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方法文章

用于研究再生的鼠源和人源原代胃上皮单层培养

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DOI：

10.3791/57435

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2018年5月7日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Systems Physiology, University of Cincinnati, 2Department of Cell & Developmental Biology, University of Michigan, 3Department of Molecular Genetics, Biochemistry & Microbiology, University of Cincinnati

本文内容

摘要

本文介绍了一种建立和培养人源及小鼠源三维（3D）胃类器官的方案，以及将三维类器官转化为二维单层细胞的实验方法。同时描述了利用胃上皮单层细胞作为新型划痕损伤模型进行再生研究的方法。

摘要

体外 胃部伤口修复的研究通常采用胃癌细胞系，通过划痕伤口实验来检测细胞增殖与迁移。然而，此类实验的一个关键局限在于其细胞类型的均一性。修复过程十分复杂，需要多种细胞类型之间的相互作用。因此，若培养体系中缺乏细胞亚群，则成为理解修复机制时必须克服的问题。胃类器官模型有望解决这一难题，因其包含的多种细胞类型能够更真实地模拟胃上皮或其他天然组织的细胞组成。 体内. 此处展示的是一种新型的， 体外 源自人或小鼠三维类器官的划痕损伤实验，可将完整类器官或经解离后形成的单细胞悬液接种至胃上皮单层细胞中。本实验方案的目标是建立由类器官衍生的胃上皮单层细胞体系，用于一种新型的划痕损伤实验系统，以研究胃组织再生过程。

引言

划痕伤口实验是一种研究修复与再生的常用方法1,2,3,4,5,6。本研究所提出的方法可用于专门研究胃部再生及Helicobacter pylori的定植。过去，胃癌细胞系被用于研究Helicobacter pylori（H. pylori）感染1,2，直到最近，诸如AGS细胞等胃癌细胞系仍被广泛使用1,2,3,4。胃癌细胞培养的一个局限性在于其无法重现胃上皮细胞的多样性。为尝试克服这一局限，本文展示了基于Schlaermann et al.7首次描述的改良方法，建立并转移来源于人和小鼠的原代三维胃底胃类器官（FGOs）至胃上皮单层细胞，用于伤口愈合实验。我们证明，由剪切后的三维胃FGOs或FGO来源的单个细胞衍生的胃上皮单层细胞具有极性细胞组成，能够紧密模拟体内胃上皮的结构特征。鉴于胃癌细胞系无法呈现该技术所展示的细胞组成，当前方案相较于其他划痕伤口实验方法具有优势。本方法已优化，单层细胞既可由完整类器官建立，也可由解离类器官获得的单细胞悬液建立，并可在基底膜基质或胶原蛋白包被的培养皿中接种。本方案的总体目标是建立来源于类器官的胃上皮单层细胞培养体系，用于新型伤口愈合实验。

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方案

为避免污染，整个操作应在无菌细胞培养罩内完成。人胃底组织根据辛辛那提大学机构审查委员会（IRB）批准的方案（IRB方案编号：2015 - 4869）从接受袖状胃切除术的患者中采集。
所有小鼠实验均经辛辛那提大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，该委员会管理的设施符合美国实验动物评估和认证协会（AAALAC）标准。

