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方法文章

从足月胎盘的胎膜中分离原代人蜕膜细胞

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DOI：

10.3791/57443

⸱

2018年4月30日

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, University of Toronto, 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Sinai Health System, 3Department of Obstetrics and Gynecology, University of Toronto

本文内容

摘要

本方案展示了一种从足月胎盘的胎膜中分离原代人蜕膜细胞的方法，该方法可用于多种应用（例如免疫细胞化学、流式细胞术、等），旨在研究不同细胞群体在妊娠并发症中的作用。

摘要

蜕膜，也称为妊娠期子宫内膜，是一种极为重要的生殖组织。蜕膜细胞主要由蜕膜化的间质细胞和免疫细胞组成，负责分泌对胚泡成功着床、胎盘发育至关重要的激素和炎症因子，并在足月及早产分娩启动中发挥作用。许多妊娠并发症可能源于构成蜕膜的不同细胞群体之间精细平衡的破坏。特定蜕膜细胞类型比例的改变可能干扰这些关键过程，增加发生严重妊娠并发症的风险，例如胚胎着床失败、宫内生长受限、子痫前期和早产。本文所述方案展示了一种经济且高效的方法，用于从足月胎盘的胎膜中分离原代人蜕膜细胞。通过结合酶消化与轻柔的机械破碎处理蜕膜组织，获得了较高产量的蜕膜细胞，且几乎无绒毛膜污染。重要的是，分离得到的蜕膜细胞经过表征分析（间质细胞占55–60%，白细胞占35%，上皮细胞占1%，滋养层细胞占0.01%），并保持较高的细胞活力（80%），该结果经多色成像流式细胞术检测确认。该方案特异性针对壁蜕膜，亦可适用于孕早期和孕中期的胎盘组织。分离后的蜕膜细胞可用于多种实验研究，以探讨不同蜕膜细胞亚群在妊娠并发症中的作用。

引言

子宫内膜是成年女性最活跃的组织之一，每个月经周期都会在卵巢激素雌二醇（E2）和孕酮（P4）的刺激下发生显著的重塑。蜕膜，也称为妊娠期子宫内膜，是一种至关重要的生殖组织，在排卵后阶段末期形成，其形成是在E2主导的增殖期之后，由P4驱动的分化过程所致。蜕膜细胞负责分泌激素因子，以支持胚泡的成功植入，并参与构建母胎界面，维持母体对胎儿同种异体移植物的免疫耐受。

蜕膜化是胚胎着床及随后蜕膜螺旋动脉重塑所必需的过程。在月经周期的黄体晚期，子宫内膜间质细胞在孕酮（P4）和环磷酸腺苷（cAMP）的调控下发生蜕膜化1。该过程起始于血管周围，并向间质组织扩散，提示其在血管重塑和白细胞迁移调控中发挥重要作用。这种细胞转化的特征包括细胞呈圆形形态、核体积增大，以及粗面内质网和高尔基体的扩张2。蜕膜化的间质细胞能够分泌多种旁分泌因子，以支持胚泡着床，其特征是分泌大量激素（例如催乳素）、促血管生成生长因子、胰岛素样生长因子结合蛋白-1（IGFBP-1）、前列腺素E（PGE，可刺激细胞内cAMP）、细胞因子、细胞外基质成分以及对胎盘着床和发育至关重要的营养物质3,4,5,6。

蜕膜细胞群体不仅包括蜕膜化的间质细胞，还包含大量妊娠特异性的蜕膜白细胞群体。蜕膜化过程涉及暂时性的局部水肿以及自然杀伤（NK）细胞、T细胞、树突状细胞和巨噬细胞的浸润。其中数量最多的白细胞亚群是子宫NK细胞，约占侵入蜕膜的所有母体白细胞的50-70%，这些细胞可分泌细胞因子和促血管生成因子，可能有助于蜕膜化过程，并在整个妊娠期间数量逐渐增加7。巨噬细胞是免疫细胞中数量第二大的亚群，主要分布于着床部位周围，并随着妊娠进展而增多8。它们能够分泌多种细胞因子和生长因子，如集落刺激因子（CSF-1）9、肿瘤坏死因子α（TNFα）10和前列腺素（PG）E11。

