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超灵敏单分子阵列数字酶联免疫吸附测定法的开发与验证：用于人干扰素-α

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DOI：

10.3791/57421

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2018年6月14日

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1Immunobiology of Dendritic Cells, Institut Pasteur, 2INSERM U1223, 3Laboratory of Neurogenetics and Neuroinflammation, INSERM UMR1163, Institut Imagine, 4MRC Human Genetics Unit, MRC Institute of Genetics and Molecular Medicine, University of Edinburgh, 5Manchester Centre for Genomic Medicine, University of Manchester

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种单分子阵列数字ELISA检测方法的开发与验证方案，该方法可实现对人源样本中所有干扰素-α亚型的超灵敏检测。

摘要

本方案的主要目的是描述一种干扰素（IFN）-α单分子阵列数字酶联免疫吸附测定法（ELISA）的开发与验证过程。该系统能够以前所未有的灵敏度定量人IFN-α蛋白，且对其他类型的IFN无交叉反应性。

该实验方案的第一个关键步骤是选择抗体对，随后将捕获抗体与磁性微珠偶联，并对检测抗体进行生物素标记。在此之后，可对检测配置、检测抗体浓度和缓冲液组成等不同参数进行优化，直至达到最佳灵敏度。最后，通过评估方法的特异性和重复性，以确保结果的可靠性。在此，我们开发了一种干扰素-α（IFN-α）单分子阵列检测方法，利用从患有自身免疫调节蛋白（AIRE）双等位基因突变导致的自身免疫性多内分泌腺病综合征1型/自身免疫性多内分泌腺病-念珠菌病-外胚层营养不良（APS1/APECED）患者中分离出的高亲和力自身抗体，实现了0.69 fg/mL的检测下限。重要的是，这些抗体能够检测全部13种IFN-α亚型。

这一新方法首次实现了在阿摩尔浓度下对人源生物样本中干扰素-α蛋白的检测与定量。该工具在监测人体健康与疾病状态下（尤其是感染、自身免疫和自身炎症）这种细胞因子的水平方面将具有重要应用价值。

引言

I型干扰素（Type I IFNs）是一类在协调抗病毒免疫反应中发挥核心作用的细胞因子。60年前，Isaacs和Lindenmann首次发现了这类分子1,2。目前研究已知，这一异质性多肽家族包含14个不同的亚类（13种IFN-α亚型和1种IFN-β）。I型干扰素对于清除病毒感染至关重要，但也被发现参与多种人类疾病状态的病理过程，包括系统性红斑狼疮（SLE）、幼年型皮肌炎（JDM）等自身免疫性疾病，以及一类称为I型干扰素病（type I interferonopathies）的疾病，其特征是持续性的I型干扰素信号激活导致病理改变3,4,5,6,7。

自Ⅰ型干扰素（type I IFN）最初被鉴定为一种"干扰物质"1,2以来，在生物样本中研究其蛋白水平一直具有挑战性。目前，夹心法酶联免疫吸附测定（sandwich Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA）是检测IFN-α蛋白最常用的方法。尽管该方法具有特异性强、操作简便和快速的优点，但Ⅰ型IFN ELISA仍存在重要局限性，例如灵敏度有限。此外，要检测所有IFN-α亚型，需要使用多种不同的检测方法，每种方法都有其各自的检测能力和灵敏度。虽然市面上已有可检测不同IFN-α亚型的商业ELISA试剂盒，但其灵敏度较低（分别为1.95 pg/mL、12.5 pg/mL和12.5 pg/mL），通常不足以在生物样本中检测到IFN-α蛋白。为克服这一局限，已开发出多种生物学替代检测方法，通过测量Ⅰ型IFN诱导的基因表达或功能活性来间接定量8,9,10,11,12,13,14。然而，这些方法并不能直接测量IFN-α蛋白水平。

本研究采用单分子阵列数字ELISA技术，开发了一种用于检测单个IFN-α蛋白分子的检测方法。数字ELISA与传统ELISA使用相同的基本化学原理，但反应发生在由50,000个独立的46飞升级微孔组成的阵列中15,16。单个蛋白分子首先被抗体包被的顺磁性微珠捕获，并由生物素标记的检测抗体进行标记，随后结合酶偶联物链霉亲和素-β-半乳糖苷酶（SBG）。然后，将微珠与荧光酶底物间苯二酚-β-D-半乳糖吡喃苷（RGP）混合，分散至单分子阵列中。通过将反应体积缩小20亿倍17，可实现荧光信号的高局部浓度，从而使单分子计数成为可能，因为每个分子产生的信号现在均可被可靠检测18。本质上，单分子阵列能够对单个免疫复合物进行计数，并确定每个微珠上的平均酶分子数（AEB）。通过对检测到信号的微孔进行计数，可实现蛋白分子的定量和数字化，因为蛋白浓度与免疫复合物微珠数和存在于飞升级微室中的总微珠数之间的比值呈直接相关关系。

