本方案展示了一种从足月胎盘的胎膜中分离原代人蜕膜细胞的方法，该方法可用于多种应用（例如免疫细胞化学、流式细胞术、等），旨在研究不同细胞群体在妊娠并发症中的作用。
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本文内容
摘要
摘要
蜕膜，也称为妊娠期子宫内膜，是一种极为重要的生殖组织。蜕膜细胞主要由蜕膜化的间质细胞和免疫细胞组成，负责分泌对胚泡成功着床、胎盘发育至关重要的激素和炎症因子，并在足月及早产分娩启动中发挥作用。许多妊娠并发症可能源于构成蜕膜的不同细胞群体之间精细平衡的破坏。特定蜕膜细胞类型比例的改变可能干扰这些关键过程，增加发生严重妊娠并发症的风险，例如胚胎着床失败、宫内生长受限、子痫前期和早产。本文所述方案展示了一种经济且高效的方法，用于从足月胎盘的胎膜中分离原代人蜕膜细胞。通过结合酶消化与轻柔的机械破碎处理蜕膜组织，获得了较高产量的蜕膜细胞，且几乎无绒毛膜污染。重要的是，分离得到的蜕膜细胞经过表征分析（间质细胞占55–60%，白细胞占35%，上皮细胞占1%，滋养层细胞占0.01%），并保持较高的细胞活力（80%），该结果经多色成像流式细胞术检测确认。该方案特异性针对壁蜕膜，亦可适用于孕早期和孕中期的胎盘组织。分离后的蜕膜细胞可用于多种实验研究，以探讨不同蜕膜细胞亚群在妊娠并发症中的作用。
引言
子宫内膜是成年女性最活跃的组织之一，每个月经周期都会在卵巢激素雌二醇（E2）和孕酮（P4）的刺激下发生显著的重塑。蜕膜，也称为妊娠期子宫内膜，是一种至关重要的生殖组织，在排卵后阶段末期形成，其形成是在E2主导的增殖期之后，由P4驱动的分化过程所致。蜕膜细胞负责分泌激素因子，以支持胚泡的成功植入，并参与构建母胎界面，维持母体对胎儿同种异体移植物的免疫耐受。
蜕膜化是胚胎着床及随后蜕膜螺旋动脉重塑所必需的过程。在月经周期的黄体晚期，子宫内膜间质细胞在孕酮（P4）和环磷酸腺苷（cAMP）的调控下发生蜕膜化1。该过程起始于血管周围，并向间质组织扩散，提示其在血管重塑和白细胞迁移调控中发挥重要作用。这种细胞转化的特征包括细胞呈圆形形态、核体积增大，以及粗面内质网和高尔基体的扩张2。蜕膜化的间质细胞能够分泌多种旁分泌因子，以支持胚泡着床，其特征是分泌大量激素（例如催乳素）、促血管生成生长因子、胰岛素样生长因子结合蛋白-1（IGFBP-1）、前列腺素E（PGE，可刺激细胞内cAMP）、细胞因子、细胞外基质成分以及对胎盘着床和发育至关重要的营养物质3,4,5,
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方案
胎盘采集自接受择期剖宫产、健康足月且未临产的女性。人源样本的采集、处理与处置均遵循西奈山医院伦理委员会的指导原则。每位患者均签署书面知情同意书。本研究已获得西奈山医院研究伦理委员会的批准。
1. 准备工作
注意：所有步骤必须在通风橱内进行，所有外科手术器械在放入通风橱前须经高压灭菌器灭菌。其他所有材料（瓶子、50 mL离心管、 等等。) 必须使用70%乙醇溶液进行灭菌处理。处理生物危害性废物时，务必始终穿戴个人防护装备（实验服、手套、长发束起， 等等。).
- 酶消化液（终体积：200 mL）
- 用移液器将180 mL HBSS-/-转移至500 mL烧杯中，加入无菌搅拌子，置于室温搅拌板上搅拌。
- 依次缓慢称量并加入以下成分至HBSS-/-溶液中：20 mL FBS、400 mg胶原酶2（终浓度 = 2 mg/mL）、20 mg大豆胰蛋白酶抑制剂（终浓度 = 0.1 mg/mL）、30 mg DNase 1（终浓度 = 0.15 mg/mL）和200 mg BSA（终浓度 = 1 mg/mL）。
- 将搅拌速度设为中等，持续搅拌10–20分钟（搅拌期间用锡箔纸或石蜡膜覆盖）。
- 使用塑料漏斗将混合溶液倒入250 mL玻璃瓶中，并置于通风橱内。 ....
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结果
为了验证分离细胞的效率和活性，采用两种方法对细胞进行表征：流式细胞术和免疫细胞化学（ICC）。共针对4种细胞群；采用抗波形蛋白抗体检测蜕膜化间质细胞，使用泛白细胞标志物CD45鉴定蜕膜免疫细胞，采用细胞角蛋白检测上皮/内皮细胞，最后使用细胞角蛋白7检测是否存在潜在的滋养层细胞（绒毛膜或胎盘）污染。
采用多色成像流式细胞术进行表征时，新鲜分离的蜕膜细胞使用可固定染料染色以评估细胞活力。细胞经透化和固定后，使用荧光染料偶联的小鼠单克隆抗体对波形蛋白-APC、CD45-APC-H7、角蛋白-FITC 和角蛋白7-PerCP 进行染色。抗体信息见材料表。染色后的固定细胞置于染色缓冲液中，4 °C 过夜保存，以防止串联染料解离，次日在 ImageStream MK2 成像流式细胞仪上检测。数据分析使用专用软件进行。通过连续设门策略，结合三个依次递进的特征/掩模组合排除细胞碎片和聚集体（图.......
