一种测定植物中铁含量的比色法

摘要

我们介绍一种利用比色普鲁士蓝法测定植物组织中铁含量的简单且可靠的实验方案。

摘要

铁是生物体中最重要的微量元素之一，参与呼吸作用和光合作用等基本生理过程。所有生物体内的铁含量均较低，在植物中约占干重的0.009%。迄今为止，测定植物组织中铁浓度最准确的方法之一是火焰吸收原子光谱法。然而，该方法耗时较长、成本较高，且需要特定设备，而这些设备在大多数植物学实验室中并不常见。因此，亟需一种更简便且准确的方法，可用于常规检测。普鲁士蓝比色法通常用于动物和植物组织切片中铁的定性染色。在本研究中，我们对普鲁士蓝法进行了改进，使其适用于烟草叶片中铁含量的定量测定。我们通过原子光谱法和普鲁士蓝染色法对同一样品中的铁含量进行测定，以验证该方法的准确性，结果表明两种方法之间具有良好的线性回归关系（R² = 0.988）。我们得出结论：普鲁士蓝法用于植物组织中铁的定量测定具有精确、简便和低成本的优点。然而，由于样品与试剂之间可能存在物种特异性的相互作用，本文建立的线性回归关系可能不适用于其他植物种类。因此，针对不同植物物种需分别建立相应的回归曲线。

引言

铁（Fe）是所有生物体中一种重要的微量元素。在植物中，由于铁参与呼吸作用、光合作用和叶绿素生物合成等基本生理过程，因此是一种必需的微量元素¹。游离铁离子的过度积累会对植物细胞造成伤害，因其可引发产生自由基的反应，导致氧化应激。为维持植物细胞内的铁稳态，铁离子被储存于液泡中，并被隔离在铁蛋白（ferritin）内；铁蛋白是一种直接参与铁稳态调控的蛋白质笼状结构，也是所有生物体中铁的主要储存形式²。与此同时，缺铁性贫血影响着全球大量人口，导致人们对植物铁生物强化的需求日益增加。由于植物铁蛋白具有独特的性质，利用铁蛋白结合铁进行食品强化，为解决这一营养不良问题提供了有前景的策略³。

铁离子主要以两种氧化态存在，即亚铁（二价 Fe²⁺ 或铁(II)）和高铁（三价 Fe³⁺ 或铁(III)）形式。细胞中还存在其他一些铁的形式，例如铁簇⁴。在生理条件下，铁以氧化铁的形式储存在细胞内，自然形成赤铁矿（Fe₂O₃）和针铁矿（(Fe³⁺)₂O₃•0.5H₂O）⁵。这些反应生成的氢氧化物，尤其是三价铁形式，溶解度极低。因此，铁的保留受溶液pH值的影响，在pH高于5时主要呈固态⁶。

鉴于铁（Fe）的溶解度较低且反应活性较高，其在植物组织和器官间的转运必须依赖合适的螯合分子。此外，还需调控其亚铁（ferrous）与高铁（ferric）形态之间的氧化还原状态¹。在叶片中，约80%的铁存在于光合细胞中，因其在电子传递系统、细胞色素、叶绿素及其他血红素分子的生物合成，以及Fe-S簇的形成过程中发挥着关键作用⁷。当细胞内铁含量过高时，多余的铁会被转运至液泡中，并储存在铁蛋白（ferritin）分子内⁸。

植物组织中的铁含量可通过多种方法测定，包括火焰原子吸收光谱法⁹（FAAS）或比色分析法¹⁰，其中前者的精确度远高于后者。火焰原子吸收光谱法是一种高度准确的技术，可根据样品中各元素的电磁辐射来确定其元素组成。FAAS通过火焰加热将样品中的金属离子转化为原子态，使离子激发，当特定离子回到基态时会发射出特定波长的光。不同离子的发射光经单色器分离后，由吸收传感器检测¹¹。因此，FAAS可用于直接定量铁的浓度。然而，也存在其他用于生物组织中铁可视化的方法。电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）¹²是一种测定铁及其他微量元素的高精度技术，但FAAS和ICP-MS设备的缺乏是常见问题。另一方面，硫氰酸盐比色法¹³测定铁的精确度较低，难以检测样品间微小的差异。普鲁士蓝染色法^14,15,16,17是一种间接方法，基于亚铁氰化钾（K₄Fe(CN)₆）与Fe阳离子反应生成强烈的蓝色物质，常用于动物和植物组织切片中铁的定性检测。