Yeung et al. 采用九种不同技术平台和四种细胞因子免疫测定方法，开展了一项广泛的跨平台评估研究，旨在比较不同平台在检测精密度、灵敏度及数据相关性方面的表现19。该研究的关键发现之一是，单分子阵列和单分子计数免疫测定在人血清中细胞因子的检测灵敏度最高，可达到亚皮克/毫升（sub-pg/mL）浓度范围。单分子阵列数字ELISA细胞因子检测已被用于研究TNF-α和IL-6在克罗恩病中的作用20，IFN-α在干扰素病和自身免疫性疾病患者中的作用7，以及在慢性肝炎患者和接受西格列汀治疗的健康供者中C-X-C基序趋化因子10（CXCL10）不同翻译后修饰形式的变化21,22。其他应用包括检测糖尿病视网膜病变患者的视紫红质水平23；通过血清/血浆中神经丝轻链蛋白24 和淀粉样蛋白-β 1-42肽25的测定，分别研究多发性硬化和阿尔茨海默病中的脑部病理变化。单分子阵列检测还可用于提高病原体检测能力，例如HIV病毒储存库的表征26，以及DNA27和微小RNA（micro RNAs）28的检测。单分子阵列技术的一大优势在于其高度的多功能性，只要存在特异性的抗体对，即可针对任何目标分析物开发相应的检测方法。此外，目前已有商用的自研试剂盒（homebrew assay kits），可用于新检测方法的开发，其具体操作流程将在下文以修改后的形式详细描述。

本文详细描述了一种单分子阵列检测方法的开发与验证步骤，该方法显著提高了对IFN-α蛋白检测的灵敏度。用于单分子阵列检测的抗体应具有高度特异性，避免与相关蛋白发生交叉反应（若涉及，需考虑物种特异性）。理想情况下，应选择亲和常数（KD）小于10-9 M的抗体；高亲和力可确保强结合能力，从而产生更强的信号。抗体与抗原结合的动力学特性同样重要，较快的结合速率（Kon）和较慢的解离速率（Koff）有利于抗原-抗体复合物的形成。若起始使用的抗体对在经典ELISA中表现良好，检测限（LOD）为1–100 pg/mL，则更有可能获得高灵敏度的单分子阵列检测方法。Chang及其同事对每一步生物分子相互作用进行了详细的动力学研究，并提出了一组用于预测分析灵敏度的方程18。他们证明，单分子阵列数字ELISA在较宽的抗体亲和力范围（KD~10−11 –10−9 M）内均有效，且信号生成更依赖于抗体的结合速率（on-rate）。

为了利用高亲和力抗体，我们采用了从患有人工腺体病综合征1型/自身免疫性多腺体综合征-念珠菌病-外胚层营养不良症（APS1/APECED）患者中分离得到的抗体29。出于目前尚未明确的原因，绝大多数AIRE缺陷个体都会产生一组针对所有IFN-α亚型的高亲和力抗体29。我们从中选择了两种对不同IFN-α亚型具有互补结合亲和力的抗IFN-α抗体克隆，其亲和力通过IC50值进行评估。将这些独特的高亲和力抗体与单分子阵列技术相结合，可直接定量检测阿摩尔（fg/mL）浓度水平的IFN-α。这种超灵敏的IFN-α蛋白检测方法将有助于更深入地理解在不同疾病状态下IFN诱导反应的性质、调控机制及其生物学影响。

方案

1. 抗体的选择

  1. 开始实验方案前，请仔细查阅所有关键步骤（表1），并选择最适抗体。
    注意：本实验方案选用高亲和力抗IFN-α抗体，其IC50值见表2。建议优先选择在常规ELISA中表现良好的抗体组合。