在整个妊娠期间以及分娩发动之前，蜕膜是细胞因子和趋化因子的主要来源，这些因子可导致母体外周白细胞活化，并继而迁移至子宫组织，从而启动分娩过程。动物研究表明，在小鼠分娩期间，蜕膜中多种促炎性细胞因子表达上调，例如 TNF-α、IL-6、IL-12 和 IL-1β12。在人类蜕膜中，促炎性细胞因子 IL-1β、IL-6 和 IL-8（主要的中性粒细胞趋化因子）在分娩期间的表达水平高于未分娩状态13。这些分泌的细胞因子导致白细胞在蜕膜组织中被激活并大量浸润14；在足月分娩期间，人类和大鼠的蜕膜巨噬细胞及中性粒细胞浸润均增加，且蜕膜中的浸润程度比子宫肌层高出4倍，表明这两种相邻的子宫组织之间存在活化级联反应15。这些浸润的白细胞可产生前列腺素（PGs），从而引发子宫肌层的同步收缩16，产生基质金属蛋白酶（MMPs）以启动胎膜破裂17,18，同时还释放促炎性细胞因子，进一步放大子宫活化过程（即“细胞因子风暴”）。

由于蜕膜细胞具有多种重要功能，例如在胚胎着床过程中发挥关键作用、在妊娠早期维持母胎耐受性以及参与足月分娩的启动，因此在妊娠期间可能发生多种病理状况。例如：（1）由于蜕膜成熟障碍可导致反复着床失败和反复妊娠丢失，从而引起不孕；（2）因蜕膜/胎盘发育异常或功能障碍，或蜕膜-肌层交界处血管转化受损，可导致宫内生长受限（IUGR）和子痫前期；以及（3）因蜕膜过早激活可导致早产。

鉴于这些重大疾病，加之人类研究中存在的伦理和实际限制 体内 研究中，建立原代人蜕膜细胞系对于 体外 旨在更好地理解并改善妊娠并发症的临床管理。因此，本研究的目标是建立一种可从足月胎盘的胎膜中高效分离人原代蜕膜细胞且细胞得率高、活性好的实验方案。该方案详细描述了一种省时、经济的方法，用于分离特定亚型的蜕膜细胞，可用于多种 体外 分析。在足月时对蜕膜亚群的丰度和表型进行表征，并与妊娠早期或中期进行比较，对于明确这些细胞亚群在整个人类妊娠过程中的作用至关重要。

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方案

胎盘采集自接受择期剖宫产、健康足月且未临产的女性。人源样本的采集、处理与处置均遵循西奈山医院伦理委员会的指导原则。每位患者均签署书面知情同意书。本研究已获得西奈山医院研究伦理委员会的批准。

1. 准备工作

注意：所有步骤必须在通风橱内进行，所有外科手术器械在放入通风橱前须经高压灭菌器灭菌。其他所有材料（瓶子、50 mL离心管、 等等。) 必须使用70%乙醇溶液进行灭菌处理。处理生物危害性废物时，务必始终穿戴个人防护装备（实验服、手套、长发束起， 等等。).

  1. 酶消化液（终体积：200 mL）
    1. 用移液器将180 mL HBSS-/-转移至500 mL烧杯中，加入无菌搅拌子，置于室温搅拌板上搅拌。
    2. 依次缓慢称量并加入以下成分至HBSS-/-溶液中：20 mL FBS、400 mg胶原酶2（终浓度 = 2 mg/mL）、20 mg大豆胰蛋白酶抑制剂（终浓度 = 0.1 mg/mL）、30 mg DNase 1（终浓度 = 0.15 mg/mL）和200 mg BSA（终浓度 = 1 mg/mL）。
    3. 将搅拌速度设为中等，持续搅拌10–20分钟（搅拌期间用锡箔纸或石蜡膜覆盖）。
    4. 使用塑料漏斗将混合溶液倒入250 mL玻璃瓶中，并置于通风橱内。
    5. 将溶液通过塑料上置式滤器（0.22 μm膜滤器，500 mL）过滤，分装至50 mL离心管中，每管20 mL（共10管），于-20 °C保存备用。
  2. RPMI 1640培养基（2%洗涤液和10%完全培养基）
    1. 在通风橱中将RPMI 1640与FBS加入玻璃瓶中混合。
    2. 配制2% FBS溶液：将490 mL RPMI 1640与10 mL FBS混合。
    3. 配制10% FBS溶液：将450 mL RPMI 1640与50 mL FBS混合。
    4. 从上一步含有RPMI培养基和FBS的500 mL玻璃瓶中，加入500 μL Normocin（储存液浓度50 mg/mL，工作浓度0.05 mg/mL）。
    5. 将培养基通过0.22 μm膜滤器过滤，储存于500 mL玻璃瓶中，4 °C保存备用。
  3. 实验开始前30分钟，将一份20 mL冷冻的酶消化液置于37 °C金属珠浴中预热，将含2% FBS和10% FBS的RPMI 1640培养基也置于37 °C金属珠浴中预热，开启摇床水浴并设置为37 °C、2 g，同时将温度控制离心机预冷至4 °C。

