一种用于在小鼠中诱导横主动脉缩窄的闭胸模型

摘要

本文介绍了一种通过侧胸切开术进行横主动脉缩窄（TAC）的操作方案。该技术是一种微创的闭合式胸腔手术，旨在利用标准的TAC实验室条件，在小鼠中模拟压力超负荷和心力衰竭状态。

摘要

通过横向主动脉缩窄术（TAC）诱导的压力超负荷小鼠模型常用于心肌肥厚与心力衰竭的研究。标准操作需进行部分开胸以暴露横位主动脉弓。然而，开胸模型中因肋骨被分离且胸腔闭合后未重新连接，导致手术创伤改变呼吸生理状态。为避免此问题，我们建立了一种经侧胸入路的微创闭胸手术方法。本研究中，通过第2^nd 在不进入胸腔的情况下进行肋间切口，使小鼠遭受的创伤更轻，更利于恢复。我们采用标准的实验室条件进行开胸TAC手术操作，术后生存率相当。由于采用闭胸方法，小鼠的生理呼吸模式得以维持，且表现出更快的恢复速度。这种微创技术似乎有助于加快创伤后的愈合过程，并减轻免疫反应。

引言

小鼠模型常用于模拟人类疾病¹。通过横主动脉缩窄术（TAC）可诱导压力超负荷和左心室肥厚²。小鼠开胸TAC模型已由Rockman et al.³ 验证，其手术操作细节由DeAlmeida et al.⁴ 详细描述。与腹主动脉缩窄相比，横主动脉结扎更具优势，因为前者可使更大范围的循环系统补偿后一种操作带来的不利影响²。

对横弓主动脉进行缩窄会导致升主动脉和无名动脉的动脉压升高，但通过远端血管仍可维持器官的充分灌注（即 左侧颈总动脉、左侧锁骨下动脉和降主动脉）。这会导致心肌后负荷增加以及心室壁应力升高。随后由于心肌纤维增厚，壁应力逐渐降低。⁵慢性的心脏血流动力学改变导致左心室发生不良适应和扩张。通过这种方式，TAC 建立了一个可重复的心肌肥厚模型，并最终发展为心力衰竭。

DeAlmeide 描述的 TAC 标准操作步骤 等⁴ 通过部分上胸廓切开术，经肋骨或胸骨分离，进入纵隔及胸膜腔，从而接近主动脉弓。该入路可良好显露主动脉弓及其侧支血管。然而，被分离的肋骨无法重新固定，导致其游离漂浮，从而改变呼吸动力学。

因此，我们建立了一种经侧方手术入路的微创闭合式胸腔主动脉弓操作方法，通过第2肋间进入^nd 肋间隙。该模型最大的优势在于能够不切断肋骨而完成TAC手术。手术创伤仅限于皮肤切口和肋间肌的分离。该操作可最大程度减少创伤本身，并有助于维持足够的胸壁稳定性。

本文介绍了一种无需进行全胸廓切开或上胸廓切开术即可在小鼠中实施TAC手术的详细分步操作流程。采用高频多普勒超声检测以确认TAC手术成功，方法如先前文献所述^6,7。

方案

本方案已获得雷克林豪森 LANUV 动物实验伦理委员会批准（编号：#84-02.04.2016.A374）。通常，该操作在成年小鼠（>10 周龄）上进行。然而，也可在较年轻的动物上实施该手术。手术器械在使用前必须灭菌，所有步骤均须在无菌条件下进行。

