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方法文章

RNA干扰的实际应用：利用脂质体载体口服递送双链RNA至蟑螂

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DOI：

10.3791/57385

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2018年5月1日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology, National Taiwan University, 2Biology Centre, Institute of Entomology, Czech Academy of Sciences, 3Faculty of Science, University of South Bohemia, 4Institute of Evolutionary Biology, CSIC-UPF

本文内容

摘要

本论文通过口服摄入包裹在脂质体中的双链RNA，展示了德国小蠊中肠基因表达的耗竭。

摘要

RNA干扰（RNAi）已广泛应用于揭示众多基因的生物学功能，并被视为一种通过破坏必需基因表达来实现害虫控制的工具。尽管已有不同方法（如注射、饲喂和浸泡）被报道可成功递送双链RNA（dsRNA），但通过口服途径递送dsRNA的RNAi效率在不同昆虫类群中差异显著。德国小蠊（Blattella germanica）对dsRNA注射具有高度敏感性，此前已有多项研究证实了这一点。本研究描述了一种方法，证明使用脂质体载体包裹的dsRNA足以延缓中肠液对dsRNA的降解。值得注意的是，持续饲喂脂质体包裹的dsRNA可显著降低中肠中微管蛋白的表达，并导致蟑螂死亡。综上所述，利用可保护dsRNA免受核酸酶降解的dsRNA脂质复合物（lipoplexes），可能是未来RNAi在害虫防控中实际应用的一种可行策略。

引言

RNAi 已被证明是一种有效的基因表达敲低方法，其机制是通过双链 RNA（dsRNA）分子在许多真核生物中触发转录后沉默通路1。在过去十年的研究中，RNAi 已成为研究基因功能的有用工具，可通过注射和/或喂食 dsRNA 的方式，在多种昆虫分类群中实现特定基因表达的耗竭，从而研究基因在发育到行为等方面的功能2,3。由于其靶向特异性强且基因耗竭效果显著，RNAi 的应用目前正被考虑作为一种潜在的害虫防控管理策略4,5。然而，RNAi 的效率在不同昆虫物种之间差异显著，这取决于靶向的基因种类以及递送方法。越来越多的证据表明，dsRNA 的不稳定性（由核糖核酸酶降解所致）是导致 RNAi 效率受限的关键因素5,6。例如，烟草天蛾（Manduca sexta）中 RNAi 敏感性较低的原因在于，dsRNA 与血淋巴混合后在1小时内即被迅速降解7。类似地，中肠中存在的碱性核酸酶能够高效降解摄入的 dsRNA，这与多个昆虫目中 RNAi 效率低下密切相关8,9,10。

口服递送dsRNA在RNA干扰（RNAi）用于害虫防治策略中具有重要意义，但目前尚未开发出能够延缓dsRNA在中肠核酸酶作用下降解的方法，而此类方法有望确保通过摄食实现有效的RNAi效应。然而，已有研究报道，通过喂食大量dsRNA后，RNAi并未产生应答。 例如 50 µg Bombyx mori，或在蝗虫物种中连续饲喂8天（总共8 µg dsRNA）。德国小蠊， Blattella germanica对通过注射dsRNA进行的RNAi具有高度敏感性11,12,13,14，但通过摄食对dsRNA无响应。最近，Lin 等 (2017) 已证明，使用脂质体载体包裹的dsRNA可成功实现RNA干扰，从而敲低目标基因 α-tubulin 中肠基因表达及引发德国小蠊显著死亡率15由于dsRNA在中肠中的降解是口服RNA干扰的限制因素，脂质体载体可作为保护dsRNA免于降解的运载工具，该方法也适用于肠道核酸酶活性较强的其他昆虫。值得注意的是，选择特定转染试剂的原因（见 材料表）我们在本方案中用作脂质体载体的优势在于，根据制造商的说明，该脂质体在昆虫细胞系转染中经过测试，具有较低的细胞毒性。根据Gharavi对不同脂质体转染系统的比较研究 等 (2013)16，该系统与其它已用于其他昆虫dsRNA递送的商业化系统相比，转染小干扰RNA（siRNA）的效率大致相同17,18此外，我们的饲喂方法能够精确确保每只蟑螂摄入适量的dsRNA，并且实验结果可靠且经过验证。总之，本研究的方案和结果表明，使用dsRNA脂质复合物可提高dsRNA的稳定性，为设计RNA干扰的口服递送策略提供了可能，这一方法在未来害虫防控中具有广阔的应用前景。