2. 捕获抗体与磁珠的偶联及不同浓度的测试

注意：抗体偶联过程中，始终将磁珠偶联缓冲液（BCB）和磁珠洗涤缓冲液（BWB）置于冰上。

  1. 捕获抗体缓冲液置换
    1. 取初始量的抗IFN-α抗体A，用于测试3种不同的磁珠偶联比例（0.038 mg/mL、0.075 mg/mL 和 0.3 mg/mL）。
      注：若检测背景信号较高，较低的抗体包被浓度可能更有利。初始抗体用量应考虑缓冲液置换过程中约30%的损失。根据制造商说明书，为降低初始背景，曾测试0.05 mg/mL、0.1 mg/mL 和 0.3 mg/mL 的浓度，但由于上述缓冲液置换过程中的变量损失，实际浓度往往难以精确达到这些数值。
    2. 将所需体积的抗体与BCB一同加入滤柱中，总体积不超过500 µL。
    3. 在>10,000 x g 条件下离心5分钟，弃去滤过液。
    4. 加入总共450 µL的BCB洗涤滤柱两次，每次均在>10,000 x g 条件下离心5分钟，弃去滤过液。
    5. 将含有抗体的滤柱倒置放入洁净的微量离心管中（滤柱开口朝下，面向新管内部），在800 x g 条件下离心1分钟。
      注：此步骤可收集经纯化的抗体。本步骤无需添加缓冲液。
    6. 用50 µL BCB洗涤膜，操作同2.1.5，在800 x g 条件下离心1分钟。
    7. 使用微量分光光度计测定抗体浓度。
    8. 加入BCB以达到目标抗体浓度，并记录最终体积。
      注：后续方案以200 µL体积为例进行描述，该体积记为2体积（2V）。所有后续试剂体积均按此比例调整。
    9. 涡旋混匀后置于冰上保存。
  2. 顺磁珠制备
    1. 将2.8 x 108个磁珠（100 µL = 1V）转移至微量离心管中。
      注：磁珠体积取决于2.1.8步骤中获得的最终体积。
    2. 瞬时离心后，置于磁力架上1分钟，弃去上清稀释液，从磁力架上取下管子。
    3. 加入2V的BWB，涡旋5秒。
    4. 用BWB重复步骤2.2.2和2.2.3两次，再用BCB重复两次。
    5. 每1V磁珠加入190 µL BCB，涡旋5秒，瞬时离心，将洗涤后的磁珠置于冰上保存。
  3. 磁珠活化
    1. 向10 mg的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）冻干瓶中加入1 mL冷BCB，涡旋至溶液均匀。
    2. 每1V磁珠加入10 µL冷的稀释EDC至洗涤后的磁珠中，涡旋混匀，在室温下以1,000 rpm振荡30分钟。
      注：由于EDC在水溶液中不稳定，EDC的配制和加入应尽快完成。此外，由于EDC具有高反应活性，必须在加入EDC前确保磁珠悬浮均匀，以避免磁珠活化不均。EDC加入后，磁珠必须保持悬浮状态。
  4. 抗体与磁珠偶联
    1. 涡旋并瞬时离心活化后的磁珠，将其置于磁力架上1分钟，弃去BCB上清液，从磁力架上取下管子。
    2. 用2V的BCB洗涤磁珠，涡旋，瞬时离心，再置于磁力架上1分钟，弃去BCB缓冲液，从磁力架上取下管子。
    3. 迅速将200 µL（2V）经缓冲液置换并冷藏的抗体加入活化磁珠中。
    4. 涡旋混匀后，在室温下振荡2小时。
  5. 磁珠封闭与最终纯化
    1. 对包被抗体的磁珠悬液进行瞬时离心，置于磁力架上1分钟，将上清液转移至新管中，使用微量分光光度计测定浓度。
      注：此步骤可判断磁珠是否饱和——任何高于零的数值均表明磁珠未完全饱和，因为未结合到磁珠上的可溶性抗体浓度可被检测到。
    2. 将偶联磁珠从磁力架上取下，加入2V的BWB，涡旋5秒，瞬时离心，再置于磁力架上1分钟。
    3. 将上清液转移至新管中，使用微量分光光度计测定浓度。
      注：此步骤可判断抗体是否稳定固定在磁珠上。若此上清液中检测到抗体浓度，表明抗体从磁珠上脱落，这种情况较为常见。即使仅有极少量捕获抗体仍附着在磁珠上，该检测仍可能有效。
    4. 将偶联磁珠从磁力架上取下，加入2V的BWB，涡旋5秒，瞬时离心，再置于磁力架上1分钟。
    5. 将偶联磁珠从磁力架上取下，加入2V的磁珠封闭缓冲液，涡旋5秒，在室温下振荡孵育30分钟。
    6. 用2V的磁珠稀释缓冲液洗涤抗体包被并封闭的磁珠3次，用BWS洗涤1次，再用磁珠稀释缓冲液洗涤2次（所有上清液均弃去）。
    7. 将包被并封闭的磁珠用2V磁珠稀释缓冲液悬浮，4°C保存备用。
      注：使用前，必须用检测器/样本稀释液对磁珠进行一次洗涤，洗涤液体积为250 × 磁珠体积 / 20，使用磁力架进行分离。

3. 检测抗体生物素标记

  1. 检测抗体缓冲液置换
    1. 取两种抗 IFN-α 抗体克隆各 260 µg。
      注：此用量已考虑缓冲液置换过程中约 30% 的损失，并允许测试两种不同的生物素/抗体比例。
    2. 使用生物素化反应缓冲液（BRB）代替 BCB，操作步骤同 2.1。
    3. 测定抗体体积和浓度，并调整体积使最终浓度达到 1 mg/mL。
      注：此为建议起始浓度，若检测灵敏度未达要求，可进一步优化。
  2. 检测抗体生物素标记
    1. 将 N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇4-生物素（NHS-PEG4-Biotin）恢复至室温，加入共 400 µL 蒸馏水，配制成 3.4 mM 的溶液。
    2. 确定待测试的生物素：抗体比例，并相应混合检测抗体与稀释后的生物素（60:1 的比例对应 100 µL 检测抗体与 4.5 µL 生物素）。
      注：初始建议测试 30:1 和 60:1 两种比例。
    3. 涡旋混匀抗体-生物素混合物，短暂离心后于室温孵育 30 分钟。
      注：无需震荡。
  3. 生物素化检测抗体纯化
    1. 将生物素化抗体转移至新的滤膜管中，按 2.1 步骤操作，使用 BRB 进行三次洗涤（体积分别为 400、450 和 450 µL），最后收集纯化产物。
    2. 测定纯化后生物素化检测抗体的体积和浓度，4 °C 保存备用。

