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方法文章

检测肺内皮细胞感染后细胞毒性淀粉样蛋白的方法 铜绿假单胞菌

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DOI：

10.3791/57447

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2018年7月12日

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1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of South Alabama, 2Department of Physiology and Cell Biology, University of South Alabama, 3Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of South Alabama, 4Center for Lung Biology, University of South Alabama

本文内容

摘要

描述了在肺血管内皮细胞感染后产生细胞毒性淀粉样蛋白的简单检测方法 铜绿假单胞菌.

摘要

肺炎幸存患者在出院后的数月内死亡率升高。有假说认为，肺炎期间肺组织感染会导致长寿命细胞毒素的产生，进而引发后续的终末器官衰竭。我们已建立体外（in vitro）检测方法，用于验证肺部感染过程中产生细胞毒素的假说。采用分离的大鼠肺微血管内皮细胞和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）作为模型系统，通过细胞培养结合乳酸脱氢酶检测及一种基于ImageJ技术的新型显微方法，直接定量细菌感染内皮细胞后细胞毒素的生成。通过硫黄素T结合实验、A11抗淀粉样蛋白抗体的免疫印迹和免疫耗竭实验，证实了这些细胞毒素具有淀粉样特性。进一步的免疫印迹分析表明，铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）感染后，内皮细胞可产生并释放寡聚态tau蛋白和Aβ蛋白。这些方法应可便捷地适用于人类临床样本的分析。

引言

肺炎幸存患者在出院后的数月内死亡率升高1,2,3,4,5,6。大多数死亡病例由某种类型的终末器官衰竭所致，包括肾、肺、心脏或肝脏事件，以及脑卒中5,6。该患者群体死亡率升高的原因至今尚未明确。

肺炎可分为社区获得性肺炎和医院获得性（院内）肺炎，可引起肺炎的病原体包括细菌、病毒、真菌和化学物质。院内肺炎的主要致病菌之一是铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。P. aeruginosa 是一种革兰氏阴性菌，通过III型分泌系统将多种效应分子（称为外毒素）直接转运至宿主细胞的细胞质中7,8。在感染肺部内皮细胞过程中，这些外毒素会靶向多种细胞内蛋白，包括微管相关蛋白tau的一种内皮异构体9,10,11,12，导致内皮屏障破坏，进而引发严重的肺水肿、肺功能下降，并常常导致死亡。

如前所述，度过初始肺炎阶段的患者在出院后的前12个月内死亡率仍显著升高。解释这一现象的可能机制是，在初始感染期间产生了某种长寿命的毒素，从而导致远期预后不良。两项观察结果支持这一可能性。首先，肺内皮细胞在最初经铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）处理后，即使细菌已被抗生素杀灭，细胞增殖仍会持续抑制长达一周之久13。其次，已有研究在多种人类和动物疾病中发现具有朊病毒特征的长寿命朊病毒或其他类朊病毒因子，尤其是与神经系统相关的疾病14,15。

从未有过关于检测肺部感染期间长寿命细胞毒性物质潜在生成方法的描述。本文介绍了一系列简单 体外 概述了可用于研究感染一种常见肺炎致病菌后细胞毒素产生与活性的检测方法， P. aeruginosa这些检测方法应可轻松适用于研究其他肺炎致病因子感染后可能引发的细胞毒素产生情况，所获得的上清液也可用于研究细胞毒素对完整器官或整体动物的影响。最后，本文所述的检测方法很可能还可适用于检测动物和人类生物体液在肺炎期间细胞毒素的产生情况。

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方案

所有动物实验程序均经南阿拉巴马大学机构动物护理委员会审查和批准，并严格按照所有联邦、州和地方的法规进行。大鼠肺微血管内皮细胞（PMVECs）的原代培养物由南阿拉巴马大学肺生物学中心细胞培养核心设施提供。细胞制备采用先前描述的方法16。

1. 细胞毒性上清液的制备

注意：此处我们使用两种不同的铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）菌株：PA103，其具有完整的第一型三型分泌系统，能够在感染期间将外毒素ExoU和ExoT转运至靶细胞；以及∆PcrV，该菌株缺乏三型分泌系统，接种后无法将外毒素转运至靶细胞。

