.1%（w/v）明胶（GT），在 37 °C 下孵育 1 小时，使蛋白在腔室表面包被。
    注意：在本实验方案中，选择 MG、VN 和 GT 作为细胞黏附与培养的参考蛋白。由于 MG 和 VN 是用于维持 hPSC 自我更新的标准细胞培养基质，因此作为阳性对照；二维 GT 包被（2DGT）或无包被（NC）则作为阴性对照。
  5. 向 MACME 阵列的所有腔室中加入预热的 hPSC 培养基，在 37 °C 下孵育 30 分钟。
  6. 用 DPBS 清洗在 35 mm 培养皿中培养的 H9 hESC，向皿中加入 0.5 mL 重组类胰蛋白酶，在 37 °C 下孵育 1 分钟，然后小心吸除与蛋白酶混合的上清液。
    注意：在吸除步骤中，细胞尚未脱落。
  7. 立即加入 hPSC 培养基，轻轻反复将培养基冲向培养皿表面以解离细胞，并将解离的细胞转移至 15 mL 圆锥形离心管中。
  8. 以 200 × g 离心 3 分钟，吸除上清液，将细胞重悬于预热的 hPSC 培养基中。
  9. 将 12 µL 细胞悬液（1.2 × 106 个细胞/mL）加入每个微流控腔室中。
    注意：使用移液器从一个腔室向另一个腔室加样。由于接种到腔室中的细胞数量与腔室底部上方的液柱密度成正比，因此即使使用同一样品细胞悬液，也可控制初始接种密度。确保移液操作轻柔。加样后用棉签去除腔室中多余的培养基。MACME 阵列兼容常规实验室移液器和自动化移液系统，无需特殊设备。
  10. 每 12 小时更换一次 hPSC 培养基，共培养 4 天。
    注意：通过使用不同尺寸的腔室，可维持恒定的培养基体积（分别为 1.6、3.2 和 6.4 µL）。除更换培养基外，在静态条件下培养细胞，以尽量减少剪切应力35,36。

3. 定量单细胞分析

  1. 平板上的荧光细胞染色
    注意：    为了分析自我更新的人多能干细胞（hPSCs）的表型变化，本方案选择了三个关键的表型标志物：OCT4、5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）和Annexin V，分别用于检测多能性、增殖和凋亡状态（图2b）。4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）用于识别细胞核。OCT4是多能性关键转录因子之一。
    1. 将H9 hESCs在含10 µM EdU炔烃的hPSC培养基中，于MACME阵列上37 °C孵育30分钟。
    2. 用Annexin结合缓冲液（10 mM HEPES（pH 7.4）、140 mM NaCl、2.5 mM CaCl2）洗涤后，于20 °C用橙色荧光染料标记的Annexin V结合物染色15分钟。
    3. 用含4%（v/v）多聚甲醛的PBS在20 °C固定细胞15分钟，然后用PBS漂洗两次。
    4. 使用含0.3%（v/v）Triton X-100的PBS在20 °C透化细胞16小时。
      注意：多聚甲醛会削弱塑料底板与PDMS微流控结构之间的结合力。因此，在步骤3.2.1中PDMS层从阵列上脱落的操作也可在此步骤后立即进行。
    5. 在含红色荧光染料叠氮化物的Tris缓冲反应液中，于20 °C孵育细胞30分钟。
    6. 在封闭缓冲液（PBS含5%（v/v）正常山羊血清、5%（v/v）正常驴血清、3%（w/v）牛血清白蛋白、0.1%（v/v）Tween-20和0.1%（w/v）N-十二烷基-β-D-麦芽糖苷）中，于4 °C孵育16小时。
    7. 在含0.5%（v/v）Triton X-100的PBS中，加入人OCT3/4抗体（小鼠IgG），于4 °C孵育16小时。
    8. 在封闭缓冲液中，加入绿色荧光染料标记的驴抗小鼠IgG（H+L），于37°C孵育60分钟。
    9. 在含DAPI的PBS中，于20 °C孵育30分钟。
    10. 将含DAPI的PBS替换为不含DAPI的PBS。
    11. 将MACME阵列保存于4 °C，直至进行图像采集。
  2. 图像采集（图4）
    1. 将PDMS微流控结构从MACME阵列上剥离。
    2. 去除MACME阵列上的残留PBS，加入含90%（v/v）甘油的PBS覆盖细胞，并在染色后的细胞上加盖盖玻片。
    3. 将培养板倒置放置在倒置荧光显微镜的载物台上。
    4. 使用由显微镜成像软件控制的所有电动组件（载物台、滤光片、快门和聚焦系统）自动采集12位彩色图像。
      注意。 在本方案中，曝光时间经过调整，使每张图像（DAPI、OCT4、Annexin V和EdU）的荧光强度接近最大值（最高像素强度：4096），但不发生饱和。
  3. 计算机辅助图像处理与荧光信号定量（图5）
    注意：    以下细胞图像分析基于先前描述的方法37。
    1. 将彩色图像转换为灰度图像。
    2. 采用Otsu方法为每张DAPI图像计算单一阈值，将高于阈值的像素归类为前景，低于阈值的归类为背景。确保前景值对应于DAPI的荧光强度。
      注意：图像分析过程包含5个步骤：DAPI图像中初级对象的识别，OCT4、Annexin V和EdU图像中次级对象的识别，以及对象强度的测量。图3展示了图像处理设置中图形用户界面（GUI）的图像。
    3. 测量每张图像中OCT4和EdU的荧光强度。
    4. 采用传播法识别Annexin V染色区域，并定量其荧光强度。
  4. 3.4. 统计分析以在单细胞成像中可视化个体细胞表型
    1. 通过对每个表型标志物的输入荧光强度进行中心化和标准化处理，使各变量具有相等权重。
    2. 使用统计计算与图形软件环境进行自组织映射（SOM）分析，方法如先前研究所述38,39。
      1. 创建25个SOM节点，每个节点具有对应于四个标志物（DAPI、EdU、Annexin V和OCT4）荧光强度的独特四维"码本向量"。
      2. 将每个微环境中的单个细胞分配至最相似的"获胜"节点，并以细胞频率形式绘图；根据该节点的码本向量，使用加权平均法进行更新，权重为学习率（默认值为0.05）。
        注意：排除细胞数少于1,000个的腔室数据，因为细胞数量过少的数据集无法提供具有统计学意义的SOM结果。
    3. 使用聚类软件，基于Pearson相关系数，采用平均连接法对SOM节点值进行无监督层次聚类40。
    4. 将聚类结果以树状图和热图形式呈现41。