4. 检测方法优化

注意：使用单分子阵列分析仪软件的自定义配置30。
单分子阵列分析仪由软件控制，该软件可用于运行检测标准化、执行样本定量、修改外部参数（如微珠、检测器、SBG、RGP浓度；样本稀释度等）和内部参数（步骤数、孵育时间等），以达到最佳检测条件，并可用于计算结果（背景值、检出限、定量值）。有关单分子阵列分析仪的设置以及每轮优化所需试剂体积的计算，请参阅制造商说明书。初始几轮优化请采用两步法配置进行。

  1. 测试捕获抗体偶联微球与生物素标记检测抗体在两种构型中的组合。
    1. 通过分析软件中选择适当的条件，测试三种不同浓度的抗 IFN-α A 捕获抗体与两种不同生物素化比例的抗 IFN-α B 检测抗体作为捕获和检测抗体的组合，反之亦然（图1）。
    2. 选择最敏感的组合，即提供最低检测限（LOD）的条件，并用于后续步骤。
      注意：图1 显示，当抗 IFN-α A 抗体微球浓度为 0.3 mg/mL，且抗 IFN-α B 抗体的生物素:抗体比例为 30:1 时，灵敏度最高，检测限（LOD）达到 11.6 fg/mL（见补充表1）。此组合将用于所有后续步骤。请注意，该检测方法在尚未进行任何优化循环前即已实现极高的灵敏度。

IFNα-2c 剂量反应曲线；酶活性；折线图；浓度比较；双重检测
图 1：抗体方向选择、磁珠上捕获抗体浓度及生物素化比例的优化。 测试了两种不同的抗体组合方式：一种使用抗 IFN-α A 作为捕获抗体、抗 IFN-α B 作为检测抗体（A），另一种则相反（B）。以 IFNα-2c 作为抗原。对两种组合方式均测试了不同捕获抗体浓度以及不同的生物素:抗体（B:A）比例。虚线表示最优条件下的检测限（LOD）；捕获抗体为抗 IFN-α A（0.3 mg/mL），生物素:检测抗体比例为 30 时达到最佳（LOD = 11.6 mg/mL，对应 AEB 值为 0.017265）。实验采用两步法检测模式。生物素:抗体（B:A）。 请点击此处查看此图的放大版本。

  1. 比较两步法与三步法配置。
    注意：在三步法配置中，包含三个不同的孵育步骤，分别为捕获抗体孵育、检测抗体孵育以及最后一步用于SBG酶标记的孵育。然而，在两步法配置中，捕获抗体和检测抗体与目标分析物同时孵育。
    1. 使用4.1.2中确定的捕获抗体和检测抗体浓度及比例，按照仪器制造商的操作说明30，在单分子阵列分析仪上分别运行预设的两步法和三步法配置。
    2. 选择能够实现最高灵敏度的配置，并在后续步骤中保持使用该配置
      注意：如图2和补充表2所示，对于所有测试浓度，两步法配置均表现出略高的灵敏度和信噪比。因此，后续步骤均采用两步法配置。

IFNα-2c 结合实验图，每珠酶活性与 IFNα-2c 浓度的关系，两步法与三步法比较。
图 2：两步法与三步法配置比较。 采用 0.3 mg/mL 的抗 IFN-α A 抗体作为捕获抗体，抗 IFN-α B 抗体作为检测抗体，在 30 生物素:抗体比例条件下评估两步法和三步法配置。以 IFNα-2c 作为抗原。在三步法条件下，包含三个不同的孵育步骤：第一个为捕获抗体孵育，第二个为检测抗体孵育，第三个为 SBG 酶标记步骤。而在两步法配置中，捕获抗体和检测抗体与目标分析物同时孵育。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 检测抗体和SBG浓度优化
    1. 按照上述方法30，测试三种不同浓度的检测抗体（0.1、0.3 和 0.6 µg/mL）与三种不同浓度的SBG（50、150 和 250 pM）的组合。
    2. 选择灵敏度最高的浓度组合，并在后续步骤中保持使用。
      注意：图3 显示，检测抗体浓度为0.3 µg/mL、SBG浓度为150 pM时，检测限（LOD）达到最优。该条件同时表现出较低的背景信号和适中的信号幅度，有利于获得良好的标准差（SD）值（补充表3）。检测抗体的典型浓度范围为0.1–1 µg/mL，SBG的典型浓度范围为50–200 pM，但在某些情况下可能需要更高浓度（例如，最高达300 pM）。应避免导致背景信号高于0.02 AEB的实验条件。增加检测用单克隆抗体（mAb）或SBG的浓度会同时增强信号响应和背景信号。然而，若信号的增幅超过背景的增幅，则检测限（LOD）将得以改善。在某些情况下，背景信号的降低有助于更好地区分低浓度标准品。