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方案

1. 双链RNA的合成与制备

  1. 在目标基因的3'非翻译区中确定dsRNA靶向位点。dsTub用于靶向α-微管蛋白（tub）基因（GenBank登录号：KX228233），dsEGFP作为阴性dsRNA对照，设计自增强型绿色荧光蛋白（EGFP；GenBank登录号：LC311024）的序列。
  2. 使用含有T7启动子序列（5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'）的基因特异性引物进行标准PCR扩增，以合成dsRNA模板。PCR扩增条件和引物信息参见Lin et al. (2017)12（见材料表）。
  3. 使用T7转录试剂盒（见材料表）并按照制造商说明书进行dsRNA制备。
    注意：为获得高产量dsRNA，将两个反应混合于同一管中（总体积40 µL），37 °C孵育过夜。
  4. 向dsRNA样品中加入2 µL DNase（见材料表），37 °C孵育15分钟，以消化DNA模板。
  5. 加入200 µL提取试剂（见材料表）和40 µL氯仿，涡旋混匀。
  6. 4 °C下以13,000 x g离心10分钟，收集上清液（150 µL）至新的微量离心管中。
  7. 加入150 µL异丙醇，冰上孵育15分钟，沉淀dsRNA。
  8. 4 °C下以13,000 x g离心15分钟，弃去上清液。
  9. 加入200 µL 70%乙醇洗涤dsRNA沉淀。4 °C下以13,000 x g离心10分钟。
  10. 弃去乙醇，并重复乙醇洗涤步骤。
  11. 弃去乙醇后，使用离心真空浓缩仪干燥dsRNA沉淀3分钟，然后用无RNase水重悬dsRNA。
  12. 使用微量紫外-可见分光光度计（见材料表）按照制造商说明书测定纯化后dsRNA的浓度，并调整至所需浓度（例如，制备dsRNA脂复合物时为0.25 µg/µL）。
  13. 将dsRNA样品于-20 °C保存，最长可保存3个月。

2. 双链RNA脂质复合物的制备

  1. 将4 µL转染试剂（参见材料表）加入4 µL 5%葡萄糖溶液中进行稀释。将4 µL双链RNA（1 µg）加入4 µL 5%葡萄糖溶液中进行稀释。
  2. 立即将稀释后的脂质体试剂溶液一次性全部加入稀释后的dsRNA溶液中。短暂涡旋混匀，然后在25 °C下孵育15分钟。
    注意：切勿以相反顺序混合溶液。
  3. dsRNA脂复合物现已可使用。配制后1小时内使用，超过1小时后弃用。
    注意：根据生产商说明书，脂复合物应尽快使用。

3. 蚕血淋巴和中肠液中外源酶的收集

  1. 昆虫生理盐水缓冲液（10x） 储备液
    1. 将900 mL双蒸水与109.3 g NaCl、15.7 g KCl、6.3 g CaCl混合2，以及 8.3 g MgCl2·6H2O.
    2. 调节pH至6.8，并加水定容至1,000 mL。
  2. 血淋巴采集
    1. 将蟑螂置于冰上麻醉，直至其静止不动达3分钟。
    2. 用两根手指（拇指和食指）握住蟑螂，将其腹面朝上。
    3. 使用解剖剪剪下后肢基节的末端。
      注意： 切断基节与转节之间的连接处。切除基节的其他部分收集血淋巴的效率较低。
    4. 用中指轻轻挤压腹部，用10 µL微量移液器收集从切口流出的血淋巴。
    5. 将多只蟑螂（5只个体）的血淋巴收集至微量离心管中。
      注意： 将微量离心管置于冰上以防止黑色素化。从一只雄性蟑螂获得的血淋巴平均体积为 2 - 3 µL。
    6. 用台式离心机将血淋巴短暂离心10秒。
    7. 转移所需体积的血淋巴（即，10 µL），与50 µL的1x混合 昆虫生理盐水缓冲液
    8. 在 4 °C 条件下，以 1,000 x g 离心 10 分钟，使血细胞沉淀。将上清液转移至新的洁净微量离心管中。
    9. 使用微量紫外-可见分光光度计通过测量A280来定量总蛋白浓度15.
    10. 将每个样品调整至相同的蛋白浓度（总蛋白浓度为 6 mg/µL）。
  3. 中肠汁液采集
    1. 将蟑螂置于冰上麻醉。用冰冷的1x溶液将蟑螂腹面朝上固定在解剖板上 使用昆虫针将昆虫生理盐水缓冲液固定。
    2. 用精细镊子解剖腹部。将整个肠道（包括前肠、中肠和后肠）移至含有1x溶液的新培养皿中 昆虫生理盐水缓冲液
    3. 移除前肠和后肠，迅速将中肠转移至含有 100 µL 昆虫生理盐水缓冲液的微量离心管中。
    4. 将六只蟑螂的中肠合并至同一管中，涡旋振荡10秒。
    5. 在 4 °C 条件下以 1,000 × g 离心 10 分钟，使血细胞和肠道组织沉淀。将上清液转移至新的洁净微量离心管中。
    6. 使用微量紫外-可见分光光度计通过测量A280来定量总蛋白浓度15.
    7. 将每个样品调整至相同的蛋白浓度（总蛋白浓度为 6 mg/µL）。

4. dsRNA 降解实验

  1. 新鲜配制4 µL的裸露dsRNA或dsRNA脂复合物（1 µg）。
  2. 将dsRNA溶液与10 µL昆虫生理缓冲液（对照）、血淋巴提取的酶或中肠液混合。
  3. 向不同样品中分别加入2 µL EGTA（20 mM）或无RNase水，作为抑制酶活性的对照。
  4. 在25 °C下孵育1小时或更长时间（6、12或24小时）。
  5. 加入200 µL提取试剂和40 µL氯仿，然后涡旋振荡。
  6. 在4 °C下以13,000 x g离心10分钟，然后将上清液（150 µL）转移至新的微量离心管中。
  7. 加入150 µL异丙醇沉淀dsRNA，并在冰上孵育15分钟。
  8. 在4 °C下以13,000 x g离心15分钟，然后弃去上清液。
  9. 加入200 µL 70%乙醇洗涤dsRNA沉淀。在4 °C下以13,000 x g离心10分钟。
  10. 弃去乙醇，并重复乙醇洗涤步骤。
  11. 弃去乙醇，使用离心真空浓缩仪干燥dsRNA沉淀3分钟。用10 µL无RNase水重悬dsRNA。
  12. 通过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测处理后dsRNA的完整性。

5. 口服给予dsRNA

  1. 保持蟑螂在 随意摄取 以干燥食物（狗粮）喂养。在进行dsRNA摄入实验前1天，停止供应水源。
  2. 用弯头镊子夹住蟑螂的翅膀以固定（图1, 步骤5).
    注意： 不要抓握蟑螂的身体部位。
  3. 按照第2节所述，制备用于饲喂的dsRNA脂复合物以及裸露的dsRNA。
    注意： dsRNA脂质复合物应在饲喂前新鲜配制。
  4. 用微量移液器加入4 µL的dsRNA脂质复合物或裸露dsRNA（250 ng）。
  5. 用移液器将双链RNA溶液的液滴缓慢靠近蟑螂的口器，使其完全摄入该液滴。
  6. 每天进行两次摄食实验（开灯后1小时和关灯前1小时），持续8天或16天。
    注意： 所有蟑螂仅通过人工喂食dsRNA溶液或对照试剂获取水分（例如无核酸酶水、葡萄糖溶液和脂质体试剂）用于摄食实验。
  7. 在连续摄入dsRNA实验16天后，为蟑螂提供水瓶。

6. 评估基因敲低效果

  1. 在选定的时间点（dsRNA摄入实验后的第2、9和17天），收集经dsEGFP和dsTub处理的昆虫，并解剖选定的组织（例如，中肠）。
  2. 进行定量实时PCR（qRT-PCR）。qRT-PCR扩增条件及引物信息参见Lin 等.（2017）12。
  3. 每天评估对照组和dsRNA处理组昆虫的死亡率，并移除不再活动的蟑螂。

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结果

口服递送dsRNA方案的简化流程见图1，其中展示了制备dsRNA脂复合物的关键步骤。

为了研究脂质体载体对中肠液中dsRNA降解的保护作用 B. germanica，一个 离体 将dsTub脂复合物与中肠液共同孵育，随后在1.5%琼脂糖凝胶上分析dsRNA的完整性。 图2 表明中肠液中存在强烈的RNA核酸酶活性 B. germanica (图2A），而脂质体载体能够在至少1小时内保护dsRNA不被降解 离体 孵育图2A，B因此，在后续实验中，每天两次口服摄入dsRNA脂质复合物，...

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讨论

本方案介绍了一种通过口服递送dsRNA脂复合物实现高效RNA干扰的方法，其中dsRNA可免受德国小蠊中肠液中核糖核酸酶的降解作用。正如在多种昆虫中开展的其他研究所表明的，口服递送dsRNA效果较差的主要原因是dsRNA在消化道中被降解8,9,10。本方案制备的脂质体可作为保护性载体，防止口服递送的dsRNA在肠道中发生降解。此外，dsRNA脂复合物的制备方法简便，易于应用于口服RNA干扰，尤其适用于肠道核糖核酸酶活性较强的昆虫。

与其他研究中向不同昆虫喂食相对大量裸露dsRNA的方法相比10,18,19，本方案采用口服给予相对低剂量的dsRNA（每天0.5 µg），可显著降低中肠中靶基因的表达水平 B. ...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究获得了中国台湾科技部（MOST 100-2923-B-002-002-MY3 和 106-2313-B-002-011-MY3，授予 H.J.L.）、捷克共和国南波希米亚大学资助机构（GAJU 资助项目 065/2017/P，授予 Y.H.L.）以及西班牙经济与竞争力部（CGL2012-36251 和 CGL2015-64727-P，授予 X.B.）和加泰罗尼亚政府（2014 SGR 619，授予 X.B.）的资助；同时也得到了欧洲区域发展基金（FEDER 资金，授予 X.B.）的财政支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
GenJe Plus DNA 体外转染试剂SignaGenSL100499用于脂质复合物制备
Blend Taq plusTOYOBO BTQ-201用于 PCR
Fast SYBR Green Master MixABI 4385612用于 qPCR
FirstChoice RLM-RACE 试剂盒InvitrogenAM1700用于 3' UTR 鉴定 
MEGAscript T7 转录试剂盒InvitrogenAMB13345用于双链 RNA 合成
TURBO DNaseInvitrogenAM2239从双链 RNA 中去除 DNA 模板
TRIzolInvitrogen15596018用于双链 RNA 或总 RNA 提取
RQ1 RNase-Free DnasePromegaM6101从总 RNA 中去除 DNA 模板 
氯仿 Sigma-AldrichC2432用于双链 RNA 或总 RNA 提取
2-丙醇Sigma-AldrichI9516用于双链 RNA 或总 RNA 提取
乙醇Sigma-Aldrich24102用于双链 RNA 或总 RNA 提取
焦碳酸二乙酯（DEPC）Sigma-AldrichD5758用于制备无 RNase 水
葡萄糖溶液Sigma-AldrichG3285用于脂质复合物制备
氯化钠（NaCl）Sigma-AldrichS7653昆虫生理盐水缓冲液配方
氯化钾（KCl）Sigma-AldrichP9333昆虫生理盐水缓冲液配方
氯化钙（CaCl2）Sigma-AldrichC1016昆虫生理盐水缓冲液配方
六水合氯化镁（MgCl2·6H2O）Sigma-AldrichM2670昆虫生理盐水缓冲液配方
EGTA Sigma-AldrichE3889酶抑制剂 
解剖剪F.S.T.蟑螂解剖
精细镊子F.S.T.蟑螂解剖
柔性镊子F.S.T.固定蟑螂 
移液器（Pipetman）RAININP10样品制备
微量离心管AxygenMCT175C, PCR02C样品制备
移液器吸头 Axygen样品制备
涡旋振荡器Digisystemvm1000样品制备
Minispin 离心机The Gruffin GroupGMC 206用于液体离心沉淀 
离心机ALCPK121R样品制备
pH 计 JENCO6071用于 pH 调节
微量分光光度计QuawellQ3000核酸定量
PCR 扩增仪ABI 2720用于模板 PCR 或  双链 RNA 合成孵育 
实时定量 PCR 仪ABI StepOne plus基因表达定量
离心式真空浓缩仪eppendorf5301用于双链 RNA 或总 RNA 提取
Multipette eppendorfxstream用于实时 PCR 样品加样 
琼脂糖 Iamresco0710用于核酸电泳
tub 基因特异性正向引物tri-I biotechGGG ACA AGC CGG AGT GCA GA
tub 基因特异性反向引物tri-I biotechTCC TGC TCC TGT CTC GCT GA
dsTub 模板正向引物tri-I biotechTAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA GCC GGA GTG CAG 
dsTub 模板反向引物tri-I biotechTAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CCT GCT CCT GTC TCG CTG 
dsEGFP 模板正向引物tri-I biotechTAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG
dsEGFP 模板反向引物tri-I biotechTAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GGC GGA TCT TGA AGT TCA CC
tub qPCR 正向引物tri-I biotechGGA CCG CAT CAG GAA ACT GGC
tub qPCR 反向引物tri-I biotechCCA CAG ACA GCC TCT CCA TGA GC
ef1 qPCR 正向引物tri-I biotechCGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG A
ef1 qPCR 反向引物tri-I biotechCCT GCA GAG GAA GAC GAA G

参考文献

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