本实验方案介绍了一种简便、便捷的方法，利用组蛋白2B-GFP BacMam 2.0标记物和转盘共聚焦显微镜系统，对有丝分裂细胞中的活体染色体进行标记与可视化观察。
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本文内容
摘要
摘要
在有丝分裂过程中，染色体必须被可靠且均一地分配到子细胞中。染色体分离的保真性受到多种机制的调控，其中包括纺锤体组装检查点（Spindle Assembly Checkpoint, SAC）。SAC 是一个复杂反馈系统的一部分，其功能是阻止细胞进入有丝分裂的后续阶段，直到所有染色体的动粒均与纺锤体微管正确连接。染色体滞后和异常染色体分离是细胞周期调控检查点功能障碍的标志，可用于评估分裂细胞的基因组稳定性。SAC 的失调可导致染色体分离过程中错误的累积，从而促使正常细胞转化为恶性细胞。SAC 的执行以及动粒复合物的形成受到激酶与磷酸酶（如蛋白磷酸酶 2A（Protein Phosphatase 2A, PP2A））之间相互作用的严密调控。本实验方案描述了对缺失 PP2A-B56γ 调节亚基的小鼠所分离的小鼠胚胎成纤维细胞中滞后染色体进行活细胞成像的方法。该方法克服了其他细胞周期调控成像技术（如流式细胞术或免疫细胞化学）的局限性，后者仅能提供细胞胞质分裂状态的静态图像，而无法实现对有丝分裂过程中染色体动态时空行为的可视化观察。
引言
在以下实验方案中，我们描述了一种便捷的方法，利用组蛋白2B-GFP、BacMam 2.0标记和活细胞成像技术，在小鼠胚胎成纤维细胞中可视化细胞周期过程中的染色体分离和有丝分裂进程。
细胞周期调控检查点监测染色体的分离过程，在维持细胞遗传完整性方面发挥重要作用1,2,3。染色体错误分离的积累可导致非整倍性，而非整倍性是大多数实体瘤的特征之一4。因此，检测滞后染色体可作为研究染色体不稳定性的一种方法。
荧光标记蛋白可用于观察活细胞中的染色体分离过程及染色体滞后现象，但生成mCherry标记或H2B-GFP标记的蛋白需要具备基因递送和分子生物学方面的专业知识5。本文描述了CellLight Histone2B-GFP BacMam 2.0试剂的使用方法，为简便起见，下文简称CL-HB试剂。该试剂可直接使用，因而无需担心载体质量和完整性问题。此外，该试剂无需使用潜在有害的处理方法、脂质或染料负载化学物质。与传统的荧光标记不同，CL-HB试剂的染色不依赖于细胞功能（即，膜电位）。只需将CL-HB试剂加入细胞中，过夜孵育即可实现蛋白表达....
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方案
本研究中进行的所有实验均按照美国食品药品监督管理局（FDA）研究机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。
1. 小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的分离与培养
- 按照标准方案从小鼠品系 PP2A-B56γ- 及其野生型同窝小鼠中分离小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）7,8,9。
- 将 MEFs 扩增 3 代，冻存并保存至实验需要时使用8。
2. 活细胞成像用2孔腔室盖玻片中MEF的培养
- 在500 mL培养基瓶中配制500 mL MEF生长培养基，包含Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM/F12）、10%胎牛血清（FBS）、1×青霉素/链霉素抗生素、L-谷氨酰胺（200 mM）和1×非必需氨基酸（NEAA）。
- 将第3代野生型和PP2A-B56γ-小鼠的冻存MEF细胞管置于37 °C预热的水浴中解冻。
- 将解冻后的MEF细胞转移至15 mL离心管中，使用10 mL移液器缓慢逐滴加入20 mL DMEM/F12培养基。
- 将MEF细胞连同20 mL DMEM/F....
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结果
将野生型和 PP2A-B56γ- 小鼠的 MEFs 接种于 2 孔腔室盖玻片中，使其贴壁。第 2 天，使用含 0.1% FBS 的培养基对 MEFs 进行同步化处理，持续 24 小时。第 3 天，将 MEFs 置于含 200 ng/mL nocodazole 和 30 PPC CL-HB 试剂的培养基中，在 37°C 和 5% CO2 条件下孵育 18 小时。第 4 天，使用转盘共聚焦显微镜系统对细胞进行成像（图 1）。通过活细胞成像观察单个细胞从核膜破裂（NEBD）到有丝分裂完成的命运变化（图 2）。已知 nocodazole 可通过干扰微管形成，将野生型细胞阻滞在 G2/M 期。我们观察到，在 nocodazole 处理后，野生型细胞被阻滞在中期（上图，图 2）。我们发现，PP2A-B56γ 的缺失削弱了细胞周期调控，使得 PP2A-B56γ- M.......
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讨论
确保染色体准确分离的细胞周期调控检查点可防止非整倍性和细胞转化1,2,3。在本研究中，我们发现PP2A-B56γ失活会导致纺锤体组装检查点减弱。活细胞成像使我们能够观察到经诺考达唑处理的PP2A-B56γ MEFs在有丝分裂过程中发生的染色体错误分离现象9。
本实验方案利用BacMam 2.0技术产生的组蛋白2B-GFP标记物对染色体进行活细胞成像标记。标记过程中的关键步骤之一是计算每细胞所需的颗粒数（PPC），以实现充分的标记效果。通过滴定实验发现，每细胞10–50个颗粒的范围效果最佳。该试剂可能对细胞具有毒性，因此必须对所用PPC进行滴定，以在标记效率与细胞毒性之间达到平衡。此外，这是一种瞬时转染，标记信号仅可维持最多5天，因此可能不适用于需要更长时间观察的研究。
传统的蛋白质或DNA标记方.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
我们感谢洪国铨博士和Bharatkumar Joshi博士提出的宝贵意见，这些意见改进了本稿件。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 | Gibco | 11320082 | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | 25030081 | |
| MEM 非必需氨基酸溶液（100X） | Gibco | 11140050 | |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） | Gibco | 15140122 | |
| 杜尔贝科’磷酸盐缓冲液 | Gibco | 14190144 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25300054 | |
| 胎牛血清 | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMSO | EMD Millipore | MX 1458-6 | |
| 冻存管储存盒 | Fisherbrand | 10-500-28 | |
| 冻存管 | Corning/costar | 431416 | |
| T75 培养瓶 | Cellstar | 658175 | |
| 双孔培养皿盖玻片 | Nunc | 155380PK | |
| Cellometer Vision 细胞分析仪 | Nexcelom Bioscience LLC | Cellometer Vision Trio | |
| 诺考达唑 | Sigma | M1404 | |
| CellLight 组蛋白2B-GFP，BacMam 2.0 | 赛默飞世尔科技公司 | C10594 | |
| 蔡司Cell Observer转盘共聚焦显微镜系统 | 卡尔·蔡司显微镜 | 蔡司细胞观察器SD | |
| 水浴锅 | 赛默飞世尔科技 | 280 系列 | |
| 培养箱 | 三洋商用解决方案 | MCO-18AIC（紫外） | |
| II级生物安全柜 | The Baker Company | SterilGard | |
| Axiovision 软件 | Zeiss | Ver.4.8.2 | |
| ImageJ 软件 | 美国国立卫生研究院 | Ver. 1.51r |
参考文献
- Funk, L. C., Zasadil, L. M., Weaver, B. A. Living in CIN: Mitotic Infidelity and Its Consequences for Tumor Promotion and Suppression. Dev Cell. 39, 638-652 (2016).
- Etemad, B., Kops, G. J. Attachment issues: kinetochore transformations and s....
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重印与许可
