通过一种创新的RNA 原位检测技术鉴定啮齿类动物伏隔核中的多巴胺D1-α受体

摘要

在伏隔核中鉴定多巴胺 D1-α 受体对于阐明中枢神经系统疾病期间 D1 受体功能障碍至关重要。我们采用了一种新型的 RNA 原位 杂交检测方法，以可视化特定脑区中的单个 RNA 分子。

摘要

在中枢神经系统中，D1-α亚型受体（Drd1α）是最丰富的多巴胺（DA）受体，其在调控神经元生长与发育过程中发挥关键作用。然而，Drd1α受体异常介导行为反应并调节工作记忆功能的机制仍不明确。本研究采用一种新型的RNA in situ 杂交检测方法，分别鉴定出多巴胺Drd1α受体和酪氨酸羟化酶（TH）RNA在伏隔核（NAc）区域及黑质区（SNR）多巴胺相关环路中的表达。Drd1α在NAc中的表达呈现"离散点状"染色模式。Drd1α表达存在明显的性别差异。相比之下，TH则呈现"成簇"染色模式。在TH表达方面，雌性大鼠每细胞的信号表达水平高于雄性动物。本文所展示的方法提供了一种新型的in situ 杂交技术，可用于研究中枢神经系统疾病进展过程中多巴胺系统功能障碍的变化。

引言

纹状体多巴胺系统的功能障碍参与了多种神经认知疾病临床症状的进展过程。多巴胺 D1 受体存在于大脑的前额叶皮层（PFC）和纹状体区域，对认知过程具有重要影响¹，包括工作记忆、时间加工以及运动行为^2,3,4,5,6,7。先前的研究阐明，多巴胺 D1 受体的变化与注意缺陷多动障碍（ADHD）的进展⁸、精神分裂症中的神经认知症状^9,10以及应激易感性¹¹密切相关。特别是在精神分裂症中，正电子发射断层扫描（PET）研究显示，前额叶皮层中多巴胺 D1 受体的结合能力与认知缺陷及阴性症状的存在高度相关¹¹。多巴胺 D1 受体调控前额叶皮层兴奋性神经元的树突发育，从而减轻应激易感性。此外，在内侧前额叶皮层（mPFC）神经元中敲低 D1 受体可增强社会挫败应激引起的社会回避行为¹²。

本文介绍了一种利用新鲜冷冻组织样本在细胞内原位可视化单个 RNA 分子的新型 RNA 原位 杂交技术。该方法相较于现有文献中的其他方法具有多项优势。首先，本实验流程保留了组织的空间结构和形态学特征，并使用新鲜冷冻的组织样本进行操作，因此可与其他需要新鲜、未包埋组织的实验方法联合应用。已有研究在福尔马林固定、石蜡包埋的组织中采用类似的 RNA 原位 杂交技术实现了单次转录水平的检测¹³。在单次转录水平上对 RNA 进行检测，相较于其他核酸检测方法（如聚合酶链式反应（PCR）技术），能够提供更高的低拷贝数表达敏感性，并实现单个细胞水平上的基因表达比较。此外，本方法通过高度特异性的 RNA 探针与单个靶标 RNA 转录本杂交，并在检测系统中依次结合信号放大分子级联反应，从而获得高信噪比的成像结果。最后，本技术采用靶标特异性的专有探针，使研究者能够评估多种不同的生物系统，而不局限于仅使用一类系统相关标志物（如免疫组织化学方法中的蛋白质检测）的研究模式。

在本研究中，我们采用这种新型的RNA原位杂交技术，检测了雄性和雌性F344/N大鼠伏隔核（NAc）中Drd1α受体的表达以及黑质（SNR）中酪氨酸羟化酶（TH）的表达。这种创新的RNA原位杂交技术使我们能够同时研究影响多巴胺（DA）摄取和多巴胺（DA）释放的机制，从而加深了对纹状体多巴胺系统复杂性的理解。本文描述了新鲜冷冻脑切片的实验流程，并提供了针对不同染色模式——"离散点状"或"簇状"——的数据分析方法。

方案

该实验方案已获南卡罗来纳大学动物护理与使用委员会（IACUC）批准（联邦保证编号：A3049-01）。

1. 新鲜冷冻脑切片的制备

1. 使用F344/N大鼠品系：每性别三只，13月龄，体重约320 g。
2. 将七氟烷浓度调整至5%（七氟烷过量）。在呼吸停止后继续暴露于七氟烷环境中1分钟。
3. 将大鼠断头并取出脑组织。
4. 在组织取材后5 分钟内，将大鼠脑组织浸入液氮中15秒。
5. 在冷冻切片机中将脑组织平衡至-20 °C，持续1 h。
6. 切取30 µm厚的切片，并转移至载玻片上（参见材料表）。
7. 选择位于伏隔核区域的切片，位置约为前囟前2.76 mm至2.28 mm¹⁴。
8. 根据大鼠立体定位脑图谱，从嗅球连续切片至伏隔核区域。
9. 将样本固定于载玻片上。将切片置于-20 °C环境中干燥10分钟。
10. 立即将载玻片浸入预冷的4%多聚甲醛中，在4 °C下固定1小时。
11. 在室温（RT）下将载玻片依次放入浓度递增的乙醇梯度中：50% EtOH中5 分钟；70% EtOH中5 分钟；100% EtOH中5 分钟。
12. 用新鲜的100% EtOH重复一次。
13. 将载玻片置于吸水纸上，自然风干。
14. 使用疏水屏障笔在每个切片周围画出隔离圈（参见材料表）。等待屏障完全干燥1分钟。

