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结合微流控与微流变学技术测定软物质在多次相变过程中的流变特性

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DOI：

10.3791/57429

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2018年4月19日

 ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Lehigh University, 2Process and Engineering Development, Procter & Gamble Co.

本文内容

摘要

我们演示了一种微流控装置的制备与使用方法，该装置可实现多粒子追踪微流变测量，用于研究反复相变对软物质流变特性的影响。

摘要

软物质的微观结构直接影响其宏观流变特性，并可因先前相变过程中的胶体重排或施加的剪切作用等因素而发生变化。为确定这些变化的程度，我们开发了一种微流控装置，可在限制样品所受剪切的前提下，通过更换周围流体诱导多次相变，并实现微流变学表征。该技术为 µ2流变学，结合了微流控与微流变学技术。该微流控装置采用双层设计，具有对称的进样通道，液体流入样品室后可将凝胶样品固定在原位以实现流体交换。可通过在远离样品室的位置施加负压，驱动液体进入样品室。材料的流变特性通过多粒子追踪微流变学（MPT）进行表征。在MPT中，将荧光探针颗粒嵌入材料内部，利用视频显微镜记录探针的布朗运动。追踪颗粒的运动轨迹并计算均方位移（MSD）。通过广义斯托克斯-爱因斯坦关系式，将MSD与宏观流变特性相关联。材料的相态通过与临界松弛指数进行比较来确定，该指数由时间-固化叠加法获得。对一种纤维状胶体凝胶的测量结果展示了该技术的应用价值。这种凝胶具有精细的结构，在施加剪切力时可能发生不可逆改变。µ2流变学数据显示，该材料在每次相变后均反复恢复至相同的流变特性，表明相变并未参与微观结构的变化。为确定剪切的作用，可在将样品注入微流控装置前对其进行预剪切。µ2流变学是一种广泛应用的技术，可用于表征软物质，能够在单一样品中监测其在相变过程中，响应周围环境条件反复变化时精细微结构的流变特性。

引言

软物质中的相变可以改变支架结构，这对材料的加工过程和最终稳定性具有重要意义1,2,3。在动态相变过程中对软材料进行表征，可提供关于结构演化与平衡结构及流变学性质之间关系的关键信息。例如，许多家用护理产品在消费者使用过程中需要发生相变。此外，在制造过程中，稀释和混合等加工步骤可能引入剪切力，从而影响产品的流变学性质和最终微观结构。理解相变全过程中的流变学性质，有助于确保产品按设计性能发挥作用。此外，如果在制造过程中外力改变了材料初始的流变学状态，相变可能导致意外且不理想的结果，从而改变产品的预期功能和效果。在临界凝胶点（定义为材料从缔合胶体或聚合物溶液转变为贯穿整个样品的凝胶网络的时刻），材料性质会随着缔合作用的微小变化而发生剧烈改变。在临界凝胶点处对结构的任何扰动都可能影响最终产品4。在这些动态转变过程中，软材料具有较弱的力学性能，使用经典实验技术进行测量时，信号可能接近测量噪声的极限5,6,7。为克服这一问题，常采用对低模量范围（10-3 - 4 Pa）敏感的微流变学技术，用于表征动态演化过程中的弱初始凝胶。某些材料的微观结构对外力敏感，在表征过程中带来挑战，因为任何材料转移或流体流动都可能影响其结构，进而影响最终材料的性能。为避免改变材料的微观结构，我们开发了一种微流控装置，可在最小化剪切的前提下交换样品周围的环境流体。通过更换流体环境，能够在相变过程中测量流变学性质和微观结构的变化，同时最大限度减少剪切的干扰。该装置与多粒子追踪微流变学（MPT）结合，形成一种称为 µ2流变学的技术。该技术用于量化凝胶在外部驱动力作用下连续相变过程中的材料性质。本文将以纤维状胶体凝胶——氢化蓖麻油（HCO）9,10,11为例，演示该技术的应用。