2. 从足月胎膜中收集蜕膜组织

  1. 在通风橱下的架子上放置装有 HBSS+/+、HBSS-/- 的瓶子以及五个 50 mL 离心管。用移液器将 25 mL HBSS+/+ 加入其中一根离心管中。
  2. 戴上手套后，从用于从手术室运送胎盘的容器中取出足月胎盘。将胎盘放置在尿垫上（母体面朝上），使用剪刀和镊子展开羊膜。
    1. 在通风橱内铺上重叠的尿垫。
    2. 使用另一块尿垫将胎盘翻转，使母体面朝上。
    3. 找到羊膜破裂的位置，并进行切口，使羊膜能够展开并平铺在通风橱表面。
      注意：一旦羊膜从胎盘上拉开，蜕膜将朝上位于绒毛膜层之上，而羊膜层则在背面。
  3. 使用塑料细胞刮棒，小心地将蜕膜组织从绒毛膜上刮下，并放入含有 25 mL HBSS+/+ 的 50 mL 离心管中。
  4. 以中等压力刮取膜组织。切勿施加过大压力，以免造成绒毛膜污染。同时收集小的血凝块，因为其中也含有部分蜕膜细胞。
    警告：蜕膜组织采集完成后，胎盘必须包装在生物危害塑料容器中，并在 -20 °C 冰箱中冷冻，随后根据所在机构的规定进行妥善处理。沾血的尿垫须用密封塑料袋包裹，并丢弃至生物危害安全箱中。

3. 胎盘蜕膜组织的洗涤与酶消化

  1. 用手轻轻摇动50 mL离心管，并将其通过置于无菌标本（尿液）容器上方的250 μm金属筛网（250 μm，60目）清洗收集的组织。
  2. 每次清洗均使用新的离心管，用HBSS+/+洗涤两次，再用HBSS-/-洗涤两次。（最后使用HBSS-/-洗涤可去除HBSS+/+中存在的钙和镁离子，避免干扰后续的酶消化过程）。
    注意：在洗涤过程中，绒毛膜组织污染会较为明显，因为蜕膜组织呈淡粉色、无定形，而绒毛膜则呈白色、致密且呈纤维状。因此，可用镊子轻易去除绒毛膜污染。
  3. 可选步骤：若蜕膜组织较厚，可将其转移至无菌的直径10 cm培养皿中，并用两把相对方向的手术刀在培养皿内进行切碎处理。
  4. 将清洗后的组织放入无菌50 mL离心管中，加入含100 mg组织/mL酶消化液的溶液（见制备步骤）。
    1. 作为参考，确保蜕膜组织的体积达到50 mL离心管上的5–10 mL刻度线之间。
    2. 使用约20 mL酶消化液（按步骤1.1制备）消化从一整片足月胎膜中收集的全部蜕膜组织。
  5. 在生物安全柜内用石蜡膜密封离心管盖（确保管盖拧紧，并用石蜡膜包裹管盖及管口顶部），然后将蜕膜组织置于37 °C振荡水浴中孵育20分钟（145 rpm，2 g）。
  6. 孵育结束后，移除石蜡膜，用70%乙醇对含有已消化组织的离心管表面进行消毒，并转移至通风橱内。用手短暂摇晃离心管。
  7. 通过金属筛网（250 μm，60目）收集细胞悬液至新的无菌标本容器中。加入等体积（20 mL）含0.1%诺尔霉素的RPMI + 10% FBS溶液稀释，以终止酶反应。立即进入离心步骤4.1。
  8. 如有必要，将未完全消化的残留组织重新放入新的50 mL离心管中，加入20 mL新鲜酶消化液，重复消化（20分钟，37 °C，振荡水浴）。
  9. 若需进行第二次消化，将第一次消化所得含细胞悬液的离心管置于冰上（用石蜡膜覆盖以保持无菌状态）。重复步骤3.5–3.6，并将两次获得的细胞悬液合并。

