我们描述了对离体活体人阻力动脉血管壁进行同步力学测试和三维成像的方法，并采用Fiji和Ilastik进行图像分析，以量化弹性蛋白和胶原蛋白的空间排列及体积密度。我们讨论了将这些数据应用于血管壁力学数学模型中的方法。
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摘要
摘要
阻力动脉重构在原发性高血压、糖尿病及代谢综合征中的致病作用已有文献记载。开展针对微观结构的数学模型研究并发展此类模型，有助于理解健康与疾病状态下人类阻力动脉的力学特性，进而阐明疾病及医学治疗对人类微循环的影响机制。为了建立这些数学模型，关键在于解析微血管壁的力学特性与微观架构特性之间的关系。本文描述了一种 离体 一种用于被动力学测试及同步无标记三维成像的方法，可对离体人阻力动脉血管壁中弹性蛋白和胶原蛋白的微结构进行成像。该成像方案可应用于任何目标物种的阻力动脉。文中描述了图像分析方法，用于定量分析：i）利用Fiji软件测定压力诱导的内弹性膜分支角度变化及外膜胶原纤维的直线度；ii）利用Ilastik软件测定胶原和弹性蛋白的体积密度。建议尽可能在活体灌注动脉上同时进行力学测量与成像，但也讨论了一种替代方案，即采用标准视频显微压力肌动图结合血管再加压后固定样本的成像方法。该替代方法为用户提供了不同的分析选择。文中还探讨了将力学与成像数据整合至动脉壁力学数学模型中的应用，并提出了本方案未来的发展与改进方向。
引言
阻力动脉重构在原发性高血压、糖尿病和代谢综合征中的致病作用和影响已有文献记载1,2,3,4,5。阐明微血管壁力学特性与微细结构特性之间的关系，对于建立描述这种关联的数学模型至关重要。此类模型将有助于深入理解血管重构过程，并推动开发可用于评估靶向动脉壁疾病相关重构的药理学策略的计算机模拟模型。
既往研究主要关注通过结合力学测量与细胞外基质（ECM）的微结构信息，来理解动脉壁微结构与其力学特性之间的关系，但这些研究几乎 exclusively 针对小鼠或猪的大口径弹性传导动脉6,7,8,9,10,11。动脉壁微结构的成像通常采用非线性光学技术，利用弹性蛋白的自发荧光以....
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方案
采集本研究中使用的人体壁层心包活检样本均在获得书面知情同意后进行，方法如前所述33本研究中的人体组织研究遵循《赫尔辛基宣言》中规定的原则。34 并已获得南丹麦地区健康研究伦理委员会（S-20100044 和 S-20140202）以及丹麦数据保护局的批准。
1. 收集组织并分离（人类）阻力动脉
- 在手术切除后立即收集感兴趣的组织样本。采集后立即将组织转移至 4 °C 的 HEPES 缓冲生理盐溶液（HBS）中，并在 HBS 中保存。
注意：人源组织仅可在获得相关机构和伦理委员会批准以及患者签署书面知情同意书后方可收集。HBS 成分（单位：mM）：NaCl 144，KCl 4.7，CaCl2 2.5，MgSO4 1.2，KH2PO4 1.2，HEPES 14.9，葡萄糖 5.5。用 NaOH 调节 pH 至 7.4，并通过 0.2 µm 滤膜过滤溶液。 - 将收集的组织在 4 °C 的无菌 HBS 中静置过夜，以清除麻醉剂。
注意：各研究实验室应自行评估过夜储存对血管完整性和功能可能产生的影响。 - 使用尖头镊子和显微解剖剪仔细分离出阻力型动脉（管腔直径约 ± 200 µm）。
- 在准备成像/加压腔....