1. 麻醉诱导与插管

1. 腹腔注射布托啡诺，剂量为0.1 µg/g体重，用于镇痛。术后连续三天每8小时重复一次腹腔注射，每次剂量为0.1 mg/kg。
2. 诱导时，将小鼠放入麻醉诱导箱中，诱导箱连接至麻醉蒸发器，异氟烷浓度设定为3.0 Vol%，氧气流速为1 L/min。
3. 通过施加触觉刺激确保深度麻醉。
   注意：如果麻醉诱导失败或麻醉深度不足，可将异氟烷的体积分数增加至5%。
4. 捏住小鼠尾部以确认无反射反应。若反射完全消失，称量小鼠体重以优化呼吸机参数设置（参见1.12）。
5. 将小鼠移至温度控制的手术台，以在整个操作过程中维持37 °C的体温。
6. 将小鼠的鼻部放入与麻醉诱导箱相连的塑料锥形管中以维持麻醉状态。
7. 用尼龙缝线固定小鼠的上切牙，用胶带固定四肢。
8. 用镊子尖端按压后肢足垫，再次确认麻醉效果充分。若无退缩反射，则进行以下步骤。
   注意：如果麻醉诱导失败或麻醉深度不足，增加异氟烷的体积百分比，并等待缩足反射消失。
9. 在角膜上涂抹无菌眼科润滑剂，以防止麻醉期间角膜干燥。 
10. 润滑直肠探头，以避免直肠损伤。插入直肠温度探头，维持核心体温为37 °C。
11. 使用脱毛膏按照制造商说明对喉部和上胸部进行脱毛。1分钟后擦去脱毛膏。如有必要，重复此步骤直至脱毛成功。
    注意：使用棉签 如发生出血。
12. 用70%乙醇清洁脱毛区域，然后进行局部皮肤消毒，涂抹聚维酮碘3次，每次至少持续3分钟。
13. 调整呼吸机参数至生理范围。将呼吸频率设为150次/分钟，潮气量设为8–10 µL/g体重（BW）。
14. 戴上一副新的无菌手套。将小鼠置于手术显微镜下，并在小鼠身上覆盖无菌开窗洞巾。
15. 在下颌下方约3 mm处沿中线切开皮肤，直至第2颈椎^nd 肋骨。辨认下颌下腺的中线及结缔组织。然后使用成角的囊内镊，用两把镊子在中线处钝性轻柔分离腺体，并探查气管肌。
16. 用无齿镊轻轻钝性分离气管旁肌肉，以制备气管。
17. 用镊子牵拉舌头以伸直喉部，为插管创造更便利的条件，并轻柔地将气管插管导管（外径 1.2 mm）插入气管内。通过直接观察导管是否位于气管内以及检查胸廓运动是否正常来确认插管成功。
18. 插管后，将异氟烷浓度调整为2%异氟烷，氧流量为1.0 L/min，氧气浓度为100%₂.
    注意：如果呼吸运动未停止或小鼠开始活动，首先将呼吸频率增加至180次/分钟。如有必要，随后将异氟烷浓度增加至最高3.5%，直至小鼠自主呼吸停止。最常见的问题包括漏气或蒸发器填充不足，需进行评估。
19. 或者，按照以下子步骤建议进行插管操作。
    1. 将小鼠置于与水平面呈60°角的桌面上。
    2. 用胶带固定小鼠的四肢并后仰头部。
    3. 将冷光源直接置于喉部上方的皮肤处。
    4. 用镊子轻轻拉出舌头，以观察声带。
    5. 通过声带插入静脉留置针（24 G）的塑料导管，并将塑料导管连接至呼吸机设置。
    6. 将呼吸机连接至导管，通过观察胸廓同步运动来确认插管成功。
       注意：如果呼吸运动未停止或小鼠开始活动，首先将呼吸频率增加至每分钟180次。如有必要，随后将异氟烷浓度增加至最高3.5%，直至小鼠自主呼吸停止。应评估是否存在漏气或蒸发器填充不足，这是最可能的问题。

2. 术前多普勒测量

1. 用镊子轻轻分开气管旁的结缔组织，游离出双侧颈动脉。
2. 将20 MHz多普勒探头的尖端蘸取少量无菌 超声耦合剂，以小于45°的角度分别置于右侧和左侧颈动脉上。
3. 缓慢旋转探头，向内外侧移动以寻找多普勒信号，并倾斜探头以优化信号质量。
4. 使用多普勒软件在计算机上显示并记录右侧和左侧颈总动脉的血流速度。

3. 开胸术

1. 每只小鼠使用一副无菌手套，以防止手术部位感染。
2. 将皮肤切口向下延伸至第2处^nd 用剪刀分离肋间隙。
3. 确定 2^nd 通过计数肋骨在视觉上确定肋间隙，然后用包膜钳钝性穿入该间隙。
   注意：第1条^st 肋骨位于锁骨下方，因此不可见，因为2^nd 肋间隙位于第一可见肋骨之间（即 2^nd 肋）和3^rd 肋
4. 打开 2^nd 借助镊子尖端分离肋间隙并插入牵开器。
5. 使用固定在手术台上的橡皮筋调节拉钩，以清晰暴露胸腺。
6. 若发生出血，使用棉签按压浅表血管2分钟。

4. 横向主动脉缩窄术

1. 将放大倍数调整至200%，以识别中线和结缔组织。然后使用弯头镊子轻轻分离胸腺。去除脂肪组织，直至能清晰看到主动脉弓。
2. 在头臂动脉与左颈总动脉之间的横位主动脉下方，使用带角度的持针钳制备一个隧道（参见 图1用精细镊子夹住6.0缝线的一端，将缝线从主动脉弓下方穿过。
3. 用第二把镊子从拱形的另一侧取线。
4. 剪取一段3毫米长的27 G针头，用作体重在19–25 g小鼠进行TAC连接时的间隔物；使用26 G针头作为其他小鼠的间隔物 >25 g 体重。
5. 将垫片小心地平行放置于横位主动脉旁。
6. 在垫片上打一个松散的双结，并确保垫片与主动脉平行且位置最佳。然后打第一个结扣，迅速执行第二个反向结扣。立即移除垫片。
7. 为进行假手术小鼠的对照操作，请遵循相同的实验步骤，但省略主动脉结扎步骤。
8. 关闭 2^nd 用6.0聚丙烯缝线缝合肋间隙。结扎时需特别注意锁骨下血管。
9. 缝合 使用6.0聚丙烯缝线以连续缝合方式缝合皮肤。

