方法文章

用无标签荧光显微镜评价活体、人体阻力动脉中胶原蛋白和弹性蛋白的压力依赖性 Microarchitectures

DOI：

10.3791/57451

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2018年4月9日

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1Department of Cardiovascular and Renal Research, Institute of Molecular Medicine, University of Southern Denmark, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Southern Denmark, 3Department of Cardiac, Thoracic and Vascular Surgery, Odense University Hospital

本文内容

摘要

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我们描述同时进行的机械测试和 3 d 成像的动脉壁的孤立, 活着的人的抵抗动脉, 斐济和 Ilastik 图像分析, 以量化的弹性蛋白和胶原的空间组织和体积密度。我们讨论了这些数据在动脉壁力学数学模型中的应用。

摘要

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在原发性高血压、糖尿病和代谢综合征中, 抗血管重塑的致病作用有记录。microstructurally 动机的研究与发展了解人体阻力动脉力学性能的数学模型在健康和疾病方面有可能帮助理解疾病和医疗治疗影响人体微循环。为了开发这些数学模型, 必须对微血管壁的力学和 microarchitectural 特性之间的关系进行解密。在这项工作中, 我们描述了一个前体方法进行被动的机械测试和同时无标签的三维成像的弹性体和胶原质的微结构的动脉壁上的孤立的人的阻力动脉。成像协议可应用于任何感兴趣物种的抗性动脉。图像分析描述量化 i) 压力诱发变化的内部弹性板分枝角和血管外膜胶原直线度使用斐济和 ii) 胶原蛋白和弹力蛋白体积密度确定使用 Ilastik 软件。最好所有的机械和影像测量都是在活的, 灌注的动脉, 但是, 一个替代方法使用标准的视频显微镜压力 myography 结合后固定成像的再加压血管是讨论。此替代方法为用户提供了不同的分析方法选项。讨论了机械和成像数据在动脉壁力学数学模型中的包含, 并提出了该协议的未来发展和补充。

引言

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原发性高血压、糖尿病和代谢综合征的致病作用和抗性动脉重塑的作用记录在1,2,3,4,5。破译微血管壁的力学和 microarchitectural 特性之间的关系对于发展该协会的数学模型是必不可少的。这些模型将改善理解的重塑过程, 并将支持在硅模型的发展, 有助于测试的药理策略针对与疾病相关的重建的动脉壁。

先前的研究集中于了解动脉壁微结构与动脉壁力学的关系, 包括机械措施和细胞外基质 (ECM) 的微体系结构, 几乎完全是在大, 从小鼠或猪的弹性导管动脉6,7,8,9,10,11。通常采用非线性光学技术, 利用弹性蛋白的荧光性和胶原蛋白的二次谐波产生, 对墙体的....

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方案

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本工作中使用的人顶叶心包活检的收集是在书面知情同意后进行的, 如前所述的33。对人体组织的研究符合《赫尔辛基宣言》34中概述的原则, 并得到了丹麦南部 (S-20100044 和 S-20140202) 和丹麦数据保护局的卫生研究伦理学区域委员会的批准。

1. 收集组织和隔离 (人) 抵抗动脉

  1. 在手术过程中立即收集感兴趣的组织样本。将组织转移到4°c HEPES 缓冲的生理盐溶液 (哈佛商学院) 立即收集和存储在哈佛商学院。
    注: 只有在相关的机构和伦理委员会批准以及患者书面知情同意的情况下, 才会收集人体组织。哈佛商学院的组成在 mM: NaCl 144, 氯化钾 4.7, CaCl2 2.5, MgSO4 1.2,, HEPES 2 PO 4 1.2,, 葡萄糖 14.9.用氢氧化钠调整 pH 值 7.4, 通过0.2 µm 过滤器过滤溶液。
  2. 将所收集的组织在不育的哈佛商学院过夜4摄氏度, 以清洗麻醉剂。
    注: 夜间贮存对船只完整性和功能的任何影响, 应由个别研究实验室检查。
  3. 用一对尖尖钳和微解剖剪刀仔细隔离阻力大小的动脉 (200 µm 流明直径)。
  4. 将动脉储存在冰冷的哈佛商学院4摄氏度, 同时启动....