  1. 将细菌划线接种至Vogel-Bonner（VB）琼脂平板上17，并在37 °C下培养过夜。
    1. 制备平板时，配制以下储存液（Vogel-Bonner盐溶液；10x 储存液）：称取2 g MgSO4、20 g柠檬酸（游离酸）、100 g K2PO4和35 g NaH2PO4，加入ddH2O定容至1 L，15分钟高压灭菌（慢速排气）。
    2. 将7.5 g琼脂加入450 mL ddH2O中，按上述条件进行高压灭菌。
    3. 灭菌后，将两种溶液均置于50 °C水浴中冷却。
    4. 向琼脂溶液中加入50 mL 10x VB盐储存液。
    5. 加入羧苄青霉素至终浓度为400 µg/mL（针对所用的P. aeruginosa菌株），轻轻旋转烧瓶充分混匀。
    6. 将5 mL VB琼脂溶液分装至各无菌培养皿中，待琼脂凝固后，于4 °C保存，直至细菌接种当天使用。
    7. 在细菌接种当天，将平板预热至37 °C，用无菌接种环将细菌划线接种至平板表面，随后将平板置于37 °C培养箱中过夜培养。
  2. 通过荧光标记的Griffonia simplicifolia凝集素阳性染色和荧光标记的Helix pomatia凝集素阴性染色（后者为动脉内皮细胞标志物）验证PMVEC纯度。分装细胞后于液氮中冷冻保存。
  3. 实验过程中，将细胞维持在添加10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中，并在含5% CO2的37 °C培养箱中培养。使用第5至15代的细胞。
    1. 为制备细胞毒性上清液，将2 × 106个细胞接种至各150 cm培养皿中，培养3–4天至细胞完全融合。每项实验使用两个培养皿（见下文）。
    2. 为分析细胞毒性上清液，将1 × 105个细胞接种至6孔板的各个孔中，培养4天至细胞完全融合。
  4. 为制备上清液，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤步骤1.3.1中两个150 cm培养皿中的一个PMVEC培养皿，进行胰酶消化后计数细胞（我们使用自动细胞计数仪并遵循制造商的操作说明；参见材料表）。用Hank’s平衡盐溶液（HBSS）洗涤另一个PMVEC培养皿，然后以感染复数（MOI）为20:1的条件接种任一株P. aeruginosa。具体操作如下：
    1. 对于P. aeruginosa，OD540为0.25时相当于2 × 108 CFU/mL。为配制该稀释度，向1 mL一次性比色皿中加入1 mL HBSS，从步骤1.1制备的平板上刮取适量细菌，直至使用分光光度计测得OD540为0.25。下一步将计算所需细菌量。
    2. 确定培养皿中PMVEC的数量后（见步骤1.4），计算应加入第二个未消化培养皿（含PMVEC）的细菌数量。例如，若测得该培养皿中含有1.3 × 107个细胞，则所需细菌体积为：1.3 × 107个细胞 × 20个细菌/细胞 × 1 mL / 2 × 108 CFU = 1.3 mL细菌悬液。
    3. 将1.3 mL细菌悬液用HBSS稀释至终体积20 mL，确保能够完全覆盖150 cm培养皿的表面，然后将稀释后的细菌悬液加入PMVEC培养皿中。
    4. 将接种细菌的PMVEC置于含5% CO2的37 °C培养箱中培养4–5小时，直至在显微镜下观察到细胞单层出现间隙（参见图1以确认适当的间隙形成程度）。
    5. 收集上清液，随后在台式离心机中以2,000 × g离心10分钟，以去除细胞碎片。
      注意：任何能够产生足够离心力以沉淀未裂解细胞及大细胞碎片的台式离心机均可用于此步骤。
    6. 将上清液倒入末端装有0.2 µm滤器的注射器中，通过滤器过滤以去除细菌。
    7. 取部分无菌上清液用于细胞毒性检测（见2.1），其余部分于-80 °C冻存以备后续使用。

