荧光分子断层成像技术 在体 内 胶质母细胞瘤异种移植瘤的成像

摘要

肿瘤细胞的原位颅内注射已广泛应用于癌症研究，以探讨脑肿瘤的生物学特性、进展过程、演化规律及治疗反应。本文介绍了肿瘤异种移植模型的荧光分子断层成像技术，该技术可实现临床前胶质母细胞瘤模型中肿瘤组织的实时活体成像与定量分析。

摘要

致瘤性是指癌细胞形成肿瘤团块的能力。确定细胞是否具有致瘤性的一种常用方法是将癌细胞皮下注射到免疫缺陷小鼠体内，待肿瘤生长至肉眼可见且可触及后测量其体积。原位注射癌细胞旨在将异种移植瘤植入与所研究肿瘤起源组织最相似的微环境中。脑癌研究需要将癌细胞颅内注射，以允许肿瘤在脑部独特的微环境中形成并进行分析。体内成像技术可实时监测颅内异种移植瘤的肿瘤体积。本文报道了荧光分子断层成像（FMT）在脑肿瘤异种移植模型中的应用。首先用近红外荧光蛋白转导癌细胞，然后将其注射到免疫缺陷小鼠的脑内。随后对动物进行扫描，以在较长时间内获得关于肿瘤体积的定量信息。细胞预标记使得每只小鼠体内肿瘤负荷的量化具有成本效益、可重复性和可靠性。我们无需注射成像底物，从而减少了对动物的应激。该方法的局限性在于无法检测非常微小的肿瘤团块；但对于较大的肿瘤，其分辨率优于其他技术。该方法可用于评估药物治疗效果，或胶质瘤细胞系及患者来源样本的遗传修饰效应。

引言

癌症是工业化国家中人类因疾病致死的主要原因之一。由于死亡率极高，迫切需要开发新的治疗方法。多形性胶质母细胞瘤（GBM）是一种极为致命的脑癌，由异质性的脑肿瘤细胞、基质细胞和免疫细胞组成。根据美国脑肿瘤登记中心的数据，原发性恶性与非恶性脑肿瘤的发病率约为每10万人中22例。预计2017年美国将有约11,000例新发病例¹。

临床前研究旨在评估药物、操作或治疗方法在人体试验前的有效性可能性。临床前研究中最早的实验室步骤之一是利用植入宿主生物体的癌细胞（定义为人源异种移植模型）来鉴定药物治疗的潜在分子靶点。在此背景下，采用患者来源异种移植（PDX）的颅内脑肿瘤异种移植模型已被广泛用于研究脑肿瘤的生物学特性、进展、演化及治疗反应，近年来还被用于生物标志物开发、药物筛选和个体化医疗^2,3,4。

监测颅内异种移植瘤最经济且非侵入性的体内成像方法之一是生物发光成像（BLI）^5,6,7,

方案

使用实验动物和感染性试剂（如用于转导癌细胞的慢病毒）需事先获得机构动物照护项目和机构生物安全委员会的批准。本方案遵循加州大学圣地亚哥分校（UCSD）的动物照护指南。

1. 使用 FP635 或 FP720 载体标记胶质母细胞瘤细胞

1. 根据 Tiscornia et al.¹² 描述的方案制备并纯化慢病毒
2. 在 15 cm 培养皿中，用含 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培养约 2.0 × 10⁶ 个来自人胶质瘤细胞系的细胞；或在 T75 培养瓶中，用 DMEM/F12 1:1 培养基（添加 B27 补充剂以及人重组表皮生长因子（EGF；20 ng/mL）和 FGF（10 ng/mL））培养 2.0 × 10⁶ 个人源胶质母细胞瘤（GBM-PDX）类球体。
3. 将所有细胞维持在 37 °C、5% CO₂ 和 100% 相对湿度条件下。
4. 消化细胞。
   1. 对于胶质瘤细胞：吸除培养皿中的上清液，并向细胞中加入 3–5 mL 1× 胰蛋白酶。
   2. 对于 GBM 类球体：用移液器将细胞转移至 15 mL 离心管中。
      1. 在室温下使用台式离心机以 200 × g 离心 5 分钟，使 GBM 类球体沉淀。
      ....