1. 建立人源三维胃底类器官

注意：本实验方案基于本实验室先前发表的研究8。

  1. 制备3D类器官培养基，其中包含50% Wnt条件培养基和20% R-spondin条件培养基。
    1. 制备Wnt条件培养基：将L细胞在Wnt生长培养基（Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）、10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素）中培养7天，收集培养基，并使用0.22 µm滤器过滤。
    2. 制备R-spondin条件培养基：将经改造的可分泌R-spondin的HEK-293T细胞系在R-spondin生长培养基（Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）、10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素）中培养。细胞贴壁2小时后，更换为OPTIMEM生长培养基（含1%青霉素/链霉素），继续培养7天。随后收集R-spondin条件培养基，并使用0.22 µm滤器过滤。
      注：该方案此前已有发表，更详细的步骤请参见6,7,8。
  2. 将生长因子减少、无酚红的基底膜基质在4 °C冰上解冻16小时。在大型塑料容器中，用冰预冷的无Ca2+/Mg2+ DPBS收集组织。在开始步骤1.4前始终保持冰上保存。
    注：组织来源于接受袖状胃切除术的患者。
  3. 使用镊子，在含有100 mL无Ca2+/Mg2+ Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）的无菌烧杯中剧烈冲洗组织，冲洗约30秒，直至去除碎片和血液。接着，使用无菌纱布擦去上皮层的黏液层。
  4. 使用大号镊子牢固夹住组织的肌层，并用大号弯止血钳用力刮取上皮层。将刮下的上皮碎片收集至无菌聚苯乙烯培养皿中。
  5. 使用刀片将上皮组织切成约2.0 × 2.0 mm2大小的碎片，以优化组织消化效果。用添加抗生素的无Ca2+/Mg2+ DPBS（无Ca2+/Mg2+ DPBS，1%青霉素/链霉素，0.25 mg/mL两性霉素B / 10 mg/mL庆大霉素，50 mg/mL卡那霉素）清洗组织碎片，直至洗涤液无血迹。如需要，可进行多次洗涤。通过将洗涤液经无菌纱布过滤至废液杯中，小心弃去洗涤液。
  6. 将洗涤后的组织碎片收集至一个125 mL玻璃圆底烧瓶中，加入25 mm搅拌子和预热的孵育培养基（基础培养基补充2 mM L-谷氨酰胺、1%青霉素/链霉素、10 mM HEPES缓冲液、1 mg/mL I型胶原酶、2 mg/mL细胞培养级牛血清白蛋白）。用橡胶隔膜密封圆底烧瓶。
  7. 将一根20 G脊髓穿刺针插入隔膜，并通过橡胶软管连接至氧气瓶。为过滤可能的污染物，将滤纸塞入管路中作为过滤装置。开启低流量氧气输出。在隔膜上插入10–15根排气针，以防止隔膜破裂。
  8. 使用夹具将装置固定在铁架台上，并置于设定为37 °C的水浴摇床中孵育30–45分钟。组织孵育15分钟后，取出50 µL孵育培养基，显微镜下观察是否有腺体解离。若腺体密度不足或未从组织中分离，继续孵育5–10分钟。
  9. 孵育结束后，立即使用无菌移液管或直接倾倒，向孵育体系中加入50 mL预热的DMEM/F12培养基。
  10. 将腺体混合物经无菌纱布过滤至四个50 mL锥形管中。将滤液置于冰上15分钟，使提取的腺体沉降至管底。小心不要扰动已沉淀的腺体，使用移液管吸除并弃去上层40 mL上清液。将剩余的10 mL重悬于10 mL含抗生素的DPBS中。
  11. 将混合液均匀分装至5 mL细胞培养试管中。在4 °C条件下以65 × g离心5分钟，小心用移液器吸除上清液。使用移液器或200 µL宽口吸头，将腺体沉淀重悬于已解冻的基底膜基质中，混匀至均一状态。
    注：此步骤必须在冰上操作，避免基底膜基质在混匀过程中发生聚合。此外，应取50 µL样品进行显微观察，评估腺体密度。理想密度约为70%融合度。
  12. 使用宽口吸头，将腺体以50 µL基底膜基质的体积接种至培养板中。接种过程中避免产生气泡。
  13. 为使基底膜基质聚合，于37 °C孵育10–15分钟。若使用12孔板培养，每孔加入1 mL hFGO培养基（Advanced DMEM/F12培养基补充2 mM L-谷氨酰胺、1%青霉素/链霉素、0.25 mg/mL两性霉素B / 10 mg/mL庆大霉素、50 mg/mL卡那霉素、10 mM HEPES缓冲液、1 mM N-乙酰半胱氨酸、1× N2、1× B27、50% Wnt条件培养基、20% R-spondin条件培养基，并补充100 ng/mL骨形态发生蛋白抑制剂、1 nM胃泌素、50 ng/mL表皮生长因子、200 ng/mL成纤维细胞生长因子10、10 mM烟酰胺和10 µM Y-27632 ROCK抑制剂）。若非使用12孔板，则加入足量培养基以完全浸没基底膜基质液滴。
  14. 将细胞置于37 °C、5% CO2的湿润细胞培养箱中培养，每4–5天更换一次培养基。