2. 脑切片的预处理

1. 打开烤箱，将温度设置为 40 °C。
2. 在每张脑切片（每张载玻片一张切片）上加入 3 滴（90 µL）预处理液 4 试剂（参见材料表）。
3. 在室温下孵育切片 30 分钟。
4. 将载玻片浸入 1x PBS 中，室温下 1 分钟。用新鲜的 1x PBS 重复一次。
   注意：载玻片在 1x PBS 中停留时间不应超过 15 分钟。

3. RNA 原位杂交荧光多重检测

1. 将目标探针在水浴中于 40 °C 温育 10 分钟，然后冷却至室温。
2. 将 RNA 试剂（例如 Amp 1-4 FL）置于室温。
3. 用吸水纸去除玻片上的多余液体，并将玻片放回玻片架上（参见 材料表）。
4. 在样本切片上加入 3 滴（90 µL）Drd1α 探针（C1），于 40 °C 孵育 2 小时。
5. 将玻片浸入 1x 洗涤缓冲液中，在室温下洗涤 2 分钟。更换新鲜的 1x 洗涤缓冲液重复一次。
6. 用吸水纸去除玻片上的多余液体，并将玻片放回玻片架上（参见 材料表）。
7. 在样本切片上加入 3 滴（90 µL）Amp 1-FL，于 40 °C 孵育 30 分钟。
8. 将玻片浸入 1 倍洗涤缓冲液中，在室温下洗涤 2 分钟。更换新鲜的 1 倍洗涤缓冲液重复一次。
9. 用吸水纸去除玻片上的多余液体，并将玻片放回玻片架上（参见 材料表）。
10. 在样本切片上加入 3 滴（90 µL）Amp 2-FL，于 40 °C 孵育 15 分钟。
11. 将玻片浸入 1x 洗涤缓冲液中，在室温下洗涤 2 分钟。更换新鲜的 1x 洗涤缓冲液重复一次。
12. 用吸水纸去除玻片上的多余液体，并将玻片放回玻片架上（参见 材料表）。
13. 在样本切片上加入 3 滴（90 µL）Amp 3-FL，于 40 °C 孵育 30 分钟。
14. 将玻片浸入 1x 洗涤缓冲液中，在室温下洗涤 2 分钟。更换新鲜的 1x 洗涤缓冲液重复一次。
15. 用吸水纸去除玻片上的多余液体，并将玻片放回玻片架上（参见 材料表）。
16. 在样本切片上加入 3 滴（90 µL）Amp 4-FL-Alt A，于 40 °C 孵育 15 分钟。
17. 将玻片浸入 1x 洗涤缓冲液中，在室温下洗涤 2 分钟。更换新鲜的 1x 洗涤缓冲液重复一次。
18. 去除玻片上的多余液体，并立即在每个切片上加入 2 滴封片试剂（参见 材料表）。
19. 在每个脑切片上覆盖一张 22 mm × 22 mm 的盖玻片（参见 材料表）。
20. 将玻片置于 2–8 °C 避光保存，直至干燥。
21. 打开共聚焦显微镜，并切换至 60X 物镜。
22. 使用共聚焦显微镜获取 Z 轴层扫图像。共聚焦成像的详细操作步骤参见补充视频。
23. 采集伏隔核区域 Drd1α 标记细胞的图像（激发波长：488 nm；发射波长：515/30 nm）。
    注意：孵育步骤之间切勿让脑切片干燥。