2. 细胞毒性上清液的分析

  1. 细胞毒性检测
    1. 将PMVECs在6孔板中培养至汇合。用HBSS洗涤各孔一次，然后向各孔中加入1.5 mL过滤除菌的上清液（来自接种PA103或∆PcrV的细胞）。另设一孔加入无菌HBSS作为阴性对照。
    2. 将培养板放入 CO2 在培养箱中孵育21至24小时，然后观察细胞杀伤/细胞毒性效应（见下一步）。将表现出细胞毒性的上清液用于后续实验，无细胞杀伤作用的上清液予以弃除。
    3. 细胞杀伤定量
      1. 使用市售乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒及制造商推荐的操作步骤，检测死细胞释放的乳酸脱氢酶（LDH）。
      2. 或者，使用 ImageJ 软件通过显微镜定量细胞杀伤。具体操作为：拍摄培养皿中完整细胞区域的显微图像，然后利用自定义的 ImageJ（美国国立卫生研究院）宏程序量化无细胞区域（提示单层细胞死亡的区域）（参见 补充编码文件）。如有需要，可按以下步骤手动执行宏观操作：
        1. 将输入图像（RGB 或 Tiff 格式）导入宏中，并调整对比度至 15% 饱和像素。复制经对比度调整的图像，执行“减去背景”命令，以获得视野内细胞和间隙区域的高对比度图像。
        2. 将此图像从原始图像中减去，并使用图像计算器的“AND”功能将所得图像与原始图像合并。利用阈值函数（最小值0，最大值5）将结果图像转换为黑色（空隙）和白色（细胞）的掩膜图像，然后使用“二值腐蚀”（binary erode）功能去除图像中的噪声。
        3. 使用“面积分数”测量法测定结果图像中黑色像素与白色像素的比率。将各处理时间点的分数面积绘图并表示为最大间隙面积的百分比。
        4. 计算均值，并使用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合 Tukey 事后检验进行比较， p 以小于0.05的值为具有显著性。
    4. 使用免疫印迹分析检测培养上清液中淀粉样蛋白、寡聚化 Tau 蛋白和 Aβ 的存在。采用标准操作程序进行免疫印迹分析10,11,12，但电泳前需将培养上清液至少浓缩10倍。
      1. 为浓缩上清液，取1 - 2 mL上清液加入截留分子量为10 kDa的离心过滤装置中。然后将过滤装置放入台式离心机，于2,000 x g离心，直至达到所需浓缩程度（通常为45 - 60分钟）。
      2. 测定浓缩上清液中的蛋白含量11 将等量样品加入凝胶的各个加样孔中。
      3. 运行凝胶，将蛋白质转移至硝酸纤维素膜，然后分别使用 A11 抗淀粉样蛋白抗体、T22 抗寡聚体 tau 抗体或 MOAB2 抗 Aβ 抗体孵育膜，随后加入相应的二抗。采用标准化学发光方法显影印迹。
    5. 使用硫黄素T荧光法（thioflavin T fluorescence, ThT）检测上清液中的淀粉样蛋白。进行该检测时，应使用滤膜除菌的上清液。
      1. 配制硫黄素T（ThT）储备液（50倍浓度）：将8 mg硫黄素T（ThT）溶于10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中。充分混匀后，经0.22 µm滤膜过滤，以去除颗粒物。
      2. 测量时，将 20 µL ThT 储存液加入 1 mL PBS 中，置于 1 mL 紫外分光光度计比色皿内。将稀释后的样品放入荧光分光光度计中。
      3. 使用425 nm激发光，以2 nm为步长扫描450–575 nm范围内的荧光发射，测定基线荧光发射。
      4. 使用425 nm激发光和482 nm发射光进行时间序列扫描，每0.2秒采集一次数据，持续60秒。
      5. 延时扫描的前20秒用于测量空白比色皿中的荧光值。在20秒时暂停扫描，向比色皿中加入10 µL过滤除菌的上清液。通过倒置混匀比色皿，然后将其放回荧光分光光度计中。
      6. 恢复基于时间的扫描，采集最后40秒的数据。
      7. 完成延时扫描后，使用与2.1.5.3节中所述相同的设置，进行最终的荧光发射光谱扫描。

