一种测定植物中铁含量的比色法

摘要

我们介绍一种利用比色普鲁士蓝法测定植物组织中铁含量的简单且可靠的实验方案。

摘要

铁是生物体中最重要的微量元素之一，参与呼吸作用和光合作用等基本生理过程。所有生物体内的铁含量均较低，在植物中约占干重的0.009%。迄今为止，测定植物组织中铁浓度最准确的方法之一是火焰吸收原子光谱法。然而，该方法耗时较长、成本较高，且需要特定设备，而这些设备在大多数植物学实验室中并不常见。因此，亟需一种更简便且准确的方法，可用于常规检测。普鲁士蓝比色法通常用于动物和植物组织切片中铁的定性染色。在本研究中，我们对普鲁士蓝法进行了改进，使其适用于烟草叶片中铁含量的定量测定。我们通过原子光谱法和普鲁士蓝染色法对同一样品中的铁含量进行测定，以验证该方法的准确性，结果表明两种方法之间具有良好的线性回归关系（R² = 0.988）。我们得出结论：普鲁士蓝法用于植物组织中铁的定量测定具有精确、简便和低成本的优点。然而，由于样品与试剂之间可能存在物种特异性的相互作用，本文建立的线性回归关系可能不适用于其他植物种类。因此，针对不同植物物种需分别建立相应的回归曲线。

引言

铁（Fe）是所有生物体中一种重要的微量元素。在植物中，由于铁参与呼吸作用、光合作用和叶绿素生物合成等基本生理过程，因此是一种必需的微量元素¹。游离铁离子的过度积累会对植物细胞造成伤害，因其可引发产生自由基的反应，导致氧化应激。为维持植物细胞内的铁稳态，铁离子被储存于液泡中，并被隔离在铁蛋白（ferritin）内；铁蛋白是一种直接参与铁稳态调控的蛋白质笼状结构，也是所有生物体中铁的主要储存形式²。与此同时，缺铁性贫血影响着大量人群，导致人们对植物铁生物强化的需求日益增加。由于植物铁蛋白具有独特的性质，利用铁蛋白结合铁进行食品强化，为解决这一营养不良问题提供了有前景的策略³。

铁离子主要以两种氧化态存在，即亚铁（二价 Fe²⁺ 或铁(II)）和高铁（三价 Fe³⁺ 或铁(III)）形式。细胞中还存在其他多种铁的形式，例如铁簇⁴。在生理条件下，铁以氧化铁的形式在细胞内储存，并自然形成赤铁矿（Fe₂O₃）和针铁矿（(Fe³⁺)₂O₃•0.5H₂O）⁵。这些反应生成的氢氧化物，....

方案

1. 植物材料与生长条件

1. 在装有标准盆栽培养基的 5 cm × 5 cm 花盆中，每盆播种一粒烟草（品种 Samsun）。将花盆置于托盘上，在长日照条件（16/8 小时光照/黑暗）、恒温 23 °C 的生长室中培养。用自来水浇灌，直至水从花盆底部排出。
2. 播种后约 50±5 天，根据实验所需浓度开始在浇灌水中添加铁处理。例如，我们使用了 0 至 6 mM 范围内的铁浓度，并添加可溶性铁螯合剂（Fe EDDHA）。每隔两天用相应的溶液浇灌一次（以避免脱水），持续 6–8 天。

2. 准备用于铁含量测定的叶片

注意事项：所有待使用的材料必须为无铁材料，以降低铁污染的风险. 使用4% HCl溶液将研钵和研杵各清洗两次，每次用滤纸擦干后再使用。若任何材料需重复使用，亦须用4% HCl溶液清洗两次，并每次用滤纸擦干。

1. 用手（戴手套操作，不得使用任何金属器械）将叶片从茎上剥离。每个样品使用约 10 g 叶片（鲜重）。使用喷雾瓶以重蒸水（DDW）清洗每片叶片。此步骤至关重要，可避免铁（Fe）污染。
2. 将叶片在纸巾上擦干后放入纸袋中。将纸袋转移至恒温 80 °C 的烘箱中干燥 2–3 天。
3. 干燥后，使用研钵和研杵将叶片研磨成粉末，并转移至无菌的 15 mL 塑料离心管中。

结果

若正确执行本方案，亚铁氰化钾法与原子光谱法所得结果之间应具有良好的相关性。因此，亚铁氰化钾法可简便地用于准确测定植物样品中的铁浓度，如下述实验所示。

烟草植株按所述方案培养，并用含有不同铁浓度（0、1、2、3、4、5 或 6 mM）的水灌溉，持续 7 天。随后收获植株，清洗后于 3 天内干燥 80 °C. 接下来的步骤（即， 按照方案第2.3步所述进行操作。由于对照管的灰重差异小于1%，该数值未纳入后续计算。

采用火焰原子吸收光谱法（FAAS）测定铁浓度。表1展示了这些测量的代表性结果。根据21个样品（7个浓度，每个浓度3个重复）获得的数据绘制了标准曲线。

讨论

测定植物组织中的铁含量对于评估灌溉或其他环境条件的影响非常重要。本文介绍了一种简便且准确的比色法，用于检测烟草叶片中的铁（Fe）含量，该方法可轻松适用于其他植物种类和组织。

在优化比色法的实验条件时，我们采用低pH环境（pH < 1.0）以确保铁的溶解性。燃烧过程的目的是释放样品中所有形态的铁，并确保样品中可能存在的任何污染物不会影响实验结果。关于铁污染问题，应注意到地壳中有6.7%由氧化铁类物质（FeO_n）组成²¹，其在植物干重中的含量可达0.009%²²。因此，必须考虑污染风险，因为灰尘中的铁含量可能高达3-7%（依地区而异）²³，会对结果产生显著影响。此外，必须仔细核查实验中使用的所有设备的铁含量，并采取一切必要预防措施以避免污染。建议使用4% HCl溶液清洗所有曾暴露于空气或需重复使用的实验器材。应完全避免使用任何金属工具（如剪刀或勺子），而改用玻璃或塑料制品。例如，在步骤3.1和4.1中已特别强调了防.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
六氰合铁(II)酸钾	Fisher Chemical	14459-95-1	普鲁士蓝反应试剂
密理博注射器滤器单元，瓶口通气式，0.22 μm	Millec	SLGP033RS	用于过滤灰分与4% HCl溶液的混合物
闪烁计数瓶	Fisherbrand	03-337-4	在燃烧过程中用于盛装干燥的植物粉末材料
一次性注射器 10 ml	Medi-Plus	1931	过滤过程中使用的注射器
盐酸	Sigma-Aldrich	231-595-7	用于配制4% HCl溶液，以稀释灰分并清洗材料
Tobacco, Nicotiana tabacum cv. Samsun NN	由Simon Barak教授提供，在Zaccai实验室中常规使用	Barak S, Nejidat A, Heimer Y, Volokita M. 烟草幼苗中乙醇酸氧化酶基因的转录及转录后调控. 植物分子生物学. 2001年3月1日;45(4):399-407.	本实验方案中使用的烟草品种
玻璃棉（矿棉）	Sigma-Aldrich	659997-17-3	用于样品在炉中燃烧的步骤