在岩石圈中，金属态（零价）铁极为罕见。环境中游离态铁离子的主要存在形式主要取决于周围环境中的氧气含量：在缺氧环境中，亚铁离子（Fe²⁺）相对更丰富；而在有氧环境中，则以高铁离子（Fe³⁺）为主。在强酸性环境中，高铁离子同样占主导地位，尽管在缺氧和酸性条件下促使亚铁氧化的成因因素通常有所不同¹⁸。当铁在有氧环境下溶于4% HCl（pH 0）时，稀释后的铁主要以高铁形式（Fe³⁺）存在^19,20。

Fe离子与K₄Fe(CN)₆之间的反应如下：

Fe³⁺：FeCl₃ + K₄Fe(CN)₆ = KFe(III)Fe(II)(CN)₆¯ + 3KCl

Fe²⁺：4 FeCl₂ + 2 K₄Fe(CN)₆ = Fe₄(Fe(CN)₆)₂ + 8 KCl

在本研究中，我们探讨了普鲁士蓝染色法是否可用于测定溶液中的铁含量。

首先，我们验证了水溶液中Fe浓度与普鲁士蓝染色之间的相关性。通过原子光谱法以及加入普鲁士蓝后测定吸光度（OD），分别测量了水溶液中Fe（以FeCl₂、FeCl₃或两者1:1混合物形式）的浓度。图1展示了每种方法所获得测量值的线性回归曲线。我们得出结论：普鲁士蓝法可用于溶液中铁浓度的定量分析。

图 1：通过火焰原子吸收光谱法（FAAS）测得的铁浓度与普鲁士蓝法测得的光吸收度（OD，715 nm）之间的线性回归关系。 蓝色方块及对应直线代表 Fe²⁺ 溶液，红色方块及对应直线代表 Fe³⁺ 溶液，黑色方块及对应直线代表 Fe²⁺ 与 Fe³⁺ 的 1:1 混合溶液。获得的回归方程如下：[Fe²⁺] = 3 + 123 × OD，r = 0.996，R² = 0.989；[Fe³⁺] = 1 + 292 × OD，r = 0.999，R² = 0.997；以及 [Fe^2+/3+] = 11 + 146 × OD，r = 0.983，R² = 0.956。Fe²⁺ 来源于 FeCl₂，Fe³⁺ 来源于 FeCl₃。请点击此处查看该图的放大版本。

为了将比色普鲁士蓝法改进用于植物组织中铁含量的定量分析，通过火焰吸收原子光谱法和普鲁士蓝染色法测定了烟草叶片灰分中的铁含量。两种技术所得结果具有良好的相关性。

方案

1. 植物材料与生长条件

1. 在装有标准育苗基质的 5 cm × 5 cm 花盆中，每盆播种一粒烟草（品种 Samsun）。将花盆置于托盘上，在生长室中于长日照条件（16/8 小时 光照/黑暗）和恒温 23 °C 下培养。用自来水浇灌，直至水从花盆底部排出。
2. 播种后 50±5 天，根据实验所需浓度开始在灌溉水中添加铁处理。例如，我们使用了 0 至 6 mM 范围内的铁浓度，并添加可溶性铁螯合剂（Fe EDDHA）。每隔两天用相应的溶液灌溉一次（以避免脱水），持续 6–8 天。

2. 准备用于铁含量测定的叶片

注意事项：所有待使用的材料必须不含铁，以降低铁污染的风险。 使用前，用4% HCl溶液将研钵和研杵清洗两次，每次用滤纸擦干。若重复使用任何材料，需用4% HCl溶液清洗两次，并用滤纸擦干。

1. 用手戴手套将叶片从茎上剥离（不要使用任何金属器械）。每个样品使用约 10 g 叶片（鲜重）。使用喷雾瓶以双蒸水（DDW）清洗每片叶片。此步骤对于避免铁污染至关重要。
2. 将叶片在纸巾上擦干后放入纸袋中。将纸袋转移至恒温 80 °C 的烘箱中，干燥 2–3 天。
3. 干燥后，用研钵和研杵将叶片研磨成粉末，并转移至无菌的 15 mL 塑料离心管中。