结果

胶质母细胞瘤细胞U87EGFRvIII（过表达表皮生长因子受体变异体III的U87细胞）按照步骤1.2进行培养。慢病毒根据步骤1.1进行制备和纯化。病毒浓度通过p24 ELISA分析确定。根据步骤1.8，使用携带红外荧光蛋白的慢病毒感染细胞。编码FP720^10,11的质粒由V.V. Verkhusha博士惠赠，FP635载体购自商业供应商。靶细胞通过FACS分选，富集荧光最强的前10%细胞群体（图1A）。增强荧光信号可提高荧光断层成像系统的灵敏度。为了在原位移植前验证荧光标记细胞的信号强度，我们使用了FMT成像仪的模拟样品盒。具体而言，将U87EGFRvIII-TurboFP635和U87EGFRvIII-iRFP720细胞用胰蛋白酶消化后，分别将1×10⁵、1×10⁶和1×10⁷个细胞重悬于100 µL冰上预冷的PBS中，并进行分.......

讨论

肿瘤异种移植模型在癌症研究中已被广泛使用，且已发展出多种成熟的成像技术：生物发光成像（BLI）；磁共振成像（MRI）；正电子发射断层扫描（PET）；计算机断层扫描（CT）；荧光分子断层成像（FMT）。这些方法各有优缺点，但在所提供的信息类型上最终可相互补充。其中最常用的方法之一是 在体 成像技术为生物发光成像（BLI）^5,6,7,8生物发光成像（BLI）和荧光分子断层成像（FMT）均需要对细胞进行基因工程改造（表达荧光素酶或近红外荧光蛋白），这可能影响基因表达。BLI对微小肿瘤组织更为敏感，但需要腹腔注射底物（腔肠素），该底物在体内达到最大分布需10–12分钟；然而，在图像采集过程中常出现光淬灭和光散射现象，且底物会被快速清除⁹FMT则不需要向动物额外施加底物，其信号稳定，且不受时间或酶稳定性的影响。此外，在相同实验条.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM/高糖培养基	HyClone/GE	SH30022.1
DMEM/F12 1:1 培养基	Gibco	11320-082
胎牛血清（FBS）	HyClone/GE	SH30071.03
Accutase	创新型细胞技术公司	AT-104
胰蛋白酶（Trypsin）	HyClone/GE	SH30236.01
B27 添加剂	Gibco	17504044
人重组 EGF	Stemcell Technologies	2633
人重组 FGF	Stemcell Technologies	2634
DPBS 缓冲液	Corning	21-031-00
FACS 管	Falcon	352235
DAPI	赛默飞世尔科技公司	62248
杀稻瘟菌素（Blasticidin）	赛默飞世尔科技公司	A1113903
p24 ELISA	Clontech	632200
赛拉嗪（Xylazine）	Akorn	NDC 59399-110-20
氯胺酮（Ketamine）	Zoetis	NADA 043-403	管制药品
眼膏	Dechron	NDC 17033-211-38
可吸收缝合线	CpMedical	VQ392
5 µL 注射器	Hamilton	26200-U	由 Sigma-Aldrich 销售的目录号
细胞分选仪	Sony	SH8007
小鼠立体定位仪	Stoelting	51730
电动立体定位注射器	Stoelting	53311
手持式微型电机钻	Foredom	K1070
小鼠保温垫	Ken Scientific Corporation	TP-22G
荧光断层成像系统	PerkinElmer	FMT 2500 XL
TrueQuant 成像软件	Perkin Elmer	7005319
超速离心机 Optima L-80 XP	Beckman Coulter	392049
组织培养皿 100 mm	Olympus Plastics	25-202
组织培养皿 150 mm	Olympus Plastics	25-203
组织培养瓶 T75	Corning	430720U
50 mL 锥形离心管	Corning	430290
15 mL 锥形离心管	Olympus Plastics	28-101
Avanti J-20 离心机	Beckman Coulter	J320XP-IM-5
聚丙烯薄壁离心管，5.0 mL	Beckman Coulter	326819
聚丙烯薄壁离心管，38.5 mL，25 × 89 mm	Beckman Coulter	326823
裸鼠（无胸腺裸鼠）	Charles River Laboratories	品系编号  490（纯合子）	需经机构动物护理项目及机构生物安全委员会事先批准。