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方法文章

活细胞成像观察有丝分裂过程中的染色体分离

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DOI：

10.3791/57389

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2018年3月14日

 ,  , 
1Division of Cellular and Gene Therapies, Center for Biologics Evaluation and Research, US Food and Drug Administration, 2Microscopy and Imaging Core facility, Division of Viral Products, Center for Biologics Evaluation and Research, US Food and Drug Administration

本文内容

摘要

本实验方案介绍了一种简便、便捷的方法，利用组蛋白2B-GFP BacMam 2.0标记物和转盘共聚焦显微镜系统，对有丝分裂细胞中的活体染色体进行标记与可视化观察。

摘要

在有丝分裂过程中，染色体必须被可靠且均一地分配到子细胞中。染色体分离的保真性受到多种机制的调控，其中包括纺锤体组装检查点（Spindle Assembly Checkpoint, SAC）。SAC 是一个复杂反馈系统的一部分，其功能是阻止细胞进入有丝分裂的后续阶段，直到所有染色体的动粒均与纺锤体微管正确连接。染色体滞后和异常染色体分离是细胞周期调控检查点功能障碍的标志，可用于评估分裂细胞的基因组稳定性。SAC 的失调可导致染色体分离过程中错误的累积，从而促使正常细胞转化为恶性细胞。SAC 的执行以及动粒复合物的形成受到激酶与磷酸酶（如蛋白磷酸酶 2A（Protein Phosphatase 2A, PP2A））之间相互作用的严密调控。本实验方案描述了对缺失 PP2A-B56γ 调节亚基的小鼠所分离的小鼠胚胎成纤维细胞中滞后染色体进行活细胞成像的方法。该方法克服了其他细胞周期调控成像技术（如流式细胞术或免疫细胞化学）的局限性，后者仅能提供细胞胞质分裂状态的静态图像，而无法实现对有丝分裂过程中染色体动态时空行为的可视化观察。

引言

在以下实验方案中，我们描述了一种便捷的方法，利用组蛋白2B-GFP、BacMam 2.0标记和活细胞成像技术，在小鼠胚胎成纤维细胞中可视化细胞周期过程中的染色体分离和有丝分裂进程。

细胞周期调控检查点监测染色体的分离过程，在维持细胞遗传完整性方面发挥重要作用1,2,3。染色体错误分离的积累可导致非整倍性，而非整倍性是大多数实体瘤的特征之一4。因此，检测滞后染色体可作为研究染色体不稳定性的一种方法。

荧光标记蛋白可用于观察活细胞中的染色体分离过程及染色体滞后现象，但生成mCherry标记或H2B-GFP标记的蛋白需要具备基因递送和分子生物学方面的专业知识5。本文描述了CellLight Histone2B-GFP BacMam 2.0试剂的使用方法，为简便起见，下文简称CL-HB试剂。该试剂可直接使用，因而无需担心载体质量和完整性问题。此外，该试剂无需使用潜在有害的处理方法、脂质或染料负载化学物质。与传统的荧光标记不同，CL-HB试剂的染色不依赖于细胞功能（即，膜电位）。只需将CL-HB试剂加入细胞中，过夜孵育即可实现蛋白表达。CL-HB试剂在哺乳动物细胞中不会复制，可在生物安全等级（BSL）1的实验室环境中使用。此外，这种瞬时转染在过夜孵育后可检测长达5天，足以完成大多数动态细胞分析。

此外，染色体异常可通过多种技术进行研究，例如流式细胞术、免疫组织化学或荧光原位杂交（FISH）6。流式细胞术可用于研究非整倍性，其可通过DNA含量及细胞在细胞周期中的所处阶段进行测定。尽管流式细胞术可用于测量非整倍性，但它无法提供有关染色体错误分离的信息。FISH和免疫组织化学技术利用荧光探针与DNA或染色体结合。虽然这些技术能够提供细胞群体状态的静态图像，但无法实现活细胞成像，因此无法获得对特定细胞在一段时间内胞质分裂过程进行时空可视化所可能提供的信息。

本实验方案用于研究从PP2A-B56γ基因敲除小鼠中分离得到的鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）在诺考达唑处理后出现的滞后染色体或染色体错误分离现象。除上述应用外，该方案还提供了一种简便的工具，可用于标记和可视化多种细胞类型中的染色体分离过程，从而研究细胞周期调控或肿瘤细胞中的染色体不稳定性。此外，该方法也可用于研究不同药物处理引起的染色体不稳定性，或用于分析基因敲除导致染色体错误分离所产生的影响。

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方案

本研究中进行的所有实验均按照美国食品药品监督管理局（FDA）研究机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。

1. 小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的分离与培养

  1. 按照标准方案从小鼠品系 PP2A-B56γ- 及其野生型同窝小鼠中分离小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）7,8,9。
  2. 将 MEFs 扩增 3 代，冻存并保存至实验需要时使用8。