用于分子分析的IFNα17酶活性每珠剂量-反应曲线图。
图 3：检测抗体和SBG浓度的优化。 评估了三种不同浓度的生物素化检测抗体（0.1、0.3 和 0.6 µg/mL）与三种不同浓度的SBG（50、150 和 250 pM）。虚线表示最佳条件下的检测限（LOD）；检测抗体浓度为 0.3 mg/mL、SBG 为 150 pM 时，LOD = 0.09 mg/mL，对应的每珠酶活性（AEB）值为 0.017184。请点击此处查看此图的放大版本。

  1. 额外的优化步骤
    1. 如果尚未达到所需的灵敏度，请使用分析仪软件中的预设选项，测试各个步骤的不同孵育时间。
    2. 如果检测的灵敏度仍不足，请使用分析仪软件中的预设选项，优化每次检测所用的微球数量。
      注意：一旦开始对生物样本进行测试，样本体积将成为另一个可优化的参数。务必确保样本操作符合健康与安全规程。

5. 检测特异性和可重复性

  1. 通过使用不同的 IFN-α 亚型及其他相关蛋白测试该检测方法，验证 IFN-α 检测的特异性（图 4a 和 4b）。

显示每珠平均酶浓度、多个标记物、对数刻度的图表。
图 4：优化后的干扰素α单分子阵列检测的特异性和灵敏度。 (A) 检测了IFN-β、IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-ω和IFN-γ重组蛋白，以及(B) 16种IFN-α亚型，包括三种IFN-α2类型（IFN-α2a、IFN-α2b和IFN-α2c）。改编自Rodero et al. 2017。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 通过开展三次独立的重复实验并评估实验间变异性，来验证优化后检测方法的可重复性（图5）。
  2. 计算该检测方法的检测限
    注意：检测限通过三个空白样本的均值加3倍标准差（SD）计算得出，由此获得0.23 fg/mL的数值。由于标准品稀释倍数为1:3，计入稀释倍数后，检测限为0.69 fg/mL。

酶活性测定结果；IFNα浓度与酶/微珠平均值的关系图，多批次比较。
图5：优化后的广谱IFN-α单分子阵列检测方法的重复性。 使用两批不同的微珠进行了三次独立运行，其中第二批微珠进行了两次独立实验。每次测量均设双重复。虚线表示检测限（LOD），定义为所有运行中空白样本的每微珠平均酶信号加标准差（SD）。以IFN-α17作为参照，考虑到由此获得的标准曲线可代表其他所有IFN-α亚型，如图4b所示。图中显示了均值及标准差（误差棒）。各次运行的检测限用虚线表示：运行1：0.073 fg/mL AEB = 0.006238，运行2：0.113 fg/mL AEB = 0.007119，运行3：0.043 fg/mL AEB = 0.05518。改编自Rodero et al. 2017。 请点击此处查看该图的放大版本。

6. 蛋白质竞争实验

  1. 进行蛋白质竞争实验（如图6图注中所述），以进一步证明该检测方法的特异性。
    注：使用系统性红斑狼疮（SLE）患者血浆样本（n = 5）。
    1. 当怀疑生物样本中存在病毒时，向40 mL 检测剂/样本稀释液中加入200 µL 非离子型表面活性剂（0.5% Nonidet P40 替代物），充分涡旋混匀，配制灭活缓冲液。
    2. 将含有目标分析物的生物样本在4 °C条件下以10,000 g离心15分钟，以去除细胞碎片。
    3. 取185 µL 检测剂/样本稀释液或灭活缓冲液，加入100 µL 生物样本（最终稀释倍数为3）以及15 µL 抗IFN-α抗体A（初始浓度为1 mg/mL，最终浓度为50 µg/mL）或缓冲液。室温孵育30分钟。
    4. 按照上述方法，在单分子阵列分析仪中分别检测加入与未加入抗IFN-α抗体的样本。
      注：若信号饱和，应进一步稀释样本。此外，重复检测需要300 µL样本体积。

展示不同供体间每珠酶活性比较的柱状图，以对数尺度显示平均值。
图6：蛋白质竞争实验。 使用五位不同系统性红斑狼疮（SLE）患者样本进行竞争实验。生物样本在4 °C下以10,000 g离心15分钟，随后用含NP40用于病毒灭活的检测器/样本稀释液按1:3稀释。向总体积为300 µL的体系中加入15 µL抗IFN-α抗体A（初始浓度1 mg/mL，终浓度50 µg/mL）或缓冲液。在室温下孵育30分钟。对照组以灰色表示，经抗IFN-α A抗体处理的样本以黑色表示。图表显示均值及标准差（误差线）。虚线代表检测限（AEB = 0.024774，0.8037 fg/mL）。改编自Rodero et al. 2017 请点击此处查看此图的放大版本。

