描述了在肺血管内皮细胞感染后产生细胞毒性淀粉样蛋白的简单检测方法 铜绿假单胞菌.
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摘要
摘要
肺炎幸存患者在出院后的数月内死亡率升高。有假说认为，肺炎期间肺组织感染会导致长寿命细胞毒素的产生，进而引发后续的终末器官衰竭。我们已建立体外（in vitro）检测方法，用于验证肺部感染过程中产生细胞毒素的假说。采用分离的大鼠肺微血管内皮细胞和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）作为模型系统，通过细胞培养结合乳酸脱氢酶检测及一种基于ImageJ技术的新型显微方法，直接定量细菌感染内皮细胞后细胞毒素的生成。通过硫黄素T结合实验、A11抗淀粉样蛋白抗体的免疫印迹和免疫耗竭实验，证实了这些细胞毒素具有淀粉样特性。进一步的免疫印迹分析表明，铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）感染后，内皮细胞可产生并释放寡聚态tau蛋白和Aβ蛋白。这些方法应可便捷地适用于人类临床样本的分析。
引言
肺炎幸存患者在出院后的数月内死亡率升高1,2,3,4,5,6。大多数死亡病例由某种类型的终末器官衰竭所致，包括肾、肺、心脏或肝脏事件，以及脑卒中5,6。该患者群体死亡率升高的原因至今尚未明确。
肺炎可分为社区获得性肺炎和医院获得性（院内）肺炎，可引起肺炎的病原体包括细菌、病毒、真菌和化学物质。院内肺炎的主要致病菌之一是铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。P. aeruginosa 是一种革兰氏阴性菌，通过III型分泌系统将多种效应分子（称为外毒素）直接转运至宿主细胞的细胞质中7,8。在感染肺部内皮细胞过程中，这些外毒素会靶向多种细胞内蛋白，包括微管相关蛋白tau的一种内皮异构体
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方案
所有动物实验程序均经南阿拉巴马大学机构动物护理委员会审查和批准，并严格按照所有联邦、州和地方的法规进行。大鼠肺微血管内皮细胞（PMVECs）的原代培养物由南阿拉巴马大学肺生物学中心细胞培养核心设施提供。细胞制备采用先前描述的方法16。
1. 细胞毒性上清液的制备
注意：此处我们使用两种不同的铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）菌株：PA103，其具有完整的第一型三型分泌系统，能够在感染期间将外毒素ExoU和ExoT转运至靶细胞；以及∆PcrV，该菌株缺乏三型分泌系统，接种后无法将外毒素转运至靶细胞。
- 将细菌划线接种至Vogel-Bonner（VB）琼脂平板上17，并在37 °C下培养过夜。
- 制备平板时，配制以下储存液（Vogel-Bonner盐溶液；10x 储存液）：称取2 g MgSO4、20 g柠檬酸（游离酸）、100 g K2PO4和35 g NaH2PO4，加入ddH2O定容至1 L，15分钟高压灭菌（慢速排气）。
- 将7.5 g琼脂加入450 mL ddH2O中，按....
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结果
一种简单的方法 体外 已开发出一种检测方法，用于检测受细菌感染的细胞上清液中细胞毒素的存在 P. aeruginosa将感染细胞的培养基在加入细菌4小时后收集，通过滤膜除菌法去除培养上清液中的细菌，然后将无菌上清液加入新的细胞群体中。在加入上清液后21至24小时观察细胞，量化细胞杀伤效应。
将P. aeruginosa加入融合的PMVECs单层细胞后，可诱导细胞间出现间隙。体内实验中，细胞间隙的形成会导致肺水肿和肺功能下降。在本实验方法中，细胞间隙的形成为筛选细胞培养上清液中细胞毒素释放的时间点，而PA103菌株孵育时间是否充分，可通过细胞单层中开始出现间隙来判断，如图1所示。在相同孵育条件下，ΔPcrV细菌不会诱导细胞间隙的形成。一旦观察到细胞间隙，即收集上清液，经滤膜除菌后加入未经处理的PMVECs，以评估其细胞毒性活.......
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讨论
此处，简单的 体外 本文概述了可用于证明在引起肺炎的病原体感染过程中产生细胞毒性淀粉样蛋白的方法。这些方法包括细胞培养细胞毒性检测、免疫印迹、利用一种新型显微技术对细胞杀伤进行定量分析，以及硫磺素T（ThT）结合实验。对细胞毒性物质的分析表明，其具有淀粉样蛋白的特性。图2 和 图4）并表现出朊病毒的特征12肺炎期间产生细胞毒性朊病毒分子可能解释了肺炎幸存者在出院后死亡率升高的现象。目前正在开展实验以验证这一可能性。
所有上述研究的关键事件均为细胞毒性上清液的生成，需要考虑两个重要变量。首先，在所述实验中，大鼠肺微血管内皮细胞（PMVECs）被同时用于感染步骤和细胞毒性检测。目前尚未深入研究其他细胞类型是否可用于细胞毒素的生产，但有可能其他细胞在经不同菌株的铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）处理后也能产生细胞毒性上清液。如前所示，这些细胞毒素.......
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披露
无任何事项需要报告。
致谢
本研究部分由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号如下：TS、RB 和 SL 获得 HL66299，TS 获得 HL60024，MF 获得 HL136869。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 兔抗β-淀粉样蛋白抗体 | Thermo | 71-5800 | |
| A11淀粉样蛋白寡聚体抗体 | StressMarq | SPC-506D | |
| T22抗tau蛋白寡聚体抗体 | EMD Millipore | ABN454 | |
| 硫黄素T | Sigma Aldrich | T3516 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| 0.22微米注射器滤器 | Millipore | SLGP033RS | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG | Abcam | ab6721-1 | |
| 菌株PA103和ΔPcrV | 这些铜绿假单胞菌菌株由美国威斯康星医学院密尔沃基分校的Dara Frank博士提供 | ||
| 异硫氰酸荧光素标记的刀豆蛋白Griffonia lectin | Sigma Aldrich | L9381 | |
| 四甲基罗丹明标记的蜗牛凝集素Helix pomatia lectin | Sigma Aldrich | L1261 | |
| 琼脂 | Fisher | BP1423-500 | |
| 0.22微米硝酸纤维素膜 | BioRad | 162-0112 | |
| II型胶原酶 | Worthington | LS004176 | |
| 胎牛血清 | Hyclone | SH30898.03IH | |
| 青霉素-链霉素溶液（PenStrep） | Gibco | 15070063 | |
| 羧苄青霉素二钠盐 | Sigma | C1389 | |
| 微量离心浓缩管-10,000分子量截留 | Millipore | UFC801008 | |
| 磷酸氢二钾 | Sigma | 795496-500G | |
| 七水合磷酸氢镁 | MP Biomedicals | MP021914221 | |
| 柠檬酸 | G Biosciences | 50-103-5801 | |
| 七水合磷酸氢二钠 | Sigma | S9506-500G | |
| Countess全自动细胞计数仪 | Invitrogen | C10277 |
参考文献
- Brancati, F. L., Chow, J. W., Wagener, M. M., Vacarello, S. J., Yu, V. L. Is pneumonia really the old man's friend? Two-year prognosis after community-acquired pneumonia. Lancet. 342 (8862), 30-33 (1993).
- Hedlund, J. U., Ortqvist, A. B., Kalin, M. E., Granath, F.
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