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结果

MACME阵列：设计与制备： 结合纳米纤维技术，我们采用了此前用于鉴定人多能干细胞（hPSC）自我更新或分化最佳条件的微流控细胞培养与筛选技术35,36（图1）。该方法非常适合建立稳定且高通量的细胞实验体系，因为细胞培养腔室及其环境条件可实现精确控制并易于扩展42,43,44。本研究中，纳米纤维阵列通过一种简单的纳米纤维沉积方法制备，即使用3D打印掩模进行静电纺丝。微流控部分则采用3D打印模具制造，便于通过多次试错快速优化腔室结构设计。MACME阵列由上述两部分组合而成，共包含48种独立环境，通过不同组合提供多样化的生物物理与生化信号刺激，包括纳米纤维细胞外基质（3种纳米纤维材料...

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讨论

本方案展示了首个用于建立稳定培养体系以维持合格人多能干细胞（hPSCs）的筛选方法。首先，我们描述了如何利用集成纳米纤维阵列的微流控装置（即MACME阵列），构建包含多种人工细胞外基质（ECM）和不同细胞接种密度的筛选平台。其次，通过基于定量图像的单细胞表型分析50，评估由不同生化和生物物理特性所改变的单个细胞行为与结果。在本方案中，高初始细胞接种密度条件下，由GT纳米纤维与阳性对照ECM蛋白组成的环境表现出未分化状态的特征：快速增殖45和OCT4表达稳定51。该观察结果表明，与"细胞-细胞外基质"和"细胞-细胞"相互作用相关的分子机制可能影响hPSCs的多能性。

该策略可根据用户需求进行定制。例如，通过重新设计微流控结构的形状和图案，可针对多种实验条件调整细胞操控方式和通量。作为提升通量的另一种方法，每个腔室的进样口和出样口均按照生命分子科学学会标准化的96孔板微孔板标准进行设计，从而可使用自动化液体处理机...