结果

综上所述，本研究建立了一种检测限为 0.69 fg/mL 的广谱 IFN-α 单分子阵列检测方法，该方法采用两步法，其中捕获微球包被浓度为 0.3 mg/mL 的抗 IFN-α A 抗体，检测抗体为生物素化抗 IFN-α B 抗体，其生物素-抗体标记比例为 30。生物素化检测抗体和链霉亲和素-β-半乳糖苷酶（SBG）的工作浓度分别为 0.3 µg/mL 和 150 pM。该检测方法具有高度特异性，可检测全部 13 种 IFN-α 亚型，且不与其他类型的干扰素发生交叉反应。因此，尽管无法单独识别和定量每一种 IFN-α 分子，但该方法可同时检测并测定所有 13 种亚型，获得代表全部 13 种不同亚类的总 IFN-α 浓度值。

为了探索这种新开发检测方法的潜在诊断价值，我们检测并比较了健康个体血浆和血清中的IFN-α蛋白水平与系统性红斑狼疮（SLE）和幼年皮肌炎（JDM）患者样本中的水平。如图7所示，与健康对照组相比，在两种疾病组中均检测到较高水平的IFN-α蛋白。虚线表示常规商用ELISA试剂盒的检测下限（LOD），说明尽管该细胞因子与这些表型已知相关，但传统方法无法在这些患者群体中检测到IFN-α蛋白。此外，该检测方法可在5个数量级范围内对IFN-α进行定量，显示出其宽广的动态范围，其可检测水平介于1 - 10 fg/mL之间，进一步证实了该方法的高度敏感性。

IFNα 浓度图；比较健康对照组、SLE 和 JDM 患者组的散点图，含数据分布分析。
图 7：患者队列血浆和血清中 IFN-α 蛋白的定量分析。 本图改编自 Rodero et al. 2017。使用全型 IFNα 单分子阵列检测法对健康对照者（n = 20）、系统性红斑狼疮（SLE）患者（n = 72）和幼年皮肌炎（JDM）患者（n = 43）的血浆样本进行了检测。组间分析采用单因素方差分析（Kruskal-Wallis 检验）及 Dunn 多重比较检验。图中显示中位数。虚线表示人源抗 IFN-α ELISA 参考方法的检测下限（1.95 pg/mL = 1950 fg/mL）。请点击此处查看该图的高清版本。

步骤注意事项参考文献
1. 抗体对的选择靶向不同表位表 2
高亲和力
快速 K在 慢钾关闭
2. 抗体对方向选择检测限最低的条件图1
3. 捕获抗体浓度
4. 生物素：检测抗体比例
5. 两步法与三步法配置选择信噪比最高的条件图2
6. 检测抗体浓度选择检测限最低的条件图3
7. SBG 浓度
8. 特异性评估交叉反应性图4
9. 灵敏度评估亚型识别（如适用）
10. 可重复性评估检测的变异性图5

表1：单分子阵列检测方法的开发与优化步骤概要。 本表总结了单分子阵列检测方法从初始抗体对的选择到重复性评估所需经历的各项开发与优化步骤。

抗原8H1 (A)12H5 (B)SifalimumabRontalizumab
IFNα128.351.346022.63
IFNα2256310.79.022.15
IFNα45.112.9935.35325.3
IFNα52.0119.693.292.49
IFNα664.73.034.97-
IFNα70.90.63233.1-
IFNα83020.8369110.86
IFNα102.540.7143.2-
IFNα1432242.114.520.9
IFNα161.8332.9959.1828.65
IFNα172.210.77890.923.86
IFNα212.7812.8717695.8

表2：泛α抗体选择。 使用干扰素刺激反应元件（ISRE）-荧光素酶中和实验测定的IC50（ng/mL）。表中显示了在单分子阵列实验中用于所有IFN-α亚型的单克隆抗体的IC50值。将10,000个HEK 293 MSR细胞接种于白色半面积96孔板中，并使用转染试剂按照制造商说明，用50 ng预混合的ISRE-萤火虫荧光素酶报告基因和海肾荧光素酶构建体进行反向转染。荧光素酶表达构建体作为内部归一化对照。细胞在含0.1 mM非必需氨基酸、1 mM丙酮酸钠、0.5%胎牛血清的低血清培养基中，于37 °C、5% CO2的湿润环境中孵育过夜。过夜孵育后，用含有重组人IFN-α混合物的培养基刺激细胞24小时，其中部分含有经37 °C预孵育1小时的抗IFN-α单克隆抗体或对照IgG，部分不含。刺激24小时后，按照制造商说明进行双荧光素酶报告基因检测。「-」未测定。Sifalimumab是一种全人源IgG1κ型单克隆抗体，可结合并中和大多数IFN-α亚型；Rontalizumab是一种靶向IFN-α的人源化单克隆抗体。改编自Meyer et al. 2016 和 Rodero et al. 2017。

