气孔胶带剥离法：一种改进的保卫细胞样品制备方法

摘要

本方案描述了一种制备富集的气孔保卫细胞的方法，适用于生理学及其他生物学研究。

摘要

保卫细胞的研究对于了解该细胞类型对植物整体功能的具体贡献至关重要。然而，保卫细胞的分离通常较为困难，因此对其研究常常面临挑战。

本研究建立了一种气孔保卫细胞富集方法。该方案利用透明胶带分离保卫细胞并从中提取蛋白质。该方法在细胞分离过程中提高了保卫细胞的完整性和得率，为研究细胞信号转导过程及其与气孔运动表型之间的关联提供了可靠的样品。在本方法中，将植物叶片夹在两段胶带之间，撕开以去除叶片的远轴面。该方案已应用于拟南芥叶片组织以分离保卫细胞。细胞经荧光素二乙酸酯（FDA）处理以检测其活性，并用脱落酸（ABA）处理以评估其对ABA的气孔运动响应。综上所述，该方案在制备富集的气孔保卫细胞及蛋白质分离方面具有实用价值。所获得的细胞和蛋白质质量可满足生理学及其他生物学研究的需求。

引言

气孔在植物的整体生理功能和适应性中起着重要作用。这些微小的植物特有结构由两种特化的表皮细胞——保卫细胞构成，主要大量分布于叶片的远轴面。气孔对于植物与大气之间的气体交换以及通过蒸腾作用控制水分流失至关重要。保卫细胞通过整合多种外部（例如，光照、湿度、病原体接触、二氧化碳浓度）和内部（例如，内源激素）信号来调节气孔开度^1,2。在过去的20年中，这类细胞已成为研究植物细胞信号传导过程的模式系统。保卫细胞仅占叶片总细胞的一小部分；因此，若要以单细胞水平研究其独特的细胞、生化和分子特性，必须将其从其他类型的叶细胞中分离出来。过去，保卫细胞的研究通常涉及制备保卫细胞原生质体（GCP）^3,4,5。该方法通常需要使用大量细胞壁降解酶，或通过匀浆进行机械破碎，且已被证明成本高、耗时长，一般需要数小时才能制备一份GCP样品，且常常产量较低。更重要的是，由于保卫细胞是以成对形式协同调节气孔开度的，因此使用原生质体可被视为一种人工系统，用于研究保卫细胞的信号传导过程。

本文中，我们建立了一种制备气孔的方法，该方法可富集完整的保卫细胞，并使其保持对刺激的生理响应能力。该方法的灵感来源于此前用于分离叶肉细胞原生质体的一种技术^6,7。在本方法中，使用透明 Scotch 胶带将叶片近轴层附着的大部分叶肉细胞与含有铺板细胞和保卫细胞的远轴层分离开来。具体操作是将胶带分别贴附于叶片两侧，然后将其撕开。随后，将远轴层细胞置于光照条件下，在气孔开放缓冲液中恢复。之后使用少量细胞壁降解酶去除残留的铺板细胞，最终在胶带上留下富集的保卫细胞。

在此简便的方法中，可在不到一小时内以极低的成本从50片表皮中快速高效地制备出具有活性且反应正常的气孔保卫细胞。该方法对植物细胞的损伤小于以往制备原生质体的方法。此外，采用此方法收集的材料可获得理想的蛋白质含量。最重要的是，由于叶片未经过研磨或长时间消化处理，且保卫细胞保持完整，因此研究结果将更贴近保卫细胞的天然生物学状态。利用该方法，可实时将气孔运动与分子水平的变化相关联。因此，通过此制备方法获得的研究成果，对于更全面地理解保卫细胞信号转导具有重要意义。

我们以植物Arabidopsis thaliana为模型；然而，该方案经过对消化时间进行少量修改后，也可应用于其他植物物种（如Brassica napus）的气孔保卫细胞富集。作为概念验证，我们已证明通过该方法富集的气孔保卫细胞具有活性，并能对刺激产生响应，这分别通过荧光素二乙酸酯（FDA）检测以及利用植物激素脱落酸（ABA）的研究得以证实。此外，我们还证明可从这些保卫细胞中分离出高质量的蛋白质。本文中，我们详细描述了该过程的操作方案。

方案

1. 植物培养

1. 在育苗基质中播种并使其萌发。将植株置于生长室中培养，光照强度为 140 µmol photons m⁻² s⁻¹，光周期为 8 小时光照（22 °C）和 16 小时黑暗（18 °C），持续培养 2 周。
2. 选取大小相近的幼苗，分别移栽至装有土壤、直径为 4" 的花盆中，并在与步骤 1.1 相同的条件下继续培养 3 周。
   注意：每周用自来水浇灌两次，以保持土壤湿润。