2. 建立小鼠来源的三维胃底类器官

注意：本方案此前已发表6。开始实验前，将基底膜基质置于冰上解冻，并准备好所有试剂。

  1. 采用研究机构批准的方法处死小鼠。取出小鼠胃组织，并按照先前发表的方案进行解剖。 6. 用 20 mL 冰冷的 Ca 洗涤2+/毫克2+无DBPS
    注意：使用8至10周龄的C57BL/6小鼠进行胃底胃类器官培养。小鼠通过吸入二氧化碳实施安乐死，随后进行手动颈椎脱位，再取出胃组织。
  2. 剥离胃部的肌肉层及所有可见的血管，操作方法如先前文献所述 6.
  3. 使用无菌剃刀片将胃底与胃窦及前胃分离。用小型手术剪将胃底剪切成约 2.0 x 2.0 mm 的小片。用镊子将组织碎片收集至含有 EDTA 孵育缓冲液（Ca2+/毫克2+无钙镁DPBS，5 mM EDTA），4 °C下轻柔振荡孵育2小时。
  4. 在无菌操作台中，将锥形管和组织碎片置于冰上约5分钟。使用移液器尽可能吸除孵育缓冲液，注意不要扰动组织碎片。加入5 mL振荡缓冲液（1 g D-山梨醇，1.47 g蔗糖溶于100 mL Ca2+/毫克2+无钙镁DPBS）并用力手动震荡2分钟。静置使大碎片沉降，迅速使用1000 μL移液器吸走上层尚未沉降的小碎片。
  5. 将移除的片段在 4 °C 下以 65 × g 离心 5 分钟。
  6. 在避免产生气泡的情况下，吸除上清液，将沉淀重悬于基底膜基质中，并混匀至均匀状态。
  7. 使用宽口吸头将基底膜基质以每孔50 µL接种，随后在37 °C孵育20分钟。
  8. 加入足量 mFGO 生长培养基（含 2 mM L-谷氨酰胺、1% 青霉素/链霉素、10 mM HEPES 缓冲液、1 mM N-乙酰半胱氨酸、1× N2、1× B27、50% Wnt 条件培养基、20% R-spondin 条件培养基并补充 100 ng/mL 骨形态发生蛋白抑制剂、10 nM 胃泌素、50 ng/mL 表皮生长因子、10 ng/mL 成纤维细胞生长因子 10 以及 10 µM Y-27632 ROCK 抑制剂的 Advanced DMEM/F12 培养基），以完全浸没气泡。
  9. 在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养细胞2 湿润的细胞培养箱。每4至5天更换一次培养基。

3. 二维转移的胶原蛋白包被

注意：除非另有说明，所有操作均应在无菌的组织培养罩内进行。在将3D类器官转移至单层培养前24小时开始进行胶原包被。将大鼠尾胶原置于冰上并避光保存。胶原包被的培养板可在4 °C保存，有效使用期最长为2周。若不立即使用包被板，需用封口膜包裹后于4 °C保存至使用时取出。

  1. 使用 20 mM 乙酸将鼠尾胶原蛋白稀释至 50 µg/mL。
  2. 用稀释后的胶原蛋白充分覆盖孔板表面。对于标准 12 孔板中的一个孔，加入约 1 mL 胶原蛋白溶液。在无菌操作台中室温孵育过夜。
  3. 每孔用 1 mL 无 Ca2+/Mg2+ 的 DPBS 洗涤两次，并在无菌操作台中室温静置 2 小时，不加盖。

4. 二维转染用基底膜基质包被

注意：除非另有说明，所有操作均应在无菌的组织培养罩内进行。在将3D类器官转移至单层细胞前2小时，开始基底膜基质包被。保持基底膜基质处于冰上。包被后的培养板应立即使用，不可长期储存。

  1. 在15 mL圆锥形管中，用细胞培养级水以1:10的比例稀释基底膜基质，冰上操作。
  2. 使用移液器将100 µL稀释后的基底膜基质加入标准12孔板的每个孔中。用细胞刮刀将稀释的基底膜基质在孔内均匀铺布，形成均一涂层。
  3. 在37 °C下孵育1 h。
  4. 用移液器吸除残留液体，室温干燥1 h，然后转移3D类器官。