补充表 1：抗体取向、磁珠上捕获抗体浓度及生物素化比例的选择。 测试了两种不同的构型：以抗 IFN-α A 为捕获抗体、抗 IFN-α B 为检测抗体（A），以及相反组合（B）。以 IFNα-2c 作为抗原。对两种构型均测试了不同的捕获抗体浓度以及生物素：抗体（B:A）比例。Sat. 表示饱和。橙色区域：用于计算检测限（LOD）的 AEB 值；这些浓度被视为空白值，因为 AEB 值保持稳定。LOD 的计算方法为：空白均值 + 3倍标准差。 请点击此处下载该文件。

补充表2：两步法与三步法配置的比较测试。 使用IFNα-2c作为抗原对两步法和三步法配置进行了评估。两种条件下的AEB值以及信号/背景比值（S/B）均在此列出。请点击此处下载该文件。

补充表3：检测抗体和SBG浓度优化。 评估了三种不同浓度的生物素化检测抗体（0.1、0.3 和 0.6 µg/mL）以及三种不同浓度的SBG（50、150 和 250 pM）。图中显示了九种测试条件下的AEB值。橙色：用于计算检测限（LOD）的AEB值；这些浓度被视为空白值，因为AEB值保持稳定。LOD的计算公式为：空白均值 + 3倍标准差（3SD）。请点击此处下载该文件。

补充表4：优化后的干扰素α单分子阵列检测的特异性和敏感性。 当检测干扰素-β、干扰素-λ1、干扰素-λ2、干扰素-ω和干扰素-γ重组蛋白（A），以及16种干扰素-α亚型（B）时，显示了每颗珠平均酶信号值。「-」表示未测定。请点击此处下载该文件。

补充表 5：优化后的干扰素α单分子阵列检测的重复性。 显示了三次独立实验的平均 AEB 值，最高浓度达 10.000 fg/mL。「-」表示未测定。饱和（Sat）。请点击此处下载该文件。

补充表6：蛋白质竞争实验。 显示了所有测试条件下每珠平均酶量。测量重复进行两次。 请点击此处下载该文件。

讨论

本文中，我们描述了一种高重复性、超灵敏的单分子阵列数字ELISA的开发与验证过程，用于直接定量人源样本中的IFN-α蛋白（步骤总结见表1）。在该检测方法的开发过程中，最关键的步骤之一是抗体配对的选择16，其动力学特性和表位结合特性是检测成功的关键。应避免使用针对相同表位或可能引起空间位阻的配对单克隆抗体。多克隆抗体可作为检测抗体以克服此类限制。若在任一步骤中未能达到理想灵敏度，应考虑进一步优化方案，包括更换不同的抗体配对，或调整蛋白类型（如BSA < 酪蛋白）、pH值（6.0–8.5）、离子强度、缓冲能力（如NaCl和磷酸盐浓度）、载体微珠，以及表面活性剂的有无等参数。在开发单分子阵列检测时，可优化的参数范围广泛。然而，总体而言，应优先选择能够产生高信号-背景比和最低检测限（LOD）的条件（参见图1、图2， 和图3）。

在特异性方面，IFN-α 检测方法对所测试的其他任何干扰素（β、γ、λ1、λ2、ω）均未显示交叉反应性（图4a），并能够检测全部13种IFN-α亚型（图4b）。然而，该检测方法对IFN-α2亚型的亲和力较低（图4b 和 补充表4）。有趣的是，还观察到不同IFN-α2类别（a、b、c）之间的敏感性差异，这可能是由于不同的生产工艺或氨基酸序列不同所致，因为这些IFN-α2亚型来自不同的商业供应商。除这一例外情况外，所有IFN-α物种均产生非常相似的反应信号。该检测方法的特异性进一步通过使用抗IFN-α A克隆抗体对样本进行预处理得以验证，该处理完全消除了检测信号（图6 和 补充表6）。

该技术的主要优势之一是，原则上可针对任何目标分析物16。此外，可检测多种不同的生物样本，例如血清、血浆、脑脊液、细胞裂解液、培养上清液31，甚至呼出气体32。通常需将血浆按1:3比例稀释，以避免单分子阵列分析仪发生潜在堵塞。然而，目标分析物在相关生物样本中的浓度可能极低，因此可能需要使用更高浓度的样本（取决于检测方法的灵敏度）33。尽管在保持高灵敏度的同时实现多重检测具有可行性34，但该过程更具挑战性，目前尚未开发出可在同一实验中检测超过6种蛋白质的检测方法35。

在如此低的浓度下检测并定量细胞因子及其他生物学相关蛋白质的能力，开辟了全新的应用领域33,36。众所周知，许多蛋白质即使在极低浓度下也能发挥其生物学效应，而这些浓度此前低于最灵敏ELISA方法的检测限37。尽管其他免疫测定技术相较于传统ELISA具有某些优势19，但本文表明，单分子阵列数字ELISA是一种可重复且稳健的平台，可用于人源样本中低浓度细胞因子的超灵敏检测。因此，该技术在生物标志物发现以及多种疾病的患者管理优化方面具有巨大潜力。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