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致谢

我们感谢京都大学iCeMS的N. Nakatsuji教授提供人类胚胎干细胞。我们还感谢东京工业大学的A. Maruyama教授在使用原子力显微镜方面给予的支持。本研究得到了日本学术振兴会（JSPS；项目编号22350104、23681028、25886006和24656502）的慷慨资助；同时也获得了新能源产业技术综合开发机构（NEDO）以及泰尔茂生命科学基金会的资助。世界领先国际研究中心计划（WPI）iCeMS得到了日本文部科学省（MEXT）“世界顶级国际研究中心计划”（WPI）的支持。本工作的部分内容得到了京都大学纳米技术共享平台以及产业技术综合研究所纳米加工设施的支持，上述平台属于日本文部科学省（MEXT）资助的“纳米技术平台项目”。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
聚苯乙烯（PS）Sigma#182435平均 Mw：290,000，平均 Mn：130,000
聚甲基戊二酰亚胺（PMGI）MicroChemG113113
明胶（GT）SigmaG2625来源于猪皮，A型
Sylgard 184 硅胶弹性体试剂盒Dow Corning Toray#1064291该试剂盒包含PDMS固化剂和硅胶弹性体基础组分。
OpenSCAD这是一种免费的三维计算机图形软件（http://www.openscad.org/），用于设计微流控装置的模具。
AutoCAD 2014Autodesk这是一种三维计算机图形软件（https://www.autodesk.com/products/autocad/overview），用于设计纳米纤维阵列制备过程中使用的掩膜。
3D打印机，AGILISTA-3000Keyence
紫外光固化树脂，AR-M2Keyence用于Agilista进行3D打印。
乙酸Sigma#338826≥99.99%
乙酸乙酯Sigma#270989无水，99.8%
四氢呋喃（THF）Sigma#401757
MSP-30TVacuum Device磁控溅射仪
Nunc OmniTrayThermo Fisher Scientific#242811这是一种聚苯乙烯基板，用于构建纳米纤维阵列。该板尺寸通常为127.7 × 85.5 mm。 
枪型电晕放电设备Shinko Electric & InstrumentationCFG-500该便携式设备用于在实验步骤1.5“MACME阵列的组装”中，对PDMS层底面进行电晕活化处理。"Assembly of the MACME arrays" in the protocol.
5 mL 注射器TerumoSS-05SZ
不锈钢钝头针（23号）Nipro#2166外径和长度分别为0.6 mm和32 mm。
高压电源TechDempaz
1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐DojindoW001
N-羟基琥珀酰亚胺Sigma#56480
Matrigel hESC-Qualified MatrixCorning#354277该蛋白在本实验方案中被称为基底膜凝胶基质。
CellAdhere Vitronectin, Human, SolutionSTEMCELL Technologies#07004
TeSR-E8STEMCELL Technologies#05940一种无饲养层、无异源成分的人胚胎干细胞和诱导多能干细胞维持培养基
Y-27632Wako Pure Chemical Industries#253-00513
TrypLE Express 酶（1X），含酚红Thermo Fisher Scientific#12605028这是一种用于解离贴壁哺乳动物细胞的重组类胰蛋白酶蛋白酶。
Click-iT EdU成像试剂盒（含Alexa Fluor 647叠氮化物）Thermo Fisher ScientificC10086在培养板上的荧光染色中，增殖细胞的荧光标记按照该试剂盒的产品说明书进行。
Annexin V，Alexa Fluor 594偶联物Thermo Fisher ScientificA13203
4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）Thermo Fisher ScientificD1306
Oct-3/4 抗体（C-10）Santa Cruz Biotechnologysc-5279
驴抗小鼠IgG H&L（DyLight 488）abcamab96875该二抗用于培养板上的荧光细胞染色。
ECLIPSE Ti-ENikon这是一台倒置荧光显微镜，配备CFI Plan Fluor 4×/0.13 N.A.物镜（Nikon）、CCD相机（ORCA-R2，Hamamatsu）、汞灯（Intensilight，Nikon）、XYZ自动载物台（Ti-S-ER电动编码载物台，Nikon）以及四个荧光通道的滤光片组（DAPI、GFP HYQ、TRITC、Cy5；Nikon）
NIS-Elements Advanced ResearchNikon该显微镜成像软件用于自动图像采集。
CellProfiler，版本2.1.0这是一种用于细胞图像分析的免费开源软件（http://cellprofiler.org/）。
RSOM分析通过该软件的kohonen包完成。该软件可免费获取（https://www.r-project.org/）。
Cluster 3.0这是一种开源聚类软件（http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm），用于执行无监督层次聚类。
Java TreeView该开源软件（http://jtreeview.sourceforge.net/）用于将聚类数据以热图和树状图形式可视化。
H9人胚胎干细胞WiCell Stem Cell BankWA09

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