2. 富集气孔的制备

1. 用解剖刀去除5周龄的 A. thaliana 植株的叶片。
2. 将每片叶片用两片透明胶带贴附，其中一片粘贴在叶片的远轴面（下表面），另一片粘贴在近轴面（上表面）。使胶带在叶片上保留5秒。
3. 用双手的拇指和食指轻轻将两片胶带分开，从而分离出带有表皮细胞和保卫细胞的远轴面以及带有叶肉细胞的近轴面。
4. 将来自叶片远轴面的表皮条在收集过程中立即放入含有60 mL气孔开放缓冲液（50 mM KCl，10 mM MES-KOH，用1 M KOH调节至pH 6.2）的40 mm × 12 mm培养皿中。
   1. 重复上述步骤，直至收集完所有样品的表皮条。
5. 将含有表皮条的培养皿置于光照条件与步骤1.1所述相同的培养箱中。让表皮条在光照下放置2小时，以充分打开气孔。
6. 将表皮条放入一个150 mm × 20 mm的培养皿中，其中含有50 mL细胞壁消化酶混合液（0.7% 纤维素酶R-10，0.025% 离析酶R-10，0.1% (w/v) 聚乙烯吡咯烷酮-40，以及0.25% (w/v) 牛血清白蛋白，溶于55%基础溶液（0.55 M 山梨醇，0.5 mM CaCl₂，0.5 mM MgCl₂，0.5 mM 抗坏血酸，10 µM KH₂PO₄，5 mM 4-吗啉乙磺酸(MES)，用1 M KOH调节至pH 5.7））。
7. 将培养皿置于往复摇床上，以50 rpm振荡20分钟。
8. 20分钟后，用镊子将表皮条从酶溶液中取出，并转移至一个含有50 mL水的150 mm × 20 mm培养皿中。
9. 使用移液管，每次用10 mL水冲洗表皮条15秒，重复两次，以去除残留的酶溶液。
10. 用镊子将表皮条放入一个含有50 mL新鲜气孔开放缓冲液（同步骤2.4所用）的150 mm × 20 mm培养皿中，在步骤1.1所述的光照条件下孵育1小时，使气孔恢复。

3. 脱落酸（ABA）处理与气孔运动检测

1. 在150 mm × 20 mm的培养皿中，将富集的气孔表皮组织在50 mL气孔张开缓冲液中，或在含有终浓度为10 µM ABA的50 mL气孔张开缓冲液中，于30°C孵育15分钟，进行相应的处理。
2. 将表皮组织置于摇床上，以50 rpm振荡5、15和30分钟。每个时间点后，用镊子取出一片表皮组织，并按照步骤3.3中的成像步骤进行操作。
3. 在ABA处理前及ABA处理后的不同时间点，使用光学显微镜拍摄气孔图像。
   1. 取一片表皮组织，将其放置在玻璃载玻片上。
   2. 将载玻片置于显微镜载物台上，调节载物台位置，使表皮组织的图像可见。
   3. 调节显微镜的粗调和细调焦旋钮，获得保卫细胞的清晰图像。
   4. 在40倍放大倍数下，拍摄多个气孔的多张图像。
4. 使用ImageJ⁸测量60个气孔孔径。
5. 对60个气孔孔径的测量值进行标准误计算，并在p值< 0.05的水平上进行显著性分析。