4. 数据分析

1. 半定量分析染色模式："离散点状"。
   1. 为从图像中识别单个细胞，进行DAPI染色作为核标记。然而，由于脑组织含有多种细胞类型，且细胞核和/或细胞形态不规则，某些区域仍难以分析。在此，由两名经验丰富的研究人员分别根据图像对每个细胞进行标注，以界定细胞区域。
   2. 根据每个细胞内的点状结构数量，结合特定标准，对代表性共聚焦图像中的每个细胞进行目视评分（图1B）。
   3. 确定每类细胞的总数，并除以细胞总数乘以100，绘制相对频率图，显示所有组织切片中每类细胞的百分比频率（图2A），以及分别显示男性和女性的百分比频率（图2E）。
   4. 将所有前述类别中的细胞总数除以细胞总数乘以100，计算所有组织切片中细胞的累积频率（图2B），以及分别计算男性和女性的累积频率（图2F）。
2. 对"离散点状"染色模式进行统计学分析（可选）。
   1. 分析每个细胞内的点状结构数量，生成一个具有顺序性质的分类变量（即，将细胞按表达水平从最低（1）到最高（9）分为若干等级类别），用于进一步的统计分析。
   2. 在进行描述性统计分析后，采用三种主要方法：Mantel-Haenszel检验、Mann-Whitney U检验和Kruskal-Wallis检验。尽管具体的统计方法取决于实验设计和研究问题，但统计决策树（图4）可帮助选择合适的分析方法。
3. 对染色模式："簇状"，在感兴趣区域（ROI）内定量信号强度。
   1. 使用以下公式计算每张图像的信号强度：
      信号强度 = ROI图像的总强度 - （平均背景强度 × 图像总面积）
   2. 统计ROI图像内细胞的总数，以计算每个细胞的近似信号表达量。组间在信号强度/图像以及细胞数/图像上的差异可能有助于解释信号表达/细胞差异的潜在机制（图3B-3D）。
4. 对"簇状"染色模式进行统计学分析（可选）。
   1. 分析每个细胞的信号表达量，生成一个连续变量用于进一步统计分析。根据实验设计中包含的组间因素数量，采用两种方法：独立样本t检验和方差分析（ANOVA）。统计决策树（图4）可帮助选择最合适的统计方法。

结果

本研究在F344/N大鼠伏隔核（NAc）的多巴胺D1-α受体（Drd1α）RNA表达中观察到“离散点状”染色模式（图1A）。单个荧光信号易于识别，表现为独立的“点”，每一点代表细胞内一条RNA转录本。对于呈现“离散点状”染色模式的NAc图像，我们采用半定量分析方法评估其表达的动态范围（图1A，图2A&2B）。根据每个细胞内的点数，将每个细胞评分定为“0-9”分。该“杂交信号”评分法（H-score）因而可评估Drd1α在单个细胞间表达的程度及其变异性。

半定量方法用于 "离散点" 染色模式提供一个本质上为有序的分类变量（即， 每个细胞的点数按从低（1）到高（9）排序，用于进一步的统计分析。在本研究中，...

讨论

在本方案中，我们描述了一种新颖的技术 原位 用于新鲜冷冻脑切片的杂交实验，以评估伏隔核（NAc）中Drd1α受体的表达以及黑质网状部（SNR）区域酪氨酸羟化酶（TH）的表达。我们还提供了针对不同染色模式的数据分析方法： "离散点" 或 "簇".

成功的多重荧光RNA原位杂交实验的关键步骤如下：在处死大鼠并取出脑组织后，须在5分钟内将脑组织置于液氮中速冻。脑组织切片应保存在-20 °C，直至进行4%多聚甲醛固定。预处理4步骤孵育30分钟后，载玻片在1×PBS中的停留时间不得超过15分钟。在扩增步骤之间，切勿让脑组织切片干燥。共聚焦成像对于获取高质量图像、清晰显示组织样本中的染色信号非常有帮助。使用杂交炉可快速高效地将样本温度升至40 °C。

伏隔核中Drd1α受体表达的单个荧光信号被识别为单个"点状信号"，每个点状信号代表细胞内的一个RNA转录本。需要强调的是，"点状信号"的大小反映了检测条件、样本制备及其他因素的差异，而非Drd...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HybEZ 烤箱系统	Advanced Cell Diagnostics	310010
RNAscope 探针 - Rn-Drd1a	Advanced Cell Diagnostics	317031	荧光通道 1，绿色
RNAscope 探针 - Rn-Th-C2	Advanced Cell Diagnostics	314651-C2	荧光通道 2，橙色
RNAscope 荧光多重检测试剂盒	Advanced Cell Diagnostics	320850
ImmEdge 疏水屏障笔	Vector Laboratory	H-4000
SuperFrost Plus 载玻片	Fisher Scientific	12-550-154%
4% 多聚甲醛	Sigma-Aldrich	158127-500G
七氟烷	Merritt Veterinary Supply	347075
Tissue-Tek 垂直 24 片染色架	Fisher Scientific	NC9837976
Tissue-Tek 染色皿	Fisher Scientific	NC0731403
Precision 通用恒温水浴槽	ThermoFisher Scientific	TSGP28
预处理液 4	Advanced Cell Diagnostics	320850	试剂盒组分
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Life Technologies	P36930
Amp 1-FL	Advanced Cell Diagnostics	320850	试剂盒组分
Amp 2-FL	Advanced Cell Diagnostics	320850	试剂盒组分
Amp 3-FL	Advanced Cell Diagnostics	320850	试剂盒组分
Amp 4-FL-Alt A	Advanced Cell Diagnostics	320850	试剂盒组分
EZ-C1 软件包	Nikon Instruments		版本 3.81b
SAS/STAT 软件	SAS Institute, Inc.,		版本 9.4