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结果

一种简单的方法 体外 已开发出一种检测方法，用于检测受细菌感染的细胞上清液中细胞毒素的存在 P. aeruginosa将感染细胞的培养基在加入细菌4小时后收集，通过滤膜除菌法去除培养上清液中的细菌，然后将无菌上清液加入新的细胞群体中。在加入上清液后21至24小时观察细胞，量化细胞杀伤效应。

将P. aeruginosa加入融合的PMVECs单层细胞后，可诱导细胞间出现间隙。体内实验中，细胞间隙的形成会导致肺水肿和肺功能下降。在本实验方法中，细胞间隙的形成为筛选细胞培养上清液中细胞毒素释放的时间点，而PA103菌株孵育时间是否充分，可通过细胞单层中开始出现间隙来判断，如图1所示。在相同孵育条件下，ΔPcrV细菌不会诱导细胞间隙的形成。一旦观察到细胞间隙，即收集上清液，经滤膜除菌后加入未经处理的PMVECs，以评估其细胞毒性活...

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讨论

此处，简单的 体外 本文概述了可用于证明在引起肺炎的病原体感染过程中产生细胞毒性淀粉样蛋白的方法。这些方法包括细胞培养细胞毒性检测、免疫印迹、利用一种新型显微技术对细胞杀伤进行定量分析，以及硫磺素T（ThT）结合实验。对细胞毒性物质的分析表明，其具有淀粉样蛋白的特性。图2 和 图4）并表现出朊病毒的特征12肺炎期间产生细胞毒性朊病毒分子可能解释了肺炎幸存者在出院后死亡率升高的现象。目前正在开展实验以验证这一可能性。

所有上述研究的关键事件均为细胞毒性上清液的生成，需要考虑两个重要变量。首先，在所述实验中，大鼠肺微血管内皮细胞（PMVECs）被同时用于感染步骤和细胞毒性检测。目前尚未深入研究其他细胞类型是否可用于细胞毒素的生产，但有可能其他细胞在经不同菌株的铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）处理后也能产生细胞毒性上清液。如前所示，这些细胞毒素...

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披露

无任何事项需要报告。

致谢

本研究部分由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号如下：TS、RB 和 SL 获得 HL66299，TS 获得 HL60024，MF 获得 HL136869。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
兔抗β-淀粉样蛋白抗体Thermo71-5800
A11淀粉样蛋白寡聚体抗体StressMarqSPC-506D
T22抗tau蛋白寡聚体抗体EMD MilliporeABN454
硫黄素TSigma AldrichT3516
HBSSGibco14025-092
PBSGibco10010-023
0.22微米注射器滤器MilliporeSLGP033RS
DMEMGibco11965-092
HRP标记的山羊抗兔IgGAbcamab6721-1
菌株PA103和ΔPcrV这些铜绿假单胞菌菌株由美国威斯康星医学院密尔沃基分校的Dara Frank博士提供
异硫氰酸荧光素标记的刀豆蛋白Griffonia lectinSigma AldrichL9381
四甲基罗丹明标记的蜗牛凝集素Helix pomatia lectinSigma AldrichL1261
琼脂FisherBP1423-500
0.22微米硝酸纤维素膜BioRad162-0112
II型胶原酶WorthingtonLS004176
胎牛血清HycloneSH30898.03IH
青霉素-链霉素溶液（PenStrep）Gibco15070063
羧苄青霉素二钠盐Sigma C1389
微量离心浓缩管-10,000分子量截留MilliporeUFC801008
磷酸氢二钾Sigma 795496-500G
七水合磷酸氢镁MP BiomedicalsMP021914221
柠檬酸G Biosciences50-103-5801
七水合磷酸氢二钠SigmaS9506-500G
Countess全自动细胞计数仪InvitrogenC10277

参考文献

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