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结果
本研究中用于成像的定制压力肌动描记仪如图1所示。在肌动描记仪的设计中特别关注了以下两点：i) 腔室体积较小（2 mL）；ii) 可将套管放置在靠近玻璃底部且与之平行的位置（图1B）。腔室底部可容纳一块50 × 24 mm #1.5玻璃盖玻片（可更换）。压力控制器由一个标准的1 L玻璃瓶和一个血压计（已移除袖带）构成。对于需要流动条件的肌动描记仪装置，建议使用伺服压力控制器。
图2 展示了在本实验方案中获取单张图像和图像序列的推荐位置。为便于说明，图中包含了一个安装好的动脉的透射光显微图像。 图2A. 固定后动脉的结扎点间长度约为1.6 mm。对动脉进行扫描，直至观察到最大直径处（
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讨论
本研究提出了一种标准化的成像与压力肌动图联合分析方法，可用于在0至100 mmHg的压力范围内，同步评估阻力动脉的力学特性以及动脉壁结构随压力变化的情况。该方法最初采用自行搭建的设备开发完成，但任何可安装于双光子激发荧光显微镜上的压力肌动图系统均可适用，前提是两种设备的设计均允许对动脉壁进行成像。应特别注意物镜的形状、宽度和工作距离，以及成像操作的具体条件。直立显微镜需使用水浸式物镜，而倒置显微镜则推荐使用水浸没式物镜，以避免样品与物镜之间折射率差异所导致的成像问题。此外，应注意盖玻片的厚度，可通过使用带校正环的物镜对物镜与盖玻片之间的厚度失配进行校正（若具备该功能），或通过匹配所用物镜推荐的盖玻片厚度来实现。
在所述方案中，利用低能量近红外光成像弹性蛋白的自发荧光和胶原的二次谐波信号，从而实现长时间成像。在本研究使用的人类阻力动脉中，内弹力板由相互连接、呈纵向排列的纤维状弹性蛋白网络构成13,33，类似于人皮下阻力动脉（hSCA）的IEL结构
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢南丹麦大学自然科学学院丹麦分子生物医学成像中心提供实验室和显微镜的使用。感谢Kristoffer Rosenstand和Ulla Melchior在压力肌动图和成像方面提供的出色技术协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 精细科学工具 | 15401-12 | ||
| 精细科学工具 | 11251-23 | ||
| 尼康 | SMZ800N | ||
| 西格玛-奥德里奇，Brøndby，丹麦 | 761028 | 用于解剖 | |
| Vitrex Medical A/S，赫勒沃，丹麦 | 1.63, 2.13, 210mm | ||
| 史密斯医疗国际公司，英国 | |||
| 爱惜康 | Ethilon 11-0 | ||
| 定制设备 | 丹麦专利号 201200167，南丹麦大学，J. Schoubo V. Jensen，F. Jensen，T.R. Uhrenholt | ||
| 梅特勒-托利多 | |||
| 西格玛-奥德里奇，Brøndby，丹麦 | B3259 | ||
| 西格玛-奥德里奇，Brøndby，丹麦 | A7030 | ||
| 西格玛-奥德里奇，Brøndby，丹麦 | C5670 | ||
| 西格玛-奥德里奇，Brøndby，丹麦 | G7021 | ||
| 西格玛-奥德里奇，Brøndby，丹麦 | E3889 | ||
| 默克密理博，海勒鲁普，丹麦 | 1.00496.9010 | 磷酸盐缓冲（pH 6.9）4% 甲醛溶液 | |
| 西格玛-奥德里奇，Brøndby，丹麦 | H3784 | ||
| 西格玛-奥德里奇，Brøndby，丹麦 | P9666 | ||
| 西格玛-奥德里奇，Brøndby，丹麦 | P5655 | ||
| 西格玛-奥德里奇，Brøndby，丹麦 | M2643 | ||
| 西格玛-奥德里奇，Brøndby，丹麦 | S2002 | ||
| 西格玛-奥德里奇，Brøndby，丹麦 | S5886 | ||
| 西格玛-奥德里奇，Brøndby，丹麦 | S5761 | ||
| 西格玛-奥德里奇，Brøndby，丹麦 | 1.06462 | ||
| 吉布科，赛默飞世尔科技 | 10010015 | ||
| 西格玛-奥德里奇，Brøndby，丹麦 | PHR1423 | ||
| 西格玛-奥德里奇，Brøndby，丹麦 | Z370525 | ||
| 托克里斯生物科学，布里斯托尔，英国 | 538944 | ||
| 尼康 | 定制设备 | ||
| 光谱物理，加利福尼亚州芒廷维尤 | |||
| 尼康 | CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27 | ||
| 尼康 | CFI Plan Fluor 20XMI（多介质浸没）NA 0.75 | ||
| 滨松，巴勒鲁普，丹麦 | H7422P-40 | ||
| AHF 分析技术股份公司（Tübingen，德国） | ChromaET 460 nm 长通二向色镜 | ||
| AHF 分析技术股份公司（Tübingen，德国） | Semrock FF01-520/35-25 BrightLine 滤光片 | ||
| AHF 分析技术股份公司（Tübingen，德国） | Chroma ET402/15X | ||
| Scotch™ | |||
| 盖玻片厚度应与显微镜所用物镜匹配（#1 或 #1.5），或调节校正环以匹配盖玻片 |
参考文献
- Briones, A. M., Arribas, S. M., Salaices, M. Role of extracellular matrix in vascular remodeling of hypertension. Curr Opin Nephrol Hy. 19 (2), 187-194 (2010).
- Heagerty, A. M., Heerkens, E. H., Izzard, A. S. Small artery structure and function in hypertension. J Cell Mol Med.....
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重印与许可