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结果

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此工作中使用的用于成像的自定义压力 myograph 显示在图 1中。特别注意为 myograph 的设计被支付了对 i) 房间以小容量 (2 毫升) 和 ii) 可能性安置套管接近, 并且平行与玻璃底部 (图 1B)。房间的底部适合 50 x 24 毫米 #1. 5 玻璃盖玻片 (可更换)。该压力控制器是由标准的1升玻璃瓶和血压计 (袖口删除)。对于具有流量要求的 myograph 设置, 建议使用伺服压力控制器。

图 2说明了在协议中概述的实验中获取单个图像和图像堆栈的推荐位置。为说明起见, 已安装的动脉的透射光显微图像包括在图 2A中。固定动脉的结对结长度约为1.6 毫米。扫描动脉直到观测到最宽的直径 (

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讨论

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这项工作代表我们建议的标准化, 联合成像和压力 myography 方法, 有价值的同时评估的力学性质的阻力动脉和压力相关变化的动脉结构墙壁在压力范围从0到 100 mmHg。提出的方法是使用定制的设备开发的, 但是, 当两种设备的设计允许动脉壁的成像时, 任何适合于双光子激发荧光显微镜的压力 myograph 都可以使用。应特别注意目标的形状、宽度和工作距离, 以及成像将执行的条件。直立显微镜要求使用水浸的目标, 而使用水浸泡目标被推荐用于倒置显微镜, 以避免样品和目标之间的折射率的差异。此外, 应注意的盖玻片厚度, 无论是通过对目标和盖玻片的不匹配的纠正, 使用矫正衣领的目标 (如果存在) 或匹配的盖玻片厚度与目标使用。

在描述的协议中, 利用低能量、近红外光来成像弹性蛋白自发荧光和胶原 SHG。这允许成像的时间延长。在这项研究中使用的人体阻力动脉中, IEL 由一根纵向排列的纤维状网络组成, 相互关联的弹性体纤维13,33, 类似于人体皮下阻力的 IEL 结构.......

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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作者感谢丹麦南部大学自然科学系的丹麦分子生物医学成像中心, 用于实验室和显微镜的使用。kris 专职 Rosenstand 和乌拉梅尔基奥是公认的优秀技术援助与压力 myography 和成像。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
精细科学工具15401-12
精细科学工具11251-23
尼康SMZ800N
 Sigma-Aldrich， Brøndby， 丹麦。用于解剖目的
761028 Vitrex Medical A/S， Herlev， Denmark1.63， 2.13， 210mm
Smiths medical Intl， UK
Ethicon Ethilon11-0
定制DK 专利号 201200167， 南丹麦大学， J. Schoubo V. Jensen， F. Jensen. T.R. Uhrenholt
Mettler toledo
 Sigma-Aldrich， Brøndby， 丹麦。B3259
 Sigma-Aldrich， Brøndby， 丹麦。编号 A7030
 Sigma-Aldrich， Brøndby， 丹麦。C5670
 Sigma-Aldrich， Brøndby， 丹麦。G7021
 Sigma-Aldrich， Brøndby， 丹麦。E3889
Merck Millipore， Hellerup， Denmark1.00496.9010磷酸盐缓冲 （pH 6.9） 4% 甲醛溶液 
 Sigma-Aldrich， Brøndby， 丹麦。H3784
 Sigma-Aldrich， Brøndby， 丹麦。P9666
 Sigma-Aldrich， Brøndby， 丹麦。P5655
 Sigma-Aldrich， Brøndby， 丹麦。M2643
 Sigma-Aldrich， Brøndby， 丹麦。S2002
系列 Sigma-Aldrich， Brøndby， 丹麦。S5886
 Sigma-Aldrich， Brøndby， 丹麦。S5761
 Sigma-Aldrich， Brøndby， 丹麦。1.06462
Gibco，ThermoFisher Scientific10010015
 Sigma-Aldrich， Brøndby， 丹麦。PHR1423
 Sigma-Aldrich， Brøndby， 丹麦。Z370525
 Tocris Bioscience，布里斯托尔，英国538944
尼康定制光谱
物理学，加利福尼亚州山景
尼康CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27
尼康CFI Plan Fluor 20XMI（多重浸入式） NA 0.75
Hamamatsu， Ballerup， DenmarkH7422P-40
AHF analysentechnik AG （TüBingen， Germany）。ChromaET 460 nm 长通二向色性
AHF 分析技术 AG （TüBingen， Germany）。Semrock FF01-520/35-25 BrightLine 过滤器
AHF analysentechnik AG （TüBingen， Germany）。Chroma 色度 ET402/15X 
Scotch TM
盖玻片厚度应与显微镜上使用的物镜（#1 或 #1.5）相匹配，或者设置调节环以匹配盖玻片
的城

参考文献

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  1. Briones, A. M., Arribas, S. M., Salaices, M. Role of extracellular matrix in vascular remodeling of hypertension. Curr Opin Nephrol Hy. 19 (2), 187-194 (2010).
  2. Heagerty, A. M., Heerkens, E. H., Izzard, A. S. Small artery structure and function in hypertension. J Cell Mol Med.....

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