5. 将三维 m/hFGOs 转移至二维胃上皮细胞单层

  1. 在3D小鼠或人源性FGO培养6至7天后，开始将3D类器官转移至2D单层培养。
    注意：每孔所需的单层培养建议使用300个完整类器官，或来源于300个类器官的单细胞。在培养状态良好的情况下，预期在12孔板中每孔可获得约150个类器官。
  2. 转移前请确保培养板已包被。
    注意：基底膜基质包被的培养板具有半透明凝胶层，而胶原蛋白包被的培养板则无明显包被可见迹象。
  3. 通过直接将1 mL无Ca2+/Mg2+的DBPS滴加到类器官球中心，使其从培养板上脱离。
  4. 使用移液器将基底膜基质与类器官混合物收集至细胞培养试管中。每管收集2个基底膜基质球。在40 × g、4 °C条件下离心5分钟。
  5. 使用真空系统吸除上清液，并尽可能去除基底膜基质。加入4 mL无Ca2+/Mg2+的DBPS重悬，吸除上清液，重复2至3次。若进行完整类器官转移流程，请继续至步骤5.10；若进行单细胞悬液流程，请继续至步骤5.7。
  6. 将细胞解离溶液 预热至37 °C，并向每管中加入1 mL。通过轻轻翻转试管或使用移液器吹打混匀。在37 °C孵育10分钟。
  7. 直接向每管中加入2 mL无Ca2+/Mg2+的DBPS。
  8. 使用26 G针头将混合物推注2至3次。肉眼观察是否形成单细胞。若仍存在类器官或细胞团块，再推注1至2次。
  9. 在40 × g、4 °C条件下离心5分钟。将沉淀重悬于2D FGO培养基中（2D小鼠FGO生长培养基：高级DMEM/F12培养基，添加2 mM L-谷氨酰胺、10 mM青霉素/链霉素、10%胎牛血清、10 mM HEPES缓冲液、1 × N2、1 × B27，并补充10 nM胃泌素、50 ng/mL表皮生长因子、1 µM TGF-β抑制剂和10 µM Y-27632 ROCK抑制剂。2D人源FGO生长培养基：高级DMEM/F12培养基，添加2 mM L-谷氨酰胺、1%青霉素/链霉素、10 mM HEPES缓冲液、10%胎牛血清、10 mM烟酰胺、1 × N2、1 × B27，并补充50 mg/mL卡那霉素、50 ng/mL表皮生长因子、10 µM Y-27632 ROCK抑制剂和1 µM TGF-β抑制剂）。
  10. 将重悬液接种至包被的培养板中。将培养板置于37 °C孵育。每4天更换一次培养基，若培养基变黄则提前更换。单层细胞形成约需4天。

6. 使用二维胃上皮细胞单层的划痕伤口实验

  1. 当细胞培养达到100%融合度时，使用剃须刀片在单层细胞上划痕。
  2. 在室温下用3.7%多聚甲醛固定单层细胞15分钟，随后在室温下用0.5%非离子型去污剂/PBS处理20分钟以进行通透。
  3. 接着在室温下用2%驴血清封闭单层细胞1小时，然后加入1:1000稀释的H+,K+-ATP酶一抗，在4°C孵育过夜；用0.1%非离子型去污剂/PBS洗涤后，加入1:100稀释的驴抗小鼠488二抗和10 μg/mL Hoechst细胞核染料，在室温下孵育1小时。
  4. 为鉴定二维人源胃上皮单层培养中的表面黏液凹陷细胞，使用20 μg/mL的Ulex europaeus（UEAI）FITC偶联物对细胞进行染色，并在共聚焦显微镜下成像。
  5. 每隔数小时拍摄一次伤口图像。根据单层细胞的质量及患者间的差异，划痕通常在24至48小时内完成再上皮化。

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结果

类器官来源于人胃体/胃底组织或小鼠胃底组织（图1A）。分别对人或小鼠来源的胃组织进行胶原酶或EDTA消化后，将胃腺体嵌入基底膜基质中，并培养6-7天（图1A）。图1B展示了由人源胃类器官（huFGOs）进一步转移至基底膜基质包被的腔室载玻片上形成的胃上皮单层细胞（huGEM）。培养4天后，融合的huGEM用于划痕损伤实验（图1B）。通过延时成像分析采集的huGEM图像显示，在24小时的培养期间，细胞实现了伤口闭合（图2）。

研究发现，huGEMs 表达了天然胃组织中存在的主要细胞谱系。免疫荧光染色显示，存在一层极化的 E-钙黏蛋白阳性单层细胞，其中包括壁细胞...