2. 活细胞成像用2孔腔室盖玻片中MEF的培养

  1. 在500 mL培养基瓶中配制500 mL MEF生长培养基，包含Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM/F12）、10%胎牛血清（FBS）、1×青霉素/链霉素抗生素、L-谷氨酰胺（200 mM）和1×非必需氨基酸（NEAA）。
  2. 将第3代野生型和PP2A-B56γ-小鼠的冻存MEF细胞管置于37 °C预热的水浴中解冻。
  3. 将解冻后的MEF细胞转移至15 mL离心管中，使用10 mL移液器缓慢逐滴加入20 mL DMEM/F12培养基。
  4. 将MEF细胞连同20 mL DMEM/F12生长培养基转移至T75培养瓶中，培养至细胞融合度达到70%。使用倒置显微镜在4×或10×放大倍数下估算融合度。
  5. 在生物安全柜中使用连接真空系统的玻璃移液管吸除生长培养基，加入3 mL 0.25%胰蛋白酶/EDTA，于37 °C孵育5分钟。加入3 mL DMEM/F12生长培养基以终止反应。
  6. 将细胞在室温下以低速（300 × g）离心5分钟。小心吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于1 mL已在水浴中预热至37 °C的DMEM/F12生长培养基中。
  7. 使用台盼蓝排斥法或其他合适的细胞计数方法对细胞进行计数8。
  8. 在2孔板玻璃底培养皿中每孔接种约20,000个MEF细胞，每孔加入200 µL DMEM/F12生长培养基，并在37 °C、5% CO2条件下过夜培养，使细胞贴壁。

3. 同步化

  1. 通过将细胞在含有0.1% FBS的DMEM/F12培养基中孵育24小时，使MEFs细胞同步于G0/G1期，以获得最大数量的处于G0/G1期的细胞。
    注意：尽管血清饥饿是首选的同步方法，但也可根据实验所需将细胞阻滞在不同的有丝分裂阶段而采用其他多种方法10。

4. 标记

  1. 用DMSO配制1.5 mg/mL的诺考达唑储备液。诺考达唑通过抑制微管形成使细胞停滞在G2/M期10。
  2. 同步化后第三天，加入200 µL生长培养基（含10% FCS）、200 ng/mL诺考达唑和CL-HB试剂（Histone 2B-GFP BacMam 2.0）。
  3. 按以下公式计算需加入细胞的CL-HB试剂每细胞颗粒数（Particles Per Cell, PPC）：
    figure-protocol-1
    其中，细胞数量为标记时细胞的估计总数，PPC为每细胞颗粒数，1 × 108为每毫升试剂所含颗粒数。例如，若以30 PPC标记20,000个细胞：
    figure-protocol-2
    注意：CL-HB试剂在大多数细胞类型中以10至50 PPC的范围效果良好。但在本研究中，30 PPC效果最佳。
  4. 将MEFs在37 °C和5% CO2条件下孵育18小时。
    注意：在当前实验中，经诺考达唑处理导致细胞周期阻滞18小时后，可观察到有丝分裂细胞中染色体逃逸纺锤体组装检查点的现象。

5. 滞后染色体的可视化

  1. 使用配备环境控制室、油浸63倍物镜的转盘共聚焦显微镜系统观察小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）。
    1. 采集GFP通道图像时，使用488 nm激发波长和450 nm发射波长。
    2. 本技术所用的转盘共聚焦显微镜系统应具备电动扫描载物台、Z压电插入装置、载物台顶部培养箱以及光漂白后直接荧光恢复功能。
  2. 成像前一天，打开环境控制室电源，并将整个腔室在37 °C下预热过夜。
  3. 打开显微镜主机、相机、转盘单元、照明器、氩激光器、计算机和电动载物台的电源。
  4. 让系统预热3分钟；通过打开点火钥匙启动氩激光器，将氩激光器的拨动开关从“待机”切换至“激光运行”状态。
  5. 启动数据采集与处理软件。
  6. 启动载物台顶部培养箱的CO2控制器，并将CO2浓度设定为5%。此步骤必须在开始成像前完成。
  7. 从培养箱中取出带腔室的盖玻片，放置于载物台上进行观察。通过油浸63倍物镜（NA1.4）观察细胞。
  8. 通过目镜观察，调焦并识别处于核膜破裂（NEBD）阶段的细胞。
  9. 启动适当的激光器（使用488 nm氩激光器观察组蛋白2B-GFP）。
  10. 打开采集控制窗口，设置GFP通道的曝光时间。识别一个处于NEBD阶段的细胞。
    1. 手动确定目标细胞的顶部和底部焦平面，并输入xyz光学切片参数。
    2. 观察20分钟；若该细胞未进入细胞分裂，则在20分钟后停止图像采集，并转至下一个处于NEBD阶段的细胞。
  11. 对逃逸自纺锤体组装检查点（SAC）的PP2A-B56γ缺陷细胞，在有丝分裂期间成像滞后染色体约需每细胞1小时。为获得用于制作视频的数据，每隔3分钟拍摄一次图像。
    注意：野生型细胞在诺考唑处理下会停滞，不会越过NEBD阶段。
  12. 将图像以zvi文件格式保存，用于后续分析。