4. 制备单细胞悬液

  1. 将细胞悬液离心（420 g，4 °C，11 分钟）。
  2. 弃去上清液，并将细胞重悬于 40 mL 含 0.1% normocin 的 RPMI + 2% FBS 中（“洗涤缓冲液”）。
    注意：由于红细胞污染，细胞沉淀较为疏松且呈胶状，吸除上清液时需小心。可能需要使用手动移液器移除上层液体。
  3. 在 4 °C 下以 420 g 离心 11 分钟，重复一次。
  4. 小心弃去上清液（参见步骤 4.2 的注意事项），将细胞沉淀重悬于 5 mL 洗涤缓冲液中，然后在同一管中加入 35 mL 红细胞裂解缓冲液。
    注意：如果沉淀量较大或血液含量较高，可将沉淀分至两管进行红细胞裂解步骤，即加入 10 mL 洗涤缓冲液后均分为两管，再向每管中加入 35 mL 红细胞裂解缓冲液。
  5. 冰上孵育 20 分钟。在孵育开始和结束时短暂涡旋管子，以裂解红细胞。
  6. 在 4 °C 下以 420 g 离心 11 分钟。
  7. 小心弃去上清液，并将沉淀重悬于 40 mL 洗涤缓冲液中。
  8. 将细胞通过 70 μm 尼龙滤膜，以去除细胞团块。
  9. 在 4 °C 下以 420 g 离心 11 分钟。
  10. 弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于 10 mL 完全培养基中（RPMI + 10% FBS 含 0.1% normocin）。
  11. 使用台盼蓝染料排斥法血细胞计数板操作计数细胞，步骤如下：
    1. 在超净工作台内，轻轻吹打细胞悬液 3 次，充分混匀后与台盼蓝混合。在 1.5 mL 离心管中制备细胞悬液，稀释比例为 1:2（混合 20 μL 台盼蓝溶液与 20 μL 蜕膜细胞悬液）。通过上下吹打数次小心混匀台盼蓝-细胞混合液（此溶液非无菌）。
    2. 将血细胞计数板置于显微镜载物台上，盖上盖玻片。
      注意：血细胞计数板是一种带有网格的显微镜载片，分为九个大方格，每条线由三条平行线构成。每个大方格面积为 1 mm2，计数室深度为 0.1 mm。因此，每个大方格可容纳液体体积为 1 mm × 1 mm × 0.1 mm = 0.1 mm3 = 10-4 mL。
    3. 缓慢将 10 μL 台盼蓝-细胞混合液加入血细胞计数板的凹槽中，利用毛细作用使液体均匀扩散至整个计数区域（在液体充满计数室前停止加样）。
    4. 在显微镜下（10 倍物镜）观察细胞，计数血细胞计数板四个角的大方格中所有排除台盼蓝的白色/绿色细胞（即活细胞）。计数时，仅计接触右侧和上侧边界的细胞，不计接触左侧和下侧边界的细胞。不计数深蓝色细胞；蓝色表明细胞已死亡，因为台盼蓝染料可轻易穿透细胞膜进入胞质。
    5. 计算 1 mL 细胞悬液中的活细胞数量（X）：
      细胞计数公式，X = (总细胞数/4) × 2 × 10,000；数学方程。
      2 = 稀释倍数
      10,000 = 换算系数（1 mL = 1 cm3 = 10,000 × 0.1 mm3）
  12. 将蜕膜细胞用 RPMI + 10% FBS（生长培养基）稀释至所需终浓度。
    注意：进行组织培养接种时，将 2×106 个细胞/孔接种至 6 孔塑料培养板，或将 10×106 个细胞接种至 10 cm 塑料培养皿，或接种 75,000 个细胞至玻璃盖玻片。

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结果

为了验证分离细胞的效率和活性，采用两种方法对细胞进行表征：流式细胞术和免疫细胞化学（ICC）。共针对4种细胞群；采用抗波形蛋白抗体检测蜕膜化间质细胞，使用泛白细胞标志物CD45鉴定蜕膜免疫细胞，采用细胞角蛋白检测上皮/内皮细胞，最后使用细胞角蛋白7检测是否存在潜在的滋养层细胞（绒毛膜或胎盘）污染。

采用多色成像流式细胞术进行表征时，新鲜分离的蜕膜细胞使用可固定染料染色以评估细胞活力。细胞经透化和固定后，使用荧光染料偶联的小鼠单克隆抗体对波形蛋白-APC、CD45-APC-H7、角蛋白-FITC 和角蛋白7-PerCP 进行染色。抗体信息见材料表。染色后的固定细胞置于染色缓冲液中，4 °C 过夜保存，以防止串联染料解离，次日在 ImageStream MK2 成像流式细胞仪上检测。数据分析使用专用软件进行。通过连续设门策略，结合三个依次递进的特征/掩模组合排除细胞碎片和聚集体（图...

