图像引导下胶质母细胞瘤切除及治疗性干细胞接种支架的颅内植入

摘要

具有肿瘤趋向性的治疗用间充质干细胞（MSCs）在治疗侵袭性胶质母细胞瘤方面展现出良好前景。最佳移植策略涉及将MSCs接种于支架材料后递送至肿瘤切除腔内。本文提供了用于研究MSC治疗胶质母细胞瘤的临床前技术，包括：影像引导下的肿瘤切除；接种MSC的支架植入；以及术后治疗监测。

摘要

胶质母细胞瘤（GBM）是最常见且最具侵袭性的原发性脑癌，患者预期寿命仅为12至15个月。这一短暂的生存期部分归因于现有治疗手段的局限性——即手术切除后辅以放疗和化疗——难以清除具有侵袭性的肿瘤病灶。利用具有杀瘤活性的人源间充质干细胞（MSCs）可能改善对这些病灶的治疗。MSCs具有强大的向肿瘤迁移能力，并可被基因工程改造以表达可杀伤肿瘤细胞的治疗性