3. 将叶片燃烧成灰烬

注意事项：使用低pH值（接近0）的HCl溶液旨在提高铁的溶解度。岩棉用于防止燃烧过程中气体从样品瓶中逸出。

1. 称取一个未开封的 20 mL 闪烁瓶（不带瓶盖）的重量。记录该数值，或使用去皮按钮将数值归零。将粉碎后的干燥叶片（样品）加入瓶中。
2. 称量样品与容器的总重量并记录数值。用石棉棉塞住瓶口。
3. 另称量 3 个未加样品的空瓶并记录其重量。这些瓶子将作为对照，用于评估石棉棉可能引起的任何增重。
4. 将样品瓶和对照瓶放入马弗炉中，并按以下温度程序开始灼烧：室温，快速升温至 425 °C，最后在 425 °C 下持续灼烧 4 小时。此时，干燥叶片应已完全转化为灰分。
5. 让样品冷却至约 100 °C，但不得低于此温度，以便进行接下来的两个步骤，避免因吸湿而影响最终样品重量。戴上耐高温手套，用镊子夹住瓶身外壁，将样品从马弗炉中取出。
6. 将瓶子放置在平坦表面上，移除石棉棉，并用原瓶盖盖紧瓶口。
7. 称量 3 个对照瓶（见步骤 3.3），计算其平均增重量。若增重量等于或超过灰分重量的 1%（见步骤 4.2），则将该值作为测量误差的估计值。

4. 准备灰烬以测定铁含量

注意事项：初始样品中最终的铁浓度计算方法为，将灰化后所得灰分的重量除以加入的盐酸体积。

1. 通过将12.5 mL的37%浓盐酸原液加入87.5 mL的去离子水（DDW）中，配制1 M HCl溶液（4% HCl）（使用塑料或玻璃烧瓶）。
2. 称量一个15 mL塑料离心管的重量，并记录该数值，或使用去皮键将读数归零。将灰分转移至该离心管中，再次称重并记录数值。此即为灰分重量。
3. 向灰分中加入5 mL的1 M HCl溶液。使用22 µm滤膜过滤灰分溶液，并通过同一滤膜再加入额外的5 mL 1 M HCl溶液。
4. 最终体积应为10 mL。注意：部分溶液会在过滤过程中损失。
   注意：样品现已准备好，可通过火焰原子吸收光谱法（FAAS）或普鲁士蓝法进行铁（Fe）含量测定。
5. 针对每种植物物种，利用原子光谱法和普鲁士蓝法测得的铁浓度绘制标准曲线（见图4）。此后，可单独使用普鲁士蓝法测定铁浓度。

5. 采用火焰原子吸收光谱法测定铁浓度

1. 从每个样品中取出 4 mL，用于火焰原子吸收光谱法（FAAS）测定。
2. 将 FAAS 测定得到的结果除以灰分的重量，再将所得数值除以 0.01（因为灰分溶于 10 mL 溶液中）。最终结果即为每克灰分中的铁浓度（ppm）。

6. 配制普鲁士蓝染色液

1. 通过将 4 g K₄Fe(CN)₆ 加入 100 mL 去离子水中并涡旋振荡，配制 4% 普鲁士蓝溶液（可根据不同需求使用其他体积和/或浓度）。需要注意的是，本研究中使用的普鲁士蓝溶液浓度低于先前报道的浓度（20%）¹⁴。
2. 将溶液置于 4 °C 避光保存直至使用。在此条件下储存，溶液可稳定保存 6 个月。