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讨论

本文所述方案展示了一种经济高效且节省时间的方法，用于分离自足月人胎盘完整胎膜中获取的原代蜕膜细胞，该方法简便易行且易于获取样本。本方案的成功依赖于两个关键因素：（1）从胎膜绒毛膜层高效刮取蜕膜组织的效率；（2）在整个操作过程中对蜕膜细胞的谨慎处理。必须通过确保在蜕膜刮取过程中未意外混入绒毛膜组织，并在洗涤步骤中识别和去除任何污染组织，来控制绒毛膜组织的污染（蜕膜与绒毛膜在形态学上的差异使得可能随蜕膜一同收集到的绒毛膜易于被清除）。蜕膜细胞较为脆弱，频繁或快速的移液操作可能导致细胞活力下降。因此，建议移液器的弹出速度应保持在低速，混匀细胞时应尽量减少移液操作。

该方案防止滋养层细胞污染的方法之一是仅从胎盘的胎膜部分（包括壁蜕膜）收集蜕膜组织，而不从胎盘母体面取活检以获取底蜕膜。因此，尽管本方案提高了所分离蜕膜细胞群体的纯度，但仍排除了蜕膜的一部分即 基底蜕膜），这可能对以该部位蜕膜为研究目标或需要同时研究蜕膜两部分的研究构成限制。这一排除构成了本研究最主要的局限性。此外，尽管从人类患者中分离蜕膜细胞可为蜕膜及妊娠相关研究提供更具生物学意义的见解，但由于伦理原因，相较...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露

致谢

作者谨此感谢捐赠者、RCWIH 生物样本库以及玛希诺医院/大学健康网络妇产科系为本研究所提供的人体样本。我们感谢Lye实验室的成员，特别是Caroline Dunk博士在方法开发过程中提供的帮助。本研究由伯勒斯威康基金（资助号 #1013759）提供支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Hank’s 平衡盐溶液（含钙和镁）机构内制备 (LTRI)
Hank’s 平衡盐溶液（不含钙和镁）机构内制备 (LTRI)
尿布垫Sigma-AldrichD9542
大型手术剪刀AL Medical2018-12-20.
大型手术镊子Fine Science Tools11000-18
一次性塑料细胞刮刀（25 cm）Sarstedt83.183
250 mm（60目）金属筛网Sigma-AldrichS1020-5EA
带塑料手柄的一次性手术刀（#21）Fisher Scientific08-927-5D
无菌塑料培养皿（直径 10 cm）Sarstedt82.1473.001
无菌样本容器（尿杯，4.5 oz）VWR25384-146
尼龙滤膜（70 mm）VWR/Corning21008-952
红细胞裂解缓冲液Qiagen79217
台盼蓝 0.4% 溶液Lonza17-942E
Parafilm 封口膜Fisher Scientific13-374-10
血细胞计数板Reichert1490
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 培养基Invitrogen11835-055
胎牛血清Wisent080-150
Normocin（50 mg/mL）Invivogenant-nr-1
塑料顶部过滤装置（0.22 µm 滤膜，500 mL）MilliporeSCGPT05RE
胶原酶 2，冻干粉末Sigma-AldrichC6885
大豆胰蛋白酶抑制剂，粉末Sigma-AldrichT9003-250mg
DNase 粉末Roche10104159001
牛血清白蛋白（BSA 粉末）Fisher ScientificBP1600-100
转盘共聚焦显微镜 - Leica DMI 6000BLeica
成像流式细胞仪 - ImageStream MK2Amnis
IDEA 软件Millipore Sigma
APC 标记波形蛋白抗体R&D SystemsIC2105A
APC H7 标记 CD45 抗体BD641399
FITC 标记细胞角蛋白抗体MACs Miltenyi Biotec130-080-101
PerCP 标记细胞角蛋白 7 抗体NovusNBP2-47941PCP
eFluor450 可固定活力染料Thermo Fisher Scientific65-0863-14
波形蛋白一抗Santa Cruzsc-7558
CD45 一抗DakoM0701
细胞角蛋白一抗DakoM0821
细胞角蛋白 7 一抗DakoM7018
小鼠 IgGSanta Cruzsc-2025
山羊 IgGSanta Cruzsc-2028
Alexa Fluor 546 二抗InvitrogenA10036
Alexa Fluor 594 二抗Fisher ScientificA-11058
DAPISigma-AldrichD9542

参考文献

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