5. 确认横主动脉结扎成功

1. 按照第2节所述，将20 MHz多普勒探头以45°角放置于颈部两侧。
2. 记录每一侧的血流速度。
   注：可通过多普勒血流速度验证TAC是否成功，如图2所示。颈动脉左右两侧的血流速度比为4 - 10时，通常可确保TAC充分（见图2）。

6. 心脏采集

1. 按照步骤 1.2 和 1.3 进行麻醉诱导。
2. 将小鼠放入安乐死舱内，调节二氧化碳流速，使其每分钟置换舱体体积的 10 - 30%。
3. 将小鼠固定于手术台，用剪刀打开腹腔，通过套管从下腔静脉采集血液，用于后续分析。
4. 用粗剪刀剪开膈肌和胸骨，取出心脏。
5. 在称重前去除心脏上所有动脉和结缔组织。
6. 将右心室和室间隔与左心室分离，并分别称重。
7. 将两份组织样本在液氮中迅速冷冻。

结果

成功的缩窄术（TAC）可确保诱导出压力超负荷及左心室肥厚。可通过多普勒血流速度测量对压力超负荷进行临时验证，如图2所示。术前两侧颈动脉的血流速度相等，而缩窄术后由于左心室和主动脉压力升高，导致右侧颈动脉血流速度增加，同时左侧颈动脉在狭窄后出现血流速度减弱。

通过计算 C57BL/6J 雄性小鼠术后第 3、6 和 21 天的心脏重量/体重比值（HW/BW；mg/g），验证了 TAC 手术的有效性及其诱导的心肌肥厚效应。术后第 6 天，TAC 小鼠的 HW/BW 比值显著高于未结扎对照组小鼠（4.78 ± 0.18 vs7.66±1.43 mg/g，p <0.0001）。术后 21 天时，该比值基本保持稳定（4.8 ± 0.11 vs 7.81 ± 0.65 mg/g，p <0.0001）（见图 3）。手术存...

讨论

由于TAC引起的高血压具有快速发作的特点，这与临床上由主动脉瓣狭窄或高血压引起的心肌肥厚有所不同。然而，使用小型动物模型诱导心力衰竭具有诸多优势，因此被许多研究者所采用¹¹。这种闭胸模型改进了已有的在小鼠中诱导横主动脉缩窄的手术技术模型⁴。

最关键的步骤是导管通过主动脉弓的部分。若在主动脉周围结扎过紧，可能导致流向肾脏等重要器官的血流严重减少，从而引发致命后果。根据哈根-泊肃叶定律（Hagen-Poiseuille law），血流量主要取决于血管半径。因此，本实验方案中使用了若干根据体重调整的间隔物。该方法使此模型具有更广泛的适用性，尤其适用于非常年轻或年老的小鼠，具体可根据不同的实验设计进行调整。

手术创伤本身会引发免疫反应，应将其降至绝对最低程度，以防止产生干扰效应。快速恢复和高存活率是必需的，尤其是在复杂的动物模型中。历史上，与人类患者的开胸手术不同，小鼠在TAC手术后胸廓不会被复原。因此，由于肋骨游离且未与胸骨重新连接，生理...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
压力-容积导管	Millar Instruments, USA	SPR-839
小鼠呼吸机	Harvard Apparatus GmbH, Germany	Minivent - TYPE 845
小鼠呼吸机	Harvard Apparatus GmbH, Germany	带套管内插管的Y型连接器，外径1.2 mm，货号73-2844
麻醉蒸发器	Dräger Medical AG&CO.KG, Germany	19.3 异氟烷蒸发器（更新版本的目录编号为 D-877-2010）
显微镜	Leica Microsystems, Germany	MZ 7.5
光源	Schott AG, Germany	KL 1500 LCD
6-0 Prolene	Ethicon, USA	聚丙烯缝线 BV-1 9.3 mm 3/8c	手术缝合线
Seraflex	Serag Wiessner, Germany	USP 5/0 黑色；  IC108000	缩窄术用缝线
恒温控制手术台	Harvard Apparatus GmbH, Germany	型号872/3 HT，配三脚架和恒温控制器874型，货号73-4233
柔性直肠探头	Harvard Apparatus GmbH, Germany	外径1.6 mm，货号55-7021
多普勒信号可视化仪器	Indus Instruments, USA	多普勒信号处理工作站（DSWP），配备20 MHz脉冲多普勒模块
Arruga 囊内镊	Altomed, UK	A5400
多普勒探头	Indus Instruments, USA	20 MHz管装探头
Jaffe 眼睑拉钩	Altomed, UK	A3513