6. 图像处理与分析

注意：使用任何可用的软件（如 Axiovision 版本 4.8.2 或 Imaris 版本 8.2）进行三维图像处理与分析。本研究中使用的是 ImageJ 软件。

  1. 打开图像序列。如果图像已经是堆栈格式，则继续下一步。如果不是，请在菜单栏中选择“图像 > 堆栈 > 图像到堆栈”将所有相关图像合并为一个堆栈。
  2. 根据需要调整亮度/对比度和灰度级别。
  3. 为视频添加时间戳：
    1. 在菜单栏中选择“图像 > 堆栈 > 标签…”。
    2. 选择合适的格式、起始时间值以及每幅图像之间的时间间隔。
    3. 勾选“预览”框，并调整位置和格式设置。点击“确定”以应用时间戳。
  4. 为视频添加比例尺：
    1. 在菜单栏中选择“分析 > 设置比例尺”来设定图像比例。
    2. 在“像素距离”字段中输入已知距离所对应的像素数量，在“已知距离”字段中输入实际距离。设置正确的长度单位，e.g.，µm。点击“确定”将比例应用到堆栈。
    3. 选择“分析 > 工具 > 比例尺…”以添加比例尺。将比例尺大小设为“宽度（µm）”，并根据需要调整其余格式选项。勾选“标记所有切片”框，以便在整个堆栈中添加比例尺。
  5. 通过点击图像窗口左下角的三角形播放按钮预览视频。在菜单栏中选择“图像 > 堆栈 > 动画 > 动画选项”来调整帧率。
  6. 通过选择“文件 > 另存为 > AVI…”导出视频文件，并选择帧率和压缩方式。
  7. 点击“确定”选择保存位置和文件名。点击“保存”以保存视频文件。

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结果

将野生型和 PP2A-B56γ- 小鼠的 MEFs 接种于 2 孔腔室盖玻片中，使其贴壁。第 2 天，使用含 0.1% FBS 的培养基对 MEFs 进行同步化处理，持续 24 小时。第 3 天，将 MEFs 置于含 200 ng/mL nocodazole 和 30 PPC CL-HB 试剂的培养基中，在 37°C 和 5% CO2 条件下孵育 18 小时。第 4 天，使用转盘共聚焦显微镜系统对细胞进行成像（图 1）。通过活细胞成像观察单个细胞从核膜破裂（NEBD）到有丝分裂完成的命运变化（图 2）。已知 nocodazole 可通过干扰微管形成，将野生型细胞阻滞在 G2/M 期。我们观察到，在 nocodazole 处理后，野生型细胞被阻滞在中期（上图，图 2）。我们发现，PP2A-B56γ 的缺失削弱了细胞周期调控，使得 PP2A-B56γ- M...

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讨论

确保染色体准确分离的细胞周期调控检查点可防止非整倍性和细胞转化1,2,3。在本研究中，我们发现PP2A-B56γ失活会导致纺锤体组装检查点减弱。活细胞成像使我们能够观察到经诺考达唑处理的PP2A-B56γ MEFs在有丝分裂过程中发生的染色体错误分离现象9。

本实验方案利用BacMam 2.0技术产生的组蛋白2B-GFP标记物对染色体进行活细胞成像标记。标记过程中的关键步骤之一是计算每细胞所需的颗粒数（PPC），以实现充分的标记效果。通过滴定实验发现，每细胞10–50个颗粒的范围效果最佳。该试剂可能对细胞具有毒性，因此必须对所用PPC进行滴定，以在标记效率与细胞毒性之间达到平衡。此外，这是一种瞬时转染，标记信号仅可维持最多5天，因此可能不适用于需要更长时间观察的研究。

传统的蛋白质或DNA标记方...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

我们感谢洪国铨博士和Bharatkumar Joshi博士提出的宝贵意见，这些意见改进了本稿件。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEM/F12Gibco11320082
L-谷氨酰胺Gibco25030081
MEM 非必需氨基酸溶液（100X）Gibco11140050
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）Gibco15140122
杜尔贝科’磷酸盐缓冲液Gibco14190144
胰蛋白酶-EDTAGibco25300054
胎牛血清Atlanta BiologicalsS11150
DMSOEMD MilliporeMX 1458-6
冻存管储存盒Fisherbrand10-500-28
冻存管Corning/costar431416
T75 培养瓶Cellstar658175
双孔培养皿盖玻片Nunc155380PK
Cellometer Vision 细胞分析仪Nexcelom Bioscience LLCCellometer Vision Trio
诺考达唑SigmaM1404
CellLight 组蛋白2B-GFP，BacMam 2.0赛默飞世尔科技公司C10594
蔡司Cell Observer转盘共聚焦显微镜系统卡尔·蔡司显微镜蔡司细胞观察器SD
水浴锅赛默飞世尔科技280 系列
培养箱三洋商用解决方案MCO-18AIC（紫外）
II级生物安全柜The Baker CompanySterilGard
Axiovision 软件ZeissVer.4.8.2
ImageJ 软件美国国立卫生研究院Ver. 1.51r

参考文献

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