方法文章

腺相关病毒介导的脊髓遗传学定义神经元中转基因表达

18K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/57382

⸱

2018年5月12日

 ,  ,  , 
1Institute of Pharmacology and Toxicology, University of Zurich, 2Institute of Pharmaceutical Sciences, Swiss Federal Institute (ETH) Zurich

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

通过注射依赖重组酶的重组腺相关病毒（rAAV）可操控脊髓中任意基因标记的细胞类型。本文介绍如何转导腰段脊髓背角中的神经元。该技术可实现对被操控神经元亚型的功能性研究。

摘要

脊髓神经元亚群的选择性操控主要通过两种不同方法实现：1）交叉遗传学方法，即构建双转基因或三转基因小鼠，以实现报告基因或效应基因（如来自Rosa26位点的基因）在目标脊髓神经元群体中的特异性表达；2）脊髓内注射Cre依赖型重组腺相关病毒（rAAV），即将编码目标报告基因或效应基因的Cre依赖型rAAV载体注射到特定神经元亚群表达Cre重组酶的小鼠脊髓中。本实验方案详细描述了如何构建Cre依赖型rAAV载体，以及如何利用rAAV转导腰段脊髓L3-L5节段背角的神经元。由于腰段脊髓L3-L5节段由传递后肢感觉信息的外周感觉神经元所支配，因此可通过分析注射侧同侧后肢的自发行为及对感觉测试的反应，来探究被操控神经元在感觉信息处理中的功能。我们提供了该技术用于分析基因定义的脊髓神经元亚群的若干应用实例。相较于传统的报告小鼠诱导的转基因表达，病毒介导的转基因表达在Cre转基因小鼠中的主要优势在于：1）可将编码不同报告蛋白或效应蛋白的多种Cre依赖型rAAV注射至同一种Cre转基因小鼠品系中，从而避免构建多个多重转基因小鼠品系的需要；2）脊髓内注射可将对Cre表达细胞的操控限制在注射部位及注射后的时间范围内。主要缺点包括：1）rAAV介导的报告基因表达存在较大变异性；2）需要通过手术操作来转导目标脊髓神经元。采用上述哪种方法更为合适，取决于所研究的神经元群体及具体科学问题。例如，从Rosa26位点）在目标脊髓神经元亚群中实现特异性表达。2）脊髓内注射Cre依赖性重组腺相关病毒（rAAV）；在此方法中，将编码报告基因或效应基因的Cre依赖性AAV载体注射到在特定神经元亚群中表达Cre重组酶的小鼠脊髓内。本方案描述了如何构建Cre依赖性rAAV载体，以及如何利用rAAV转导腰段脊髓L3-L5节段背角中的神经元。由于腰段脊髓L3-L5节段由传递后肢感觉信息的外周感觉神经元所支配，因此可通过分析注射侧同侧后肢的自发行为及对感觉测试的反应，来探究被操控神经元在感觉信息处理中的功能。我们提供了该技术用于分析遗传学定义的脊髓神经元亚群的若干应用实例。与传统的报告小鼠诱导的转基因表达相比，病毒介导的Cre转基因小鼠中转基因表达的主要优势如下：1）可将编码不同报告蛋白或效应蛋白的多种Cre依赖性rAAV注射至同一种Cre转基因小鼠品系中，从而避免构建多个复杂的转基因小鼠品系。2）脊髓内注射可将对Cre表达细胞的操控限制在注射部位及注射后的时间范围内。主要缺点包括：1）rAAV介导的报告基因表达变异性较大。2）需要通过手术操作来转导目标脊髓神经元。两种方法中哪一种更合适，取决于所研究的神经元群体及具体的科学问题。

引言

脊髓背角在机体外周与大脑之间的信息传递中起着至关重要的作用。热、冷、触觉或有害刺激等感觉信号由特化的外周神经元感知，并将这些信息传递至脊髓背角的神经元。在此处，由抑制性和兴奋性中间神经元构成的复杂网络对感觉信息进行调控，并最终通过脊髓投射神经元将信息传递至脑内高级中枢1，2。脊髓中间神经元和投射神经元所执行的信息整合功能可调控感觉信息的传递，从而决定哪些信息被抑制或以何种强度被传递。感觉刺激整合过程中的改变，例如抑制与兴奋之间平衡的改变，可能导致感觉功能障碍，如痛觉过敏或异常性疼痛（即通常非疼痛性刺激引发的疼痛感）。这些改变被认为是多种慢性疼痛状态的根本原因3，4。因此，脊髓神经环路在感觉信息处理中具有重要意义，进而影响有机体对自身及周围环境的感知。随着分子生物学、遗传学和外科技术的最新发展及其结合应用，研究者现已能够精确操控基因定义的脊髓神经元亚群，从而开始揭示负责不同感觉模态处理的脊髓神经环路基础。