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讨论
本文所述方案展示了一种经济高效且节省时间的方法，用于分离自足月人胎盘完整胎膜中获取的原代蜕膜细胞，该方法简便易行且易于获取样本。本方案的成功依赖于两个关键因素：（1）从胎膜绒毛膜层高效刮取蜕膜组织的效率；（2）在整个操作过程中对蜕膜细胞的谨慎处理。必须通过确保在蜕膜刮取过程中未意外混入绒毛膜组织，并在洗涤步骤中识别和去除任何污染组织，来控制绒毛膜组织的污染（蜕膜与绒毛膜在形态学上的差异使得可能随蜕膜一同收集到的绒毛膜易于被清除）。蜕膜细胞较为脆弱，频繁或快速的移液操作可能导致细胞活力下降。因此，建议移液器的弹出速度应保持在低速，混匀细胞时应尽量减少移液操作。
该方案防止滋养层细胞污染的方法之一是仅从胎盘的胎膜部分（包括壁蜕膜）收集蜕膜组织，而不从胎盘母体面取活检以获取底蜕膜。因此，尽管本方案提高了所分离蜕膜细胞群体的纯度，但仍排除了蜕膜的一部分即 基底蜕膜），这可能对以该部位蜕膜为研究目标或需要同时研究蜕膜两部分的研究构成限制。这一排除构成了本研究最主要的局限性。此外，尽管从人类患者中分离蜕膜细胞可为蜕膜及妊娠相关研究提供更具生物学意义的见解，但由于伦理原因，相较.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露
致谢
作者谨此感谢捐赠者、RCWIH 生物样本库以及玛希诺医院/大学健康网络妇产科系为本研究所提供的人体样本。我们感谢Lye实验室的成员，特别是Caroline Dunk博士在方法开发过程中提供的帮助。本研究由伯勒斯威康基金（资助号 #1013759）提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Hank’s 平衡盐溶液（含钙和镁） | 机构内制备 (LTRI) | ||
| Hank’s 平衡盐溶液（不含钙和镁） | 机构内制备 (LTRI) | ||
| 尿布垫 | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| 大型手术剪刀 | AL Medical | 2018-12-20. | |
| 大型手术镊子 | Fine Science Tools | 11000-18 | |
| 一次性塑料细胞刮刀（25 cm） | Sarstedt | 83.183 | |
| 250 mm（60目）金属筛网 | Sigma-Aldrich | S1020-5EA | |
| 带塑料手柄的一次性手术刀（#21） | Fisher Scientific | 08-927-5D | |
| 无菌塑料培养皿（直径 10 cm） | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| 无菌样本容器（尿杯，4.5 oz） | VWR | 25384-146 | |
| 尼龙滤膜（70 mm） | VWR/Corning | 21008-952 | |
| 红细胞裂解缓冲液 | Qiagen | 79217 | |
| 台盼蓝 0.4% 溶液 | Lonza | 17-942E | |
| Parafilm 封口膜 | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| 血细胞计数板 | Reichert | 1490 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 培养基 | Invitrogen | 11835-055 | |
| 胎牛血清 | Wisent | 080-150 | |
| Normocin（50 mg/mL） | Invivogen | ant-nr-1 | |
| 塑料顶部过滤装置（0.22 µm 滤膜，500 mL） | Millipore | SCGPT05RE | |
| 胶原酶 2，冻干粉末 | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| 大豆胰蛋白酶抑制剂，粉末 | Sigma-Aldrich | T9003-250mg | |
| DNase 粉末 | Roche | 10104159001 | |
| 牛血清白蛋白（BSA 粉末） | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| 转盘共聚焦显微镜 - Leica DMI 6000B | Leica | ||
| 成像流式细胞仪 - ImageStream MK2 | Amnis | ||
| IDEA 软件 | Millipore Sigma | ||
| APC 标记波形蛋白抗体 | R&D Systems | IC2105A | |
| APC H7 标记 CD45 抗体 | BD | 641399 | |
| FITC 标记细胞角蛋白抗体 | MACs Miltenyi Biotec | 130-080-101 | |
| PerCP 标记细胞角蛋白 7 抗体 | Novus | NBP2-47941PCP | |
| eFluor450 可固定活力染料 | Thermo Fisher Scientific | 65-0863-14 | |
| 波形蛋白一抗 | Santa Cruz | sc-7558 | |
| CD45 一抗 | Dako | M0701 | |
| 细胞角蛋白一抗 | Dako | M0821 | |
| 细胞角蛋白 7 一抗 | Dako | M7018 | |
| 小鼠 IgG | Santa Cruz | sc-2025 | |
| 山羊 IgG | Santa Cruz | sc-2028 | |
| Alexa Fluor 546 二抗 | Invitrogen | A10036 | |
| Alexa Fluor 594 二抗 | Fisher Scientific | A-11058 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |
参考文献
- Brosens, N., Hayashi, N., White, J. O. Progesterone receptor regulates decidual prolactin expression in differentiating human endometrial stromal cells. Endocrinology. 140, 4809-4820 (1999).
- Bell, S. C., D'Arcangues, C., Frase, I. S., Newton, J. R., Odlind, V. Decidual....
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重印与许可
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