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讨论

本方案详细描述了建立人源和鼠源胃上皮单层细胞的方法，可用于划痕损伤实验。该方案基于从原代人（或小鼠）组织中分离常驻干细胞的概念，是对Schlaermann首次发表的方案进行的改良。 等7特别是，我们在此优化了实验方案，以建立一种融合且具有极性的胃上皮单层细胞层，该细胞层可表达胃上皮中存在的主要细胞谱系。 体内胃溃疡修复是一个复杂的过程，涉及组织再上皮化、再生和增殖9,10,11特别是，本实验室已报道，胃上皮的再生与再生胃腺体边缘出现表达解痉肽/三叶因子（TFF）2的化生性病变（SPEM）相一致。12,13SPEM 定义为壁细胞谱系转分化为黏液细胞化生的过程14 随着损伤出现，并在黏膜恢复至正常细胞组成时消失...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了美国国立卫生研究院（NIDDK）资助项目 5 R01 DK083402-07（YZ）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
高级DMEM/F12培养基（基础培养基）Life Technologies12634-010
GlutaMAX（L-谷氨酰胺）Life Technologies25030-081
青霉素/链霉素Thermo ScientificSV30010
两性霉素B/庆大霉素Thermo ScientificR01510
卡那霉素Thermo FisherRO1510
HEPES缓冲液Sigma AldrichH0887
N-乙酰半胱氨酸Sigma AldrichA9165
N2Life Technologies17502-048
B27Life Technologies12587-010
BMP抑制剂（Noggin）Pepro Tech250-38
胃泌素Tocris3006
EGFPepro Tech315-09
FGF10Pepro Tech100-26
烟酰胺Sigma AldrichN0636
Y-27632 ROCK抑制剂Sigma AldrichY0503
TGF-β抑制剂Tocris2939
Ca2+/Mg2+ 无DPBSFisher21-031CV
DMEM高糖培养基（DMEM）Life Technologies12634-010
胎牛血清FBS
OPTIMEMInvitrogen
0.22µm滤器Fisher099-720-004
37 °C水浴锅
I型胶原酶Worthington LS004214
牛血清白蛋白Sigma AldrichA9418
Kimwipes（擦拭纸）Fischer Scientific06-666C
125 mL圆底烧瓶
1英寸（25 mm）搅拌子
橡胶隔垫
无菌纱布
磁力搅拌器
铁架台
铁架台夹
无菌培养皿
18 G、1.5英寸长针头Thermo Fisher305196
20 G、3.5英寸长脊髓穿刺针Thermo Fisher405182
12孔细胞培养板Midwest Scientific92012
生长因子减少型、酚红-free MatrigelTM （基底膜基质）FisherCB-40230C
无菌剃刀刀片
宽头镊子
弯止血钳
200 µL宽口移液器吸头Thermo Fisher02-707-134
5 mL细胞培养试管Fisher14-956-3C
带橡胶管的氧气瓶
1 g D-山梨醇
蔗糖FisherSS-500
解剖显微镜
解剖托盘
摇床
大鼠尾I型胶原Life TechnologiesA10483-01
细胞培养级冰醋酸FisherA38-212
细胞培养级水Corning25-055-CV
2孔腔室载玻片Thermo Fisher155380
12孔Transwell（聚酯膜插件）Corning3460
细胞刮刀Corning353086
Accutase（细胞解离溶液）Stemcell Technologies7920
263/8 G注射器Thermo Fisher309625
剃刀刀片
L细胞L细胞是一种可产生Wnt3a的细胞系，由荷兰Hubrecht发育生物学与干细胞研究所Hans Clevers博士惠赠。  N/A
HEK-293T R-spondin分泌细胞经修饰的可分泌R-spondin的HEK-293T细胞系由美国辛辛那提儿童医院医学中心及辛辛那提大学医学院新生儿科、围产与肺部生物学系Jeff Whitsett博士提供。   N/A
HK-ATP酶一抗InvitrogenSC-374094
E-钙黏蛋白SantaCruzsc-59778
UEA1Sigma AldrichL9006
Hoechst 33342Thermo FisherH3570
Alexa Fluor 488二抗（驴抗小鼠488二抗）ThermoFisher ScientificR37114

参考文献

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