4. 蛋白质提取与SDS-Page分离

1. 将果皮置于预冷的研钵中，加入足量液氮浸没果皮，研磨15秒。
2. 每50个果皮样品，用移液器向研钵中加入3 mL Tris饱和酚（pH 8.8）和3 mL蛋白质提取缓冲液（0.9 M蔗糖，0.1 M Tris-HCl，0.01 M EDTA，0.4% 2-巯基乙醇，10 µL 1 mM蛋白酶和磷酸酶抑制剂），然后在通风橱中继续研磨5分钟。
3. 用移液器将提取物转移，用金属镊子将果皮转移至Oakridge离心管中，在4 °C、50 rpm条件下于摇床上振荡1小时。
4. 从Oakridge离心管中移除果皮，将提取物在5,000 × g条件下离心10分钟。然后用移液器将上层酚相转移至新的洁净微量离心管中。
5. 通过加入5倍体积的冰冻0.1 M乙酸铵甲醇溶液沉淀酚相中提取的蛋白质。短暂涡旋混匀，于-20 °C过夜孵育。
6. 在4 °C、20,000 × g条件下离心20分钟，缓慢倾去上清液，保留管底的蛋白沉淀。
7. 用甲醇中的0.1 M乙酸铵洗涤蛋白沉淀两次，再用80%丙酮洗涤两次，最后用100%冷丙酮洗涤一次。
   注意：每次洗涤时向含有蛋白的离心管中加入10 mL指定试剂，在50 rpm摇床上振荡5分钟，随后在4 °C、15,000 × g条件下离心10分钟，倾去试剂，仅保留蛋白沉淀。
8. 向沉淀中加入1 mL 100%冷丙酮，通过缓慢吹打重悬蛋白沉淀。
9. 用移液器将蛋白悬液转移至2 mL微量离心管中，在4 °C、20,000 × g条件下离心5分钟。
10. 倾去丙酮，将蛋白沉淀在通风橱中干燥10分钟。
11. 在微量离心管中加入200 µL溶解缓冲液（8 M尿素，0.5% SDS，30 mM Tris-HCl，pH 8.5）溶解蛋白，涡旋振荡30分钟。在15 °C、20,000 × g条件下离心20分钟，收集上清液至新管中。
12. 按照蛋白定量方案⁹测定蛋白浓度。
13. 按照既定方案¹⁰使用蛋白样品进行凝胶电泳分离蛋白。

结果

拟南芥保卫细胞在消化叶肉细胞和表皮细胞前后的代表性图像如图所示 图1. 可使用FDA检测保卫细胞在去除叶肉细胞和表皮细胞前后的酶活性及细胞膜完整性，以观察其细胞活力（图1B 和 1D). 图2 展示拟南芥在脱落酸（ABA）处理下的气孔运动。经ABA处理30分钟后，气孔开度减少超过50%。 图2A 气孔运动的时间进程。在不同时间点，使用光学显微镜拍摄图像。利用ImageJ测量气孔孔径，结果以60至80个孔径测量值的平均值±标准误差表示。每个时间点的气孔孔径代表性图像如下所示 图2B通过SDS-PAGE观察蛋白质的检测、分离及相对丰度图3包含四个生物学重复，以强调该方法提取蛋白质的可重复性...

讨论

保卫细胞是研究植物信号转导机制的模式系统，因此确保所用样品的制备方法最适合回答生物学问题是十分重要的。尽管植物研究领域对保卫细胞的兴趣日益增加，但目前尚无一种通用的方法可用于制备气孔保卫细胞，以在同一系统中同时研究气孔运动与生理过程以及分子水平的变化。分离保卫细胞的困难在很大程度上源于其体积微小、数量稀少以及独特的结构，这些特性使得从完整叶片中分离它们的难度显著增加。

本方案提供了一种克服上述困难的方法，即采用改进的胶带剥离法进行分离。本方案所述方法可实现完整保卫细胞的分离，且分离后的保卫细胞仍保持对刺激的生理响应能力。此类样品的制备使得提取保卫细胞蛋白质成为可能，所获蛋白可作为深入蛋白质组学研究的起始材料，例如利用串联质谱标签（Tandem Mass Tags, TMT）或同重同位素标签用于相对与绝对定量（Isobaric tag for relative and absolute quantitation, iTRAQ）进行的定量蛋白质组学研究^11,12。此外，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
不锈钢手术刀	Feather	NC9999403
透明胶带（3M）	ULINE	S-9781
培养皿	Sigma-Aldrich	BR455701
纤维素酶（Onozuka R-10）	Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.	21560003-3
果胶酶 R-10	Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.	21560003-4
DM6000B 显微镜	Leica Microsystems
蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液	Thermo Fisher Scientific	PI78443
Oak Ridge 高速 PPCO 离心管	Thermo Fisher Scientific	3119-0030
EZQ 蛋白定量试剂盒	Thermo Fisher Scientific	R33200
荧光素二乙酸酯（FDA）	Thermo Fisher Scientific	F1303
脱落酸	Sigma-Aldrich	A4906
Metro Mix 500 培养基	BWI Companies	TX-500
Laemmli 样品缓冲液	Bio-Rad	161-0737
Bio-Safe 考马斯亮蓝（G-250）	Bio-Rad	161-0786
微量离心管（2 mL）	USA Scientific, Inc.	1620-2700
ImageJ 软件	美国国立卫生研究院
镊子	Sigma-Aldrich	F4017-1EA
12% Mini-PROTEAN TGX 预制胶	Bio-Rad	456-1043
显微镜载玻片	Fisherbrand	12-550-A3