DD 和 YJC 感谢法国国家研究局（ANR，项目 IFNX，编号 CE17001002）以及 ImmunoQure AG 提供单克隆抗体的支持。我们感谢 Brigitte Bader-Meunier、Nathalia Bellon、Christine Bodemer、Alex Belot、Isabelle Melki 和 Pierre Quartier 提供临床样本。YJC 感谢欧洲研究理事会（ERC，资助编号 GA 309449：授予 YJC 的研究员项目）以及由法国国家研究局管理的国家财政补贴。 "未来投资" 项目编号为 ANR-10-IAHU-01。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗干扰素-α 抗体 A（8H1 克隆）ImmunoQure AGNA未商业化供应
抗干扰素-α 抗体 B（12H5 克隆）ImmunoQure AGNA未商业化供应
抗干扰素-α 抗体 EBI-1 克隆eBioscienceBMS216C
抗干扰素-α 抗体 BMS216BK 克隆eBioscienceBMS216BK非 ELISA 试剂盒，仅为大量抗体
干扰素 α2ceBioscienceBMS305可用
干扰素 αI (17)PBL11150-1
干扰素 α2aPBL11100-1
干扰素 α2aPeproTech已不再供应
干扰素 α2bPBL11105-1
干扰素 α1PBL11175-1
干扰素 α4a (M1)PBL11177-1
干扰素 α4b (a4)PBL11180-1
干扰素 αB2 (a8)PBL11115-1
干扰素 αC (a10)PBL11120-1
干扰素 αD (a1)PBL11125-1
干扰素 αG (a5)PBL11135-1
干扰素 αF (a21)PBL11130-1
干扰素 αH2 (a14)PBL11145-1
干扰素 αJ1 (a7)PBL11160-1
干扰素 αK (a6)PBL11165-1
干扰素 αWA (a16)PBL11190-1
干扰素 λ1PeproTech300-02L
干扰素 λ2PeproTech300-02K
干扰素 ωPeproTech300-02J
干扰素 βPeproTech300-02BC
干扰素 γPeproTech300-02
抗干扰素-α ELISAPBL41115.1
96 孔板Corning3904
ISRE 报告基因系统QiagenCCS-008L
FuGENE HD 转染试剂PromegaE2311
Opti-MEM 低血清培养基ThermoFischer Scientific31985062
双荧光素酶报告基因检测PromegaE1910
Nonidet P40 替代物Sigma-Aldrich74385
分光光度计 NanoDrop 1000Thermo Scientific已不再供应
Amicon 微型离心管 - 0.5 mL 滤器Merck MilliporeUFC505096
偶联缓冲液（Bead Conjugation Buffer）Quanterix102040无法单独订购
非编码顺磁珠（Non-Encoded Paramagnetic Beads）Quanterix101360
磁珠洗涤缓冲液（Bead Wash Buffer）Quanterix102040无法单独订购
EDCFisher Scientific11844071
磁珠封闭缓冲液（Bead Blocking Buffer）Quanterix102040无法单独订购
磁珠稀释缓冲液（Bead Diluent Buffer）Quanterix101362
检测物与样本稀释液（Detector and Sample Diluent）Quanterix101359
生物素化反应缓冲液（Biotinylation Reaction Buffer）Quanterix102040无法单独订购
NHS-PEG4-生物素Fisher Scientific11891195
diH2O
适用于 1.7 mL 微量离心管的离心机（Heraeus Fresco 21 离心机）Thermo Scientific75002478
标准实验室涡旋混合器（MS2 Minishaker）IKAMS2
移液器（10、20、200 和 1000 μl）Thermo Scientific
吸头（10、20、200 和 1000 μl）Thermo Scientific
1.7 mL 微量离心管Eppendorf
可容纳 1.7 mL 微量离心管的磁力分离器（Life Technologies DynaMag-2）ThermoFisher Scientific12321D
小型台式离心机（Galaxy MinisStar）VWR521-2844
混合/振荡器（Eppendorf Thermomixer Comfort）Eppendorf
单分子阵列（Simoa）试剂
SBG、磁珠和检测剂条形码标签Quanterix101652
15 mL 试剂瓶Quanterix102411
Simoa 样本 96 孔板Quanterix101457
Simoa 芯片Quanterix100001
Simoa 2.0 导电吸头Quanterix101726
Simoa 比色皿Quanterix100803
Simoa SBG 试剂Quanterix102295
Simoa RGP 试剂Quanterix101736
Simoa 系统缓冲液 1Quanterix100486
Simoa 系统缓冲液 2Quanterix100487
密封油（Sealing Oil）Quanterix100206
ddH2O
Simoa HD-1 分析仪Quanterix100032
技术
单分子阵列（Simoa）Quanterix
单分子计数 Erenna 免疫分析系统Singluex

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ELISA

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