由于样品环境的影响，凝胶支架可能发生缔合与解离的变化12,13,14,15。凝胶化与降解的驱动力具有材料特异性，必须针对每种目标材料进行定制。µ2流变学可用于表征对外部刺激有响应的凝胶体系，包括胶体和聚合物网络。调节pH、渗透压或盐浓度是可引发材料微观结构变化的驱动力示例。例如，HCO通过建立渗透压梯度实现可控的相变。当浓缩的HCO凝胶样品（4 wt% HCO）浸入水中时，胶体粒子间的吸引力减弱，导致降解；相反，当稀HCO溶液（0.125 wt% HCO）与亲水性材料接触时（该材料称为凝胶剂，主要由甘油和表面活性剂组成），吸引力恢复，从而引发凝胶化。该凝胶体系将用于演示仪器作为测量单一样品连续相变的工具的操作过程9,10。为了在动态相变过程中以及在临界相变时精细的初始凝胶结构形成阶段对这些凝胶支架进行表征，我们采用MPT技术以高时空分辨率对这些材料进行表征。

微流变学用于测定多种软材料（包括胶体和聚合物凝胶）在关键转变阶段的凝胶性质与结构5,6,9,16微粒子追踪（MPT）是一种被动微流变学技术，利用视频显微镜记录嵌入样品中的荧光探针颗粒的布朗运动。通过该技术可精确确定视频中颗粒在整个运动过程中的位置，精度可达1/10th 使用经典追踪算法的像素定位17,18. 集合平均均方位移（MSD，(Δr2(t))) 由这些粒子轨迹计算得出。利用广义斯托克斯-爱因斯坦关系，均方位移（MSD）可关联至材料特性，如蠕变柔量。17,19,20,21,22,23通过计算均方位移（MSD）曲线相对于滞后时间的对数斜率来确定物质的运动状态， α,

figure-introduction-1

其中 t 是滞后时间，并将其与临界松弛指数进行比较， n. n 采用时间-固化叠加法（time-cure superposition）确定，这是一种已有充分文献记载的技术，Larsen 和 Furst 对其进行了改进，用于分析 MPT 数据6. 通过比较 n 到 α 材料的状态被定量确定。当 α > n 该材料为溶胶，当 α < n 该材料为凝胶。先前的研究利用微流变学对HCO体系进行了表征，以确定其临界弛豫指数。9利用这些信息，我们能够精确确定实验过程中材料从凝胶态转变为溶胶态的时刻。此外，非高斯参数 αNG可用于计算以确定系统结构异质性的程度，

figure-introduction-2

在……的地方 Δx(t一维粒子运动 x 方向。利用MPT，我们能够表征单个相变过程，但通过在微流控装置中使用MPT对材料进行表征，可以调控其周围流体环境，并在同一凝胶样品上采集多个相变的数据。

该微流控装置旨在研究单个凝胶样品在周围流体环境变化时发生相变的关键转变过程。当样品处于凝胶态或溶胶态时，装置通过将样品固定在原位以诱导相变，同时最小化剪切力，从而实现对样品周围流体的更换。在样品室正上方设有一个溶剂储液区，两者通过六条对称分布的进样通道相连。这种对称结构可在溶剂储液区与样品室之间进行流体交换的同时，在样品周围产生均匀的压力，从而将其固定在原位。已有若干研究采用该技术用于单颗粒和DNA的捕获，而本研究则将应用尺度从单个分子扩大至体积约为10 µL的样品24,25,26。该独特设计还可实现在相变过程中对样品进行实时微流变学表征。

µ2流变学是一种适用于多种软物质体系的可靠技术。本文所述技术虽专为胶体凝胶设计，但可轻松适用于其他材料，如聚合物或胶束溶液。利用该技术，我们不仅能够确定相变如何影响材料的平衡态性质，还能研究不同的加工步骤如何对材料的流变演化过程以及最终支架结构和性能产生持久影响。

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方案

1. 微流控装置的制备

  1. 微流控印章的制备
    注意：此步骤需使用挥发性材料，应在化学通风橱中进行。
    1. 使用与载玻片（75×50 mm）尺寸相同的负片打印设计，通道部分为白色，背景为黑色（见图1）。将该设计以1200 dpi分辨率打印在透明醋酸纤维片（透明胶片）上。
    2. 若透明胶片的暗区仍允许光线透过，可叠加多张负片，并使用双面胶带固定。
    3. 打开高强度紫外（UV）光源，预热至输出稳定（约30分钟）。
      注意：使用高强度UV光源时应佩戴防紫外线护目镜。
    4. 准备三个150 mL的培养皿，分别装入丙酮、乙醇和蒸馏水。
    5. 将一张空白透明胶片放置在靠近高强度UV光源但不在其正下方的平坦表面上，作为微流控印章的制备基底。
    6. 用永久性记号笔在空白透明胶片中央标出75 × 50 mm载玻片四个角的位置，并在所标矩形的四个角放置四块玻璃垫片（约30 × 30 × 1 mm）。
    7. 在垫片中央滴加约5 mL的UV固化硫醇-烯树脂，然后小心地将一块75 × 50 × 1 mm的载玻片盖在玻璃垫片上，确保树脂完全被载玻片覆盖且无气泡。
    8. 将印有负片的透明胶片置于载玻片上方，通过小心拖动底部空白透明胶片，将所有组件（从下至上：空白透明胶片、玻璃垫片和UV胶、载玻片、印有负片的透明胶片）移至UV光源下方。
    9. 让UV光透过负片照射树脂并使其固化。可通过调整固化时间来改变通道高度。使用本实验的光源时，45秒的固化时间可得到1 mm高的通道。
    10. 将组件移离UV光源，取下印有负片的透明胶片和载玻片。此时带有UV胶成型通道的载玻片即称为微流控印章。
    11. 丢弃透明胶片和玻璃垫片。
    12. 将微流控印章依次浸入丙酮浴和乙醇浴中，重复此步骤两次。丙酮会降解UV胶，因此印章在丙酮中停留时间不得超过10秒。
    13. 手持印章将其浸入水中，并用棉签清除未反应的树脂残留物。切勿直接擦拭已固化部分，以免造成通道表面粗糙。
    14. 将印章置于纸巾上，放回UV光源下至少30分钟，以确保完全固化。
  2. 聚二甲基硅氧烷（PDMS） molding
    1. 将70 g PDMS基础液倒入透明杯中，按交联剂与基础液质量比1:10加入交联剂。此为制造商推荐比例。请勿使用玻璃容器。
    2. 用金属搅拌器充分混合交联剂与基础液；混合均匀后因夹带空气形成气泡，混合物应呈浑浊状。
    3. 将PDMS放入真空烘箱中抽真空。若溶液开始溢出容器，则关闭真空，待溢出停止后重新开启。真空烘箱内的总压力不影响结果，真空仅用于加速脱气过程。持续抽真空直至混合物中所有气泡完全排出（约60分钟）。
    4. 将微流控印章放入一个直径150 mm的空塑料培养皿中，然后缓慢将PDMS倒入培养皿，完全覆盖微流控印章。倾倒时尽量贴近培养皿表面，以减少PDMS中气泡的重新形成。
    5. 盖上培养皿，置于55 °C烘箱中过夜固化。完全固化后，用刀片切割出图案化的PDMS并从印章上剥离。保留多余的PDMS用于制作溶剂池（方案步骤1.6.3）和PDMS塞子（方案步骤2.2.1.1）。
    6. 使用0.5 mm活检打孔器，在以下位置打孔：每个角落各一个，吸力腔靠近通道边缘处一个，样品腔内对称分布六个（相隔60°），以及样品腔中心一个。为确保打孔位置对称，可在纸上打印定位图案并置于样品腔下方。由于PDMS透明，可清晰观察打孔位置。
  3. 制备溶胶-凝胶溶液以在微流控装置中形成玻璃壁
    1. 在100 mL广口瓶中加入25 mL 90%乙醇、25 mL pH 4（0.0001 M）盐酸溶液、25 mL 98%正硅酸四乙酯和25 mL 98%甲基三乙氧基硅烷。将此100 mL溶液（现称为预转化液）敞口放入微波炉中加热10秒，随后置于80 °C环境中过夜。
  4. 装置组装
    1. 将图案化PDMS和一块75 × 50 × 0.10 mm的载玻片放入等离子清洗仪中，并将三通阀置于关闭位置。
    2. 开启真空泵，抽真空1分钟以排空腔室。
    3. 将三通阀转至流量控制器位置，使腔室平衡5秒。此位置允许少量空气流入等离子清洗仪，流速足够低以维持腔室低压状态。将射频（RF）开关调至中档并开启40秒，随后关闭RF开关和真空泵。
    4. 将三通阀置于开放位置，使腔室恢复至大气压。取出图案化PDMS和载玻片。
    5. 小心地将图案化PDMS与载玻片对齐贴合，使两表面紧密接触。
    6. 在图案化PDMS边缘接缝处涂覆UV固化树脂，并在低强度UV光下固化5分钟。
  5. 在微流控通道中形成玻璃壁
    注意：此步骤必须在等离子处理后30分钟内完成，因其依赖于等离子处理引起的PDMS表面变化。形成的玻璃层厚度约为5–10 µm。此步骤需使用挥发性材料，应在化学通风橱中进行。
    1. 将加热板设定为100 °C，并准备四支注射器（三支30 mL，一支3 mL），配备18号针头和约30 cm长的透明热塑性管。
    2. 分别用乙醇、氯仿和空气填充三支30 mL注射器。用预转化液（来自方案步骤1.3.1）填充一支3 mL注射器。
    3. 除一个角落的孔外，使用不锈钢接头将透明热塑性管插入图案化PDMS的所有其他孔中。该角落孔作为入口，其余均为出口。
    4. 用注射器将预转化液注入微流控装置，然后将装置置于100 °C加热板上，使底部玻璃面与加热板表面接触。
    5. 在10秒内使3 mL预转化液流经微流控装置。通过调节预转化液的流速可控制玻璃壁的厚度。
    6. 将微流控装置从加热板上取下，将预转化液注射器更换为空气注射器，排出多余的预转化液。
    7. 将空气注射器更换为氯仿注射器，缓慢使15 mL氯仿流经微流控装置。再将氯仿注射器更换为乙醇注射器，缓慢使30 mL乙醇流经装置。每一步骤持续时间约为1分钟。
    8. 将乙醇注射器更换为空气注射器，通入空气直至装置完全干燥。
  6. 玻璃支撑结构与溶剂池的应用
    1. 从75 × 25 × 1 mm的载玻片上切割出75 × 10 × 1 mm的玻璃条。
    2. 在玻璃条上涂覆UV固化树脂。将微流控装置放置于玻璃条上，PDMS面朝上。移至低强度UV光源下照射5分钟。
    3. 裁剪一块30 × 30 mm的PDMS片，使用活检打孔器打一个足够大的孔，以覆盖10 mm的样品腔。
    4. 将PDMS片和微流控装置放入等离子清洗仪中，将三通阀置于关闭位置，并开启真空泵。
    5. 抽真空1分钟。将三通阀转至流量控制器位置，使腔室平衡5秒。
    6. 将RF开关调至中档并开启40秒，随后关闭RF开关和真空泵。
    7. 将三通阀置于开放位置，使腔室恢复至大气压。
    8. 从等离子腔室中取出溶剂池和微流控装置，通过表面接触将其粘合。确保溶剂池覆盖在样品腔上方。

2. µ2流变学实验步骤

  1. 软物质样品的制备
    1. 清洗探针颗粒
      1. 按水与探针体积比10:1的比例，将水和0.5 µm探针用移液器加入微量离心管中。充分混匀后，将微量离心管放入微量离心机，以4600 × g离心10分钟。
        注：本研究使用的探针溶液初始以水为悬浮介质，固含量为2.6%（体积比），样品中最终使用的探针浓度为0.1%（体积比）。
      2. 取出微量离心管，用移液器吸去上清液，并用去离子水替换上清液。重复离心清洗共三次。
      3. 将微量离心管放入超声仪中，低功率超声处理15分钟，以去除任何可能的聚集体。
    2. 探针与软物质的混合
      注：本实验中使用胶体凝胶作为软物质样品。
      1. 在75 × 50 mm的玻璃载片上取1 mL样品材料。用移液器将40 µL探针溶液加入样品中心位置。
      2. 用金属刮刀轻轻翻折样品，直至完全混合均匀。将混合后的样品转移至微量离心管中，并以2340 × g离心15秒，以去除夹带的空气。
      3. 用探针/HCO混合物填充一支配有18号针头和透明热塑性软管的1 mL注射器。
  2. 通过流体交换诱导连续相变
    1. 填充微流控装置
      1. 制备PDMS塞：利用步骤1.2.5中多余的PDMS材料，切割出一块5 mm见方的PDMS块。使用直径为0.5 mm的活检打孔器，在PDMS塞上打一个半通孔。将不锈钢连接头插入直径为0.5 mm的孔中。
      2. 将热塑性软管连接至三个角落的进样通道和抽吸腔出口通道。 使用连接在装置上的注射器将水完全充满整个装置。确保样品腔和微流控通道中无气泡存在。用PDMS塞封堵剩余的角落孔。
      3. 溶剂槽应已在步骤2.2.1.2中部分填充；若未填充，请用水将溶剂槽加满。
      4. 使用步骤2.1.2.3中的注射器，以约2 µL/s的速度将10 µL样品/探针混合物经中心通道注入样品腔，随后用PDMS塞封堵样品腔的中心通道。
    2. 采集微流变学数据
      1. 将相机设置调整为可最小化静态和动态粒子追踪误差的优化参数，然后切换至63×水浸物镜，并在镜头上滴加一滴水。
      2. 将微流控装置置于显微镜载物台上，抬升物镜直至聚焦于样品。
      3. 在适合整个相变过程总时长的时间间隔内，持续记录探针布朗运动的视频。对于凝胶化过程，应持续拍摄直至探针运动完全停止。
        ​注：我们每10分钟采集一次数据。若实验起始于降解过程，则持续采集数据直至探针完全恢复自由扩散。
    3. 样品腔内流体交换（重力驱动流动，低密度流体替换为高密度流体）
      1. 将微流控装置从显微镜载物台上取下。
      2. 使用移液器将溶剂槽中的水吸出，然后向溶剂槽中加入4 mL更高密度的流体。
      3. 将微流控装置重新放回显微镜载物台，并重复步骤2.2.2.3。
    4. 样品腔内流体交换（抽吸驱动流动，高密度流体替换为低密度流体）
      1. 将微流控装置从显微镜载物台上取下，并移除抽吸腔的PDMS塞。
      2. 将配有18号针头和透明热塑性软管的注射器插入抽吸腔通道，并将注射器连接至注射泵。设定注射泵以1 mL/min的速度进行抽吸。
      3. 去除溶剂槽中多余的凝胶剂，并通过向溶剂槽注水后抽吸的方式用水冲洗三次。
      4. 启动注射泵进行抽吸，同时向溶剂槽中持续加水，持续一分钟。切勿让溶剂槽完全排空，否则会导致空气进入样品腔。
      5. 将注射器从微流控装置上移除，并重新安装PDMS塞封堵抽吸腔。
      6. 将微流控装置放回显微镜载物台，并继续采集样品数据。
  3. 在降解/凝胶化循环过程中，以固定时间间隔持续采集样品，直至完成预定循环次数或探针数量不足以进行测量为止。

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结果

采用PDMS构建一个双层微流控装置（图1a,b），PDMS在微流控印章上进行图案化，印章的设计如图1c所示。不正确的实验设置可能导致被动微流变学测量出现误差，以及在周围流体交换过程中产生微流控流动问题（图2）。不正确实验设置的示例详见讨论部分。在装置运行期间，凝胶样品周围的流体被更换。这种流体交换发生在材料处于凝胶相和溶胶相的两种状态下。该微流控装置设计能够在不显著损失凝胶材料及嵌入的示踪微粒的前提下实现流体交换。本研究采用两种类型的流体交换方式：重力流（从低密度流体向高密度流体更换）和抽吸流（从高密度流体向低密度流体更换）。在我们的HCO凝胶体系中，使用抽吸流诱导降解，而重力流用于诱导凝胶化。两种流动方式对样品施加的剪切力均极小，抽吸流和重力流产生的剪切应力分别约为0.01 Pa和1 Pa。这些剪切应力均低于凝胶的屈服应力，后...

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讨论

这种双层微流控装置（图1）可依据已有详细记录的微流控 fabrication 技术轻松制备29。在装置底部添加玻璃支撑以减少探针运动时的振动影响。玻璃载片非常薄（0.10 mm），以便适应显微镜物镜的工作距离。然而，这也使得装置容易受到实验环境及建筑物中微小振动的影响，而这些振动会被高速相机检测到。玻璃支撑能有效消除这些外部干扰。选择短工作距离的物镜是为了获取精确的MPT数据，这需要满足以下两个条件：（1）每个粒子至少占据4个像素；（2）有限的工作距离，以避免成像不在二维平面上的粒子。

该装置的设计（图1a-c）基于先前将微流变学与微流控技术相结合的研究。Schultz 和 Furst 开发了 µ2流变学技术，并采用了与本研究相同的微流控器件制备方法。他们的装置旨在生成50至100个水凝胶样品，各样品由连续相分隔，并在聚合物主链和交联剂浓度上形成梯度

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披露

本研究无任何利益冲突披露。

致谢

本工作得到了宝洁公司和美国化学会石油研究基金（54462-DNI7）的资助。作者感谢美国化学会石油研究基金的捐赠者对本研究的部分支持。作者谨此感谢 Marco Caggioni 博士在讨论中提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
150 x 15 mm 培养皿Corning, Inc.351058
75 x 50 x 0.15 mm 玻璃载片Fisher ScientificCustom
75 x 50 x 1.0 mm 玻璃载片Fisher Scientific12-550-C
75 x 25 x 1.0 mm 玻璃载片Fisher Scientific12-550-A3
22 x 22 玻璃盖玻片Fisher Scientific12-542-B
丙酮，99.5%VWR Analytical67-64-1
低强度紫外光源UVPUVL-56
氯仿，99.9%Fisher ChemicalC298-500
棉签Q-tips83289205
乙醇，90%Fisher ChemicalA962-4
Fluoresbrite® YG 羧基微球 0.50µmPolysciences, Inc. 15700-10
高强度紫外灯Spectroline Corp.SB-100P
加热板Corning, Inc.PC-420
盐酸，6NRicca Chemical Company3750-32
甲基三乙氧基硅烷，98%Acros Organics174622500
微量离心机Eppendorf5424
等离子清洗仪Harrick Plasma, Inc.PDC-32G
聚二甲基硅氧烷 (PDMS)Robert McKwown Company2065622
超声波清洗器Branson, Emerson Electric1800
钢制连接器，内径 0.023 英寸New England Small Tube Corp.Custom
四乙氧基硅烷，98%Alfa AesarA14965
硫醇-烯树脂（紫外光固化）Norland Products, Inc. NOA81
透明胶片Staples Inc. 21828
Tygon 管，内径 1/32 英寸McMaster-CarrE-3603
真空烘箱Fisher Scientific282A
8 mm 活检打孔器World Precision Instruments504535
0.5 mm 活检打孔器World Precision Instruments504528
30 mL 注射器BD309659
3 mL 注射器BD309651
18 号针头BD305195
微量离心管，1.5 mLEppendorf22-36-320-4
高速相机Vision ResearchMiro M120 
显微镜Carl Zeiss AGZeiss Observer, Z1
注射泵New Era Pump SystemsNE-300
氢化蓖麻油Procter & GambleN/A
Afício MP 6002 打印机Ricoh Company, Ltd.415877

参考文献

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