将重组腺相关病毒（rAAV）注射到野生型或转基因小鼠的脊髓中，极大地促进了对特定脊髓神经元亚群功能的操控、分析与理解5,6,7,8,9,10,11。该技术可将标记蛋白（如GFP/GFP融合蛋白）、报告蛋白（如GCaMP）或效应蛋白（如细菌毒素、通道视紫红质或药理遗传受体）以空间受限的方式递送至脊髓神经元。在特定脊髓神经元亚群中表达Cre重组酶的转基因小鼠中，局部注射Cre依赖性rAAV可实现对相应神经元群体的特异性分析。我们已利用该技术对脊髓甘氨酸能神经元进行标记、消融、抑制或激活，证明了它们是控制痛觉和痒觉传递的脊髓门控机制中的关键组成部分7。在这些实验中，向GlyT2::Cre小鼠进行脊髓内注射Cre依赖性rAAV，实现了对腰段脊髓中甘氨酸能神经元的选择性操控，从而避免了同时影响包含对动物生存至关重要的甘氨酸能神经元的脑干以上神经环路。

尽管rAAV的脊髓内注射可将感染限制在注射部位，但病毒转导不仅可能发生在局部神经元中，也可能发生在通过轴突投射连接至注射部位的神经元中。后者常被用于追踪向脑内特定核团提供神经输入的中枢神经系统区域。然而，当需要在特定部位研究明确定义的神经元群体时，轴突投射的感染可能成为一个混杂因素。为解决这些问题，我们近期对多种AAV血清型和表达盒进行了系统性分析，以鉴定出能够最小化或最大化逆向转导的血清型和启动子。在脊髓环路研究的背景下，我们评估了不同血清型和启动子对背根神经节（DRG）、延髓头端腹内侧区（RVM）以及躯体感觉皮层神经元进行逆向转导的能力12。因此，本方案所述技术既可用于分析注射部位的脊髓神经元，也可用于分析向脊髓注射部位提供输入的投射神经元。在本方案中，向腰段脊髓左侧进行三次rAAV注射，以实现对三个腰段（L3-L5）神经元的转导。L3-L5节段接收来自注射侧同侧后肢的大部分感觉输入。我们证明，对L3-L5节段中基因标记的神经元进行功能性操控足以引发显著的行为学变化，从而为这类基因标记神经元亚型的环路功能提供了功能性证据。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所有动物实验均经瑞士州立兽医办公室（苏黎世）批准，并符合所有相关的监管和机构指南。

注意：所有材料及其相应的生产商和/或供应商均列在材料表中。

1. Cre依赖型AAV载体的构建

注意：可购买多种带有不同启动子的 Cre 依赖型载体（参见材料表）；若无法获得所需的表达载体，也可通过改造现有的 AAV 载体来构建。需注意，启动子和血清型可能影响病毒转导的扩散范围（见12）。本方案的第一部分简要描述了两种适用于功能获得和功能缺失实验的 Cre 依赖型 AAV 载体的构建方法。