7. 使用 FAAS 结果为普鲁士蓝法生成校准曲线

注意：使用以下公式计算灰分中的铁浓度
             公式 1
C：浓度，V：样品体积，W：灰分重量（g）。

1. 取0.50 mL普鲁士蓝溶液与0.50 mL 1 M HCl混合，作为空白溶液。
2. 用移液器将0.5 mL样品（按第3节所述用4% HCl处理的灰分）与0.5 mL普鲁士蓝溶液（步骤6.1）混合。静置至少1分钟，但不超过5分钟。5分钟后，样品将开始发生沉淀。
3. 将混合液转移至比色皿中，使用分光光度计在715 nm处测定吸光度（OD），并记录数值。
4. 将测得的吸光度值（步骤7.3）除以样品的灰分重量（步骤3.2）。所得结果表示每克灰分的吸光度（OD/g灰分）。
5. 以火焰原子吸收光谱法（FAAS）测得的铁浓度为纵坐标（Y轴），以吸光度值为横坐标（X轴），绘制线性回归曲线。使用步骤5.2和7.4中获得的结果，计算回归方程Y = a + bX，其中Y代表铁浓度，a代表吸光度截距，b代表吸光度斜率，X代表吸光度（OD）。

8. 使用普鲁士蓝法测定同种植物其他样品中的铁含量

注意事项：由于此类植物的校准曲线已经建立，因此可直接使用线性回归公式计算同类型植物新样品中的铁浓度。

1. 执行第3和第4节的步骤，然后执行步骤7.1至7.4。
2. 使用线性回归所得公式（步骤7.5）计算溶液中的铁浓度。

结果

当本实验方案正确执行时，普鲁士蓝法与原子光谱法所得结果之间应具有良好的相关性。因此，普鲁士蓝法可被简便地用于准确测定植物样品中的铁浓度，如下述实验所示。

烟草植株按所述方案培养，并用含有不同铁浓度（0、1、2、3、4、5 或 6 mM）的水灌溉，持续 7 天。随后收获植株，清洗后于 80 °C 下干燥 3 天。接下来的步骤（即， 按照方案第2.3步所述操作。由于对照管的重量与灰重差异小于1%，该数值未纳入后续计算。

采用火焰原子吸收光谱法（FAAS）测定铁浓度。表1展示了这些测量的代表性结果。根据21个样品（7个浓度，每个浓度3个重复）获得的数据绘制了标准曲线。

讨论

测定植物组织中的铁含量对于评估灌溉或其他环境条件的影响非常重要。本文介绍了一种简便且准确的比色法，用于检测烟草叶片中的铁（Fe）含量，该方法可轻松适用于其他植物种类和组织。

在优化比色法的实验条件时，我们采用低pH环境（pH < 1.0）以确保铁的溶解性。燃烧过程的目的是释放样品中所有形态的铁，并确保样品中可能存在的任何污染物不会影响实验结果。关于铁污染问题，应注意到地壳中有6.7%由氧化铁类物质（FeO_n）组成²¹，其在植物干重中的含量可达0.009%²²。因此，必须考虑污染风险，因为灰尘中的铁含量可能高达3-7%（依地区而异）²³，会对结果产生显著影响。此外，必须仔细核查实验中使用的所有设备的铁含量，并采取一切必要预防措施以避免污染。建议使用4% HCl溶液清洗所有曾暴露于空气或需重复使用的实验器材。应完全避免使用任何金属工具（如剪刀或勺子），而改用玻璃或塑料制品。例如，在步骤3.1和4.1中已特别强调了防...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
六氰合铁(II)酸钾	Fisher Chemical	14459-95-1	普鲁士蓝反应试剂
密理博注射器滤器单元，瓶口通气式，0.22 μm	Millec	SLGP033RS	用于过滤灰分与4% HCl溶液的混合物
闪烁计数瓶	Fisherbrand	03-337-4	在燃烧过程中用于盛装干燥的植物粉末材料
一次性注射器 10 ml	Medi-Plus	1931	过滤过程中使用的注射器
盐酸	Sigma-Aldrich	231-595-7	用于配制4% HCl溶液，以稀释灰分并清洗材料
Tobacco, Nicotiana tabacum cv. Samsun NN	由Simon Barak教授提供，在Zaccai实验室中常规使用	Barak S, Nejidat A, Heimer Y, Volokita M. 烟草幼苗中乙醇酸氧化酶基因的转录及转录后调控. 植物分子生物学. 2001年3月1日;45(4):399-407.	本实验方案中使用的烟草品种
玻璃棉（矿棉）	Sigma-Aldrich	659997-17-3	用于样品在炉中燃烧的步骤