  1. 药理遗传学激活（功能获得）
    1. 订购 pAAV.hSyn.flex.hM3D(Gq)-mCherry（参见 材料表用于仅由设计药物激活的设计受体（DREADD）介导的激活。
    2. 收到细菌穿刺培养物后，在添加了适当抗生素的LB平板（溶于LB液体培养基中的细菌级琼脂）上划线接种细菌。37℃过夜培养。 °C，并于次日挑取单个菌落。
      注意：含有 AAV 载体基因组的质粒可能不稳定，在扩增过程中病毒基因组可能发生重组，尤其是在病毒反向末端重复序列（ITR）区域内 E. coli建议使用 recA 缺陷型或受抑制的菌株（如 MDS42 或 Stbl3），以避免含有 AAV 基因组的质粒发生重组。
    3. 按照所选DNA-Maxi-试剂盒供应商提供的说明扩增细菌，并使用市售DNA-Maxi-试剂盒制备高质量质粒DNA（例如，参见 材料表). 通过质粒DNA部分样本的限制性酶切，验证质粒DNA的完整性和正确性，以对质粒DNA制备进行质量控制。
      注意：ITR 内含有 SmaI 限制性内切酶的识别位点。在质量控制中应包含 SmaI 消化步骤，以验证 ITR 的完整性。
    4. 将DNA送至病毒载体核心实验室，以制备高质量的重组腺相关病毒（rAAV）。
      注意：高滴度、高质量的病毒制备物对于避免因病毒制备物中存在污染物而导致的混杂表型至关重要。因此，除非实验室已具备成熟的AAV制备技术，我们建议在公认的载体核心设施中制备所需的rAAV。
  2. 消融（功能丧失）
    注意：可使用细菌毒素或毒素受体介导细胞消融或神经元沉默。我们已构建 pAAV.EF1α.flex.DTA 以 Cre 依赖的方式表达白喉毒素片段 A（DTA）。
    1. 要生成一种Cre依赖性病毒载体，需选择一种带有合适启动子的Cre依赖性载体（例如pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP)。扩增所选的编码序列（例如，DTA）通过聚合酶链式反应进行扩增，所用引物的突出端包含AscI和NheI或兼容的限制性内切酶识别位点（见Foster 等7)
    2. 使用标准的分子生物学技术，对载体DNA（pAAV.EF1α）进行限制性酶切消化。α.FLEX.hChR2(H134R)-eYFP) 与PCR扩增的插入片段（NheI-DTA-AscI）分别用限制性内切酶 AscI 和 NheI 进行酶切。连接纯化的片段。
    3. 将连接反应产物按照所选感受态细菌供应商提供的方案转化至合适的细菌中，并将细菌涂布于LB平板上。克隆及后续质粒DNA扩增应使用recA缺陷型或recA抑制型菌株，例如MDS42或Stbl3。
    4. 转化后的第二天，挑取克隆并接种于LB培养基中 在37℃下加入适当的抗生素过夜培养 °C. 第二天，从培养的细菌中提取质粒DNA，通过限制性酶切和测序分析提取的质粒DNA，以验证克隆是否成功。
    5. 扩增高质量的细菌质粒DNA（参见步骤1.1.3）。将扩增后的DNA送至病毒载体核心实验室进行病毒制备。

2. 脊髓细胞的转导

  1. 病毒溶液的制备
    注意：病毒属于感染性试剂，应根据相关指南进行操作。大多数情况下，rAAV可在生物安全一级（BSL1）条件下操作。
    1. 在注射当天，将所需纯化病毒的储存 aliquot 置于冰上解冻，并在注射前始终保持在冰上。避免反复冻融，因为这会降低病毒的有效滴度。
      注：如有必要，解冻后的病毒 aliquot 可在 4 °C 下保存最多 3 天。
    2. 将病毒颗粒稀释于无菌 0.9% NaCl 或磷酸盐缓冲液（PBS）中。
      注：合适的滴度取决于实验目的，需通过实验确定。建议起始总病毒载量为 3×109 基因组拷贝（3.33×1012 GC/mL，注射 3×300 nL）。考虑到过量取样及毛细管装载过程中的损失，每只小鼠约需 2.5 µL 病毒溶液。
  2. 脊髓内注射用微量移液管的制备
    1. 使用微量移液管拉制仪将薄壁玻璃毛细管（外径 1 mm）“拉制”成约 5.5 mm 长、锥度较缓的杆部。使用 3.0 mm 加热丝，并按照 表 1 中所示调整程序 00 的 P(A) 参数。
      注：拉制可提前完成。拉制好的毛细管应存放于密闭容器内的模型黏土上，以防灰尘污染，否则可能堵塞移液管。微量移液管无需高压灭菌。
    2. 使用椎板切除钳将拉制好的毛细管杆部剪至约 4.5 至 5 mm 长，以形成内径为 25–35 μm 的尖端开口。使用带微米刻度的显微镜测量多个微量移液管的内径，以掌握合适的开口大小，或对每个微量移液管逐一测量。
      注：尖端过小可能导致堵塞；过大则可能造成组织损伤，并难以穿透脊髓。
  3. 手术装置与器械的准备
    1. 确保设备清洁并可正常使用。用 70% 乙醇擦拭工作区域进行消毒，并通过高压灭菌或化学消毒对器械进行灭菌。切勿在微量注射器上残留可能损害所用病毒载体的消毒剂。
  4. 动物麻醉及术前准备
    注：手术总时长为 60–90 分钟。
    1. 选择 6 至 10 周龄的小鼠以利于手术操作。
      注：若实验设计需要，也可注射更年轻或更年老的动物。原则上可使用任何品系和两种性别，但在比较不同转基因小鼠品系的行为时应使用相同的背景品系（例如，C57BL/6J）。若预期存在或需研究性别差异，则应将雄性和雌性分组分析。
    2. 使用约 5% 异氟烷诱导麻醉。将动物置于立体定位仪中的加热垫上，并以 1–2.5% 异氟烷维持麻醉（气流速率为 900 mL/min）。在整个手术过程中监测呼吸频率。
    3. 涂抹润滑性眼膏，防止角膜在手术期间干燥。
    4. 剃除动物背部毛发，并用湿纸巾小心清除残留毛发。用碘溶液对剃毛区域皮肤进行消毒，并待其干燥。
    5. 给予镇痛处理（例如，皮下注射 0.1–0.2 mg/kg 布托啡诺）。
  5. 暴露腰段脊髓水平的椎体
    注：由于脊髓与椎体的发育不同步，其对应节段并不对齐，腰段脊髓 L4 节段与胸椎 T13 处于同一水平。
    1. 沿椎体轻轻触诊，定位最尾端的一对肋骨。使用手术刀从最尾端肋骨对稍前方开始，做一条 1.5–2.5 cm 的纵向皮肤切口。
    2. 用镊子提起皮肤，并用剪刀将其与下方肌肉分离。在整个手术过程中，使用无菌 0.9% NaCl 保持暴露组织湿润。
    3. 使用精细镊子和小剪刀，在紧邻中线的下一层薄而膜状的结构上做切口，并将其从棘突上剪除。该层与下方的椎旁肌分离，但附着于棘突。
  6. 腰段脊髓水平椎体的识别
    注：一旦暴露椎体，应可见横突间韧带和背侧棘突。多个解剖标志有助于确定目标椎体（图 1B）。
    1. 将皮肤向尾部方向牵拉，以暴露髂嵴。在同一水平，最尾端可见的一对横突间韧带连接 L6 棘突。从该位置向头侧逆向计数，以识别目标椎体。
    2. 沿椎体触诊。最尾端肋骨对位于 T13 椎体稍前方，而髋部水平的骨盆位于 L6 椎体水平。
    3. 定位沿椎体侧方走行的肌腱最白且最靠内侧的位置。T13 椎体位于该位置稍前方。腰段脊髓 L4 节段即位于此椎体内。
  7. 椎体固定及腰段脊髓暴露
    1. 将动物置于卷起的组织垫上，以抬高至立体定位仪的脊柱夹位置。
    2. 固定目标椎体，以防止因呼吸导致椎体移动。为此，将夹具置于目标椎体两侧，先固定一侧夹具，再用 Adson 镊子夹持椎体的同时固定另一侧夹具。
      注：椎体应垂直于注射平面并牢固固定，确保从上方施压时不发生移动。如有必要，可在椎体上固定第二对夹具。此时，将两对夹具分别固定于目标椎体相邻的两个椎体上较为有利。
    3. 清除目标椎体上方的椎旁肌。使用手术刀在平行于椎体的肌腱内侧做平行切口，并在目标椎体头侧和尾侧做垂直切口。注意不要切得过深。使用咬骨钳撕开或剪除肌肉组织。必要时使用镊子清除附着于椎体或硬膜上方椎间隙内的残留组织。
    4. 在椎间隙处，应可见背侧血管，其标记了脊髓的中线。对于单侧注射，通过在目标侧椎体中部钻孔进行部分椎板切除。使用带有 0.5 mm 球形切头的精细牙科钻具，并在接近脊髓时特别小心地钻孔。使用 26G 斜面针清除残留骨碎片，以暴露脊髓。
    5. 使用 26G 斜面针，在钻孔处以及目标椎体头侧和尾侧的椎间隙内，于背侧血管外侧约 200 µm 处穿破硬膜。脑脊液应从孔中渗出，脊髓轻微膨出。
  8. 注射器的准备
    注：为降低灰尘颗粒堵塞微量移液管的风险，应在注射开始前立即准备注射器。
    1. 使用可拆卸针头压紧套件将玻璃毛细管安装至微量注射器上。拧紧螺母，确保连接紧密牢固。
    2. 用无菌蒸馏水填充微量注射器，并开始推动活塞排出液体。
      注：若阻力过大导致液体无法顺利从尖端流出，则微量移液管可能已堵塞，应更换。
    3. 将注射器安装至连接电子控制微量注射泵的显微操作仪上。注意避免移液管尖端接触任何物体。
    4. 使用微量注射泵吸取约 1 µL 空气，在水和病毒之间形成气泡。
    5. 将 2.5 µL 病毒溶液滴于石蜡膜上，借助立体定位仪小心将微量移液管尖端插入液滴并吸取。然后缓慢推动排出，直至有少量病毒溶液从尖端溢出。
    6. 收回注射器，并用笔在微量移液管上标记刻度，记录病毒液面位置；这有助于监测灌注是否按程序进行。
  9. 脊髓内注射
    1. 将微量移液管尖端移至硬膜上的一个孔上方，然后缓慢下移，直至观察到硬膜出现轻微凹陷。为将注射靶向脊髓背角，以 100 µm 为步长连续下移 500 µm（速度 1 mm/s），然后上移 200 µm，以实现组织的机械稳定。
      注：此时尖端最终深度为 300 µm，但可根据目标区域调整。
      1. 若组织难以穿透，微量移液管可能卡在硬膜上。此时应收回并轻微移动至孔正上方，或再次使用针头正确穿破硬膜后重试穿透。
    2. 设定泵的注射体积为 300 nL，注射速度为 50 nL/min，按下启动按钮开始灌注。
    3. 注射完成后，检查刻度以确认病毒液面是否下降，并将微量移液管原位保留 3 分钟，待压力平衡后再缓慢收回注射器。
    4. 对另外两个注射位点重复步骤 2.9.1–2.9.3。
  10. 缝合与恢复
    1. 移除脊柱夹及小鼠下方的垫子。
    2. 逐层缝合伤口，使用可吸收缝线缝合浅层组织，使用不可吸收缝线缝合皮肤。在缝合伤口上涂抹碘消毒剂。
    3. 停止麻醉，将动物留在加热垫上直至苏醒，然后放回其饲养笼。
  11. 术后护理
    1. 在手术当天、次日以及之后每 2–3 天监测动物健康状况。确保动物步态正常，外观健康（体重、眼睛、毛发和行为），且伤口愈合良好。
    2. 根据需要继续给予镇痛处理（例如，皮下注射 0.1–0.2 mg/kg 布托啡诺），每日三次。

3. 行为学与形态学分析

  1. 行为学分析
    注意：在开始测量前，应让动物在相应实验装置中适应至少30分钟，以使其充分适应新的实验环境。
    1. von Frey 测试
      1. 将动物单独放置于金属网格地板上、大小约为10 cm × 10 cm的独立隔间内。
      2. 用动态 von Frey 纤维刺激注射侧后肢足底表面，记录动物后肢回缩时的刺激力值。
      3. 重复五次，计算每只动物六次测量的平均缩足阈值。
    2. 针刺测试
      1. 将动物分别置于金属网格地板上约10 cm × 10 cm的独立隔间内。
      2. 用钝化的26号针头刺激注射侧后肢足底表面，不穿透皮肤。行为反应评分记为零（无反应）或一（有反应）。
      3. 重复刺激9次，每次刺激间隔3分钟，根据每只动物的10次测量结果计算反应百分比。
    3. 注射 DREADD 配体氯氮平-N-氧化物（CNO）
      1. 将CNO溶于二甲基亚砜（DMSO）中，配制成0.2 mg/的储存液µL，可在室温下保存。
      2. 实验当天，将原液用无菌0.9% NaCl稀释至0.2 µ克/克µL 并注射 10 µ按每克体重给予L，腹腔注射。对照动物注射溶剂（0.2% DMSO溶于0.9% NaCl）。
        注：根据经验，注射后1-3小时可观察到行为学效应的峰值，效应在24小时后应完全消退。在激活甘氨酸能神经元的情况下，观察到的行为包括疼痛和瘙痒反应的减轻。由DREADD介导的神经元激活所诱发的行为取决于所靶向的脊髓神经元亚群。
    4. 注射致痒原以诱导瘙痒
      1. 将瘙痒原溶解于0.9% NaCl中，配制成8 mg/mL（氯喹）或10 mg/mL（组胺）的溶液。在CNO给药后2 h，注射10 µ将瘙痒原或对照溶液皮下注射至与脊髓注射部位同侧的后爪足底表面。或者，将瘙痒原皮内注射至小腿部位，该部位需在注射前一天剃毛，以减少因剃毛本身引起的厌恶行为。
    5. 录像分析自发性伤害性或致痒剂诱导的瘙痒行为
      1. 将动物单独放入透明的隔间（直径约10 cm）中，隔间底部铺有来自其各自原饲养笼的少量垫料。
      2. 录像记录动物5分钟以观察自发行为，以及30分钟以观察致痒剂诱导的行为。离线分析视频，以5分钟为时间段进行分段统计。
    6. 疼痛与瘙痒行为
      1. 观察并记录退缩、舔舐和啃咬行为。
        注意：患处的退缩和舔舐被视为对疼痛的反应，而啃咬则与瘙痒相关。
      2. 以正常速度分析视频，测量小鼠舔舐或咬受影响部位所花费的时间，或以慢动作测量以更精确地区分舔舐与咬反射。或者，可计数舔舐/咬/抽搐发作的次数。
  2. 形态学分析
    1. 在病毒注射后一至三周内或行为学实验结束时进行形态学分析。
      注意：我们在注射后48小时即可检测到eGFP表达，但也发现表达水平在随后的数天甚至数周内显著增加。对于报告基因表达较强的细胞，从脊髓注射到灌注期间孵育一周可能已足够。对于转基因表达较弱的细胞、使用弱启动子的病毒或较弱荧光蛋白的情况，可能需要更长的表达时间以确保达到可检测水平。
    2. 组织固定
      1. 每只小鼠经心脏灌注，首先灌注 20 mL 冰冷的人工脑脊液（ACSF）溶液（NaCl 125 mM，NaHCO₃ 26 mM，葡萄糖 25 mM，蔗糖 10 mM，KCl 2.5 mM，NaH₂PO₄ 1.25 mM，CaCl₂ 0.5 mM，MgCl₂ 7 mM，用 95% O₂ 和 5% CO₂ 饱和）。3 25 mM，NaH2PO4 1.25 mM，D-葡萄糖 20 mM，KCl 2.5 mM，CaCl2 2 mM，MgSO4 1 mM），随后用 100 mL 4% 冰冷多聚甲醛（溶于 0.1 M 磷酸钠缓冲液，pH 7.4）灌注。
        注意：多聚甲醛具有毒性，必须小心操作。
      2. 立即解剖腰段脊髓，并将组织置于冰上用4%多聚甲醛后固定2小时。用0.1 M磷酸钠缓冲液（pH 7.4）短暂漂洗后固定组织，随后在4℃下用25%蔗糖溶液（溶于0.1 M磷酸钠缓冲液，pH 7.4）中孵育过夜。 °C.
      3. 将冷冻保护的组织切成30 μm厚的切片 μ在冷冻切片机上切片，并将切片贴附于载玻片上。
    3. 免疫荧光染色
      1. 在 PBS 中短暂清洗后，加入 300 μ在室温下将切片置于 L 封闭液（含 10% 正常驴血清的 0.3% Triton-PBS）中孵育 1 小时。
      2. 将切片与 300 μ相应一抗组合的 L 量加入封闭液中（参见 材料表）在 4 ℃ 过夜 °C. 用 PBS 洗涤切片，每次 5 分钟，共洗涤 3 次。
      3. 将切片在封闭液中与相应的二抗组合于室温孵育1小时。用PBS洗涤切片，每次5分钟，共洗涤3次。
      4. 用ddH₂O短暂冲洗载玻片2然后使用荧光封片剂封片。
      5. 使用配备20倍和40倍物镜的共聚焦显微镜采集荧光图像。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

为了说明通过脊髓内注射编码标记蛋白的重组腺相关病毒（rAAV）所能达到的表达水平，我们首先将 AAV1.CAG.eGFP 注射至野生型小鼠的腰段脊髓。三次间隔约 1 mm 的注射实现了腰段脊髓节段 L3 至 L5 的近乎连续的感染（图1A- C）。病毒注射深度为 300 µm 从脊髓表面感染主要导致脊髓背角细胞的感染。然而，也可在腹角观察到被感染的细胞。图1D。接下来，旨在展示将Cre依赖性rAAV注射到Cre转基因小鼠中时，rAAV介导的表达差异。因此，我们将Cre依赖性AAV1.CAG.flex.eGFP载体注射至GlyT2::Cre转基因小鼠的脊髓中。与之前类似，观察到eGFP在背角和腹角均有表达。然而，正如预期，eGFP的表达范围更加局限，反映了GlyT2+神经元的分布特征。 即 浅层背角中相对稀疏的表达和深层背角中的密集表达（图1E)...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

脊髓内注射 AAV 可能成为研究实验室中一种强大的技术，能够以高时空分辨率分析脊髓细胞。本方案可实现对感觉神经元外周轴突投射至后肢所支配的三个主要脊髓节段的转导。对三个节段进行转导可产生稳健且可重复的行为学数据，同时相比单次脊髓内注射，能够检测更大的感觉区域。例如，相同的注射方案可用于检测足爪（von Frey、Hargreaves、 等等。）以及大腿部位（皮内注射，机械感受器刺激），从而扩展了可研究的感觉模式。

关键步骤：

要获得可靠的形态学和行为学数据并避免人为假象，有几个关键步骤需要注意。病毒载体的设计、启动子和血清型的选择会显著影响转导效率及转导区域的范围，从而影响行为学结果（有关病毒扩散和转导效率的详细信息，请参见12）。需要高质量的病毒制剂，以尽量减少病毒注射可能引起的副作用，若病毒溶液中存在污染物或细胞碎片，则可能引发此类副作用。注射脊髓所需的手术必须谨慎进行，以避免手术本身引入形态学或行为学的人为假象。在操作脊髓...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢Hanns Ulrich Zeilhofer对本工作的大力支持。Hendrik Wildner获得了Olga Mayenfisch基金会的资助。感谢Carmen Birchmeier提供Lmx1b抗体。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
设备
微移液管拉制仪：DMZ-Universal-Electrode-PullerZeitzNA
麻醉装置：Oxymat3 氧气浓缩器WeinmannNA
麻醉机：VIP 3000 兽用蒸发器MidmarkNA
加热垫：Mio Star Thermocare 100Migros717614700000
电动剃须刀飞利浦BT9290
手术显微镜（OPMI pico）蔡司NA
小型动物立体定位仪KopfNA
Neurostar StereoDrive（可选）NeurostarNA
Model 51690 Cunningham 小鼠脊髓适配器哈佛仪器72-4811
PHD Ultra 微量注射泵与纳米泵哈佛仪器70-3601
Hamilton 701 RN 10 μl 玻璃微量注射器Hamilton7635-01
Hamilton 可拆卸针头（RN）压缩接头 1 mmHamilton55750-01
精细牙科钻孔设备：Osada Success 40OsadaOS-40
球形切割器，0.5 mmBusch12001005B
电子 von Frey 麻醉计IITC23905
可弯曲的冯弗雷毛发IITC#7
LSM710 Pascal 共聚焦显微镜蔡司NA
0.8 NA × 20倍平场复消色差物镜蔡司NA
1.3 未适用 × 40倍EC Plan-Neofluar油浸物镜蔡司NA
名称公司目录编号评论
手术工具
手术刀柄 #4，13 cm精细科学工具10004-13
超精细波恩剪刀精细科学工具14084-08
Adson镊子，1×2齿，12 cm精细科学工具11027-12
Friedman-Pearson 咬骨钳，弯型，0.7 mm 杯状头精细科学工具16121-14
Dumont #2 脊椎切除镊精细科学工具11223-20
Olsen-Hegar 持针器，带锯齿，夹持长度 8.5 mm精细科学工具12002-12
精细镊子 #5精细科学工具11254-20
名称公司目录编号评论
耗材与化学品
薄壁玻璃毛细管，外径1 mmWorld Precision InstrumentsTW 100-3
注射器（1、5 和 20 ml）B. Braun(9166917V, 4606051V, 4606205V)
26G 斜面针头B. Braun4665457
无菌手术刀片B. BraunBB523
外科缝线 Safil Quick+ 4/0，可吸收B. BraunC1046220
外科缝合线 Premilene 5/0，不可吸收B. BraunC0932191
无菌 PBS 或生理盐水（0.9%）NA
70% 乙醇（消毒剂）NA
碘溶液（例如 Braunol）B. Braun18380
麻醉剂（例如 Attane 异氟烷）普罗维特2222
Aldasorber普罗维特333526
镇痛药（例如，丁丙诺啡：Temgesic）IndiviorGTIN：7680419310018
眼科软膏（例如 vita-pos）医药与临床研究GTIN：4031626710635
棉签（例如来自）IVF Hartmann1628100
面巾纸（例如来自）Uehlinger AG2015.10018
Superfrost plus 显微镜载玻片赛默飞世尔科技J1800AMNZ
名称公司目录编号评论
小鼠
C57BL/6J 小鼠（野生型）杰克逊实验室RRID:IMSR_JAX:000664
Rorbtm1.1(cre)Hze/J 小鼠（RORβCre杰克逊实验室RRID:IMSR_JAX:023526
Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J 小鼠（R26Tom）杰克逊实验室RRID: IMSR_JAX:007914
名称公司目录编号评论
病毒载体
AAV1.CB7.CI.eGFP.WPRE.rBG（AAV1.CAG.eGFP）Penn Vector CoreAV-1-PV1963
AAV1.CAG.flex.eGFP.WPRE.bGH（AAV1.CAG.flex.eGFP）Penn Vector CoreAV-1-ALL854
AAV1.CAG.flex.tdTomato.WPRE
.bGH (AAV1.CAG.flex.tdTomato)		Penn Vector CoreAV-1-ALL864
AAV1.EF1a.flex.DTA.hGH（AAV1.EF1a.flex.DTA）Penn Vector Core定制生产
AAV1.hSyn.DIO.hM3D(Gq)-mCherry.hGH（AAV.flex.hM3D(Gi)）Penn Vector Core定制生产
名称公司目录编号评论
质粒
pAAV.hSyn.flex.hM3D(Gq)-mCherryAddgene44361
pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFPAddgene20298
名称公司目录编号评论
细菌
MDS42ScarabGenomics
Stbl3赛默飞世尔科技C737303
名称公司目录编号评论
试剂
内毒素清除型质粒大量提取试剂盒Quiagen12362
NucleoBond PC 500Machery & Nagel740574
氯氮平-N-氧化物（CNO）Enzo Life SciencesBBL-NS105-0025
氯喹二磷酸盐SigmaC6628
组胺SigmaH7125
DAPIInvitrogenD3571
名称公司目录编号评论
抗体（稀释度）
兔抗 GFP 抗体（1:1000）分子探针RRID:AB_221570
兔抗 NeuN（1:3000）AbcamRRID:AB_10711153
山羊抗 Pax2（1 : 200）R & D SystemsRRID:AB_10889828
豚鼠抗 Lmx1b（1 : 10 000）Dr Carmen BirchmeierMuller 等，2002
兔抗 GFAP（1 : 1000）DakoCytomationRRID:AB_10013382
驴源二抗（1:800）杰克逊免疫研究实验室NA

参考文献

  1. Goulding, M., Bourane, S., Garcia-Campmany, L., Dalet, A., Koch, S. Inhibition downunder: an update from the spinal cord. Curr Opin Neurobiol. 26, 161-166 (2014).
  2. Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nat Rev Neurosci. 11 (12), 823-836 (2010).
  3. Sandkuhler, J. Models and mechanisms of hyperalgesia and allodynia. Physiol Rev. 89 (2), 707-758 (2009).
  4. Zeilhofer, H. U., Wildner, H., Yevenes, G. E. Fast synaptic inhibition in spinal sensory processing and pain control. Physiol Rev. 92 (1), 193-235 (2012).
  5. Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit. Nature. 508 (7496), 357-363 (2014).
  6. Cui, L., et al. Identification of Early RET+ Deep Dorsal Spinal Cord Interneurons in Gating Pain. Neuron. 91 (6), 1413(2016).
  7. Foster, E., et al. Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch. Neuron. 85 (6), 1289-1304 (2015).
  8. Francois, A., et al. A Brainstem-Spinal Cord Inhibitory Circuit for Mechanical Pain Modulation by GABA and Enkephalins. Neuron. 93 (4), 822-839 (2017).
  9. Peirs, C., et al. Dorsal Horn Circuits for Persistent Mechanical Pain. Neuron. 87 (4), 797-812 (2015).
  10. Petitjean, H., et al. Dorsal Horn Parvalbumin Neurons Are Gate-Keepers of Touch-Evoked Pain after Nerve Injury. Cell Rep. 13 (6), 1246-1257 (2015).
  11. Zhang, Y., et al. Identifying local and descending inputs for primary sensory neurons. J Clin Invest. 125 (10), 3782-3794 (2015).
  12. Haenraets, K., et al. Spinal nociceptive circuit analysis with recombinant adeno-associated viruses: the impact of serotypes and promoters. J Neurochem. , (2017).
  13. Abraira, V. E., et al. The Cellular and Synaptic Architecture of the Mechanosensory Dorsal Horn. Cell. 168 (1-2), 295-310 (2017).
  14. Wildner, H., et al. Genome-wide expression analysis of Ptf1a- and Ascl1-deficient mice reveals new markers for distinct dorsal horn interneuron populations contributing to nociceptive reflex plasticity. J Neurosci. 33 (17), 7299-7307 (2013).
  15. Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. J Vis Exp. (73), e50313(2013).
  16. Kohro, Y., et al. A new minimally-invasive method for microinjection into the mouse spinal dorsal horn. Sci Rep. 5, 14306(2015).
  17. Bourane, S., et al. Gate control of mechanical itch by a subpopulation of spinal cord interneurons. Science. 350 (6260), 550-554 (2015).
  18. Bourane, S., et al. Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control. Cell. 160 (3), 503-515 (2015).
  19. Duan, B., et al. Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain. Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).
  20. Gutierrez-Mecinas, M., et al. Preprotachykinin A is expressed by a distinct population of excitatory neurons in the mouse superficial spinal dorsal horn including cells that respond to noxious and pruritic stimuli. Pain. 158 (3), 440-456 (2017).
  21. Awatramani, R., Soriano, P., Rodriguez, C., Mai, J. J., Dymecki, S. M. Cryptic boundaries in roof plate and choroid plexus identified by intersectional gene activation. Nat Genet. 35 (1), 70-75 (2003).
  22. Kim, J. C., et al. Linking genetically defined neurons to behavior through a broadly applicable silencing allele. Neuron. 63 (3), 305-315 (2009).
  23. Kim, J. C., Dymecki, S. M. Genetic fate-mapping approaches: new means to explore the embryonic origins of the cochlear nucleus. Methods Mol Biol. 493, 65-85 (2009).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

Cre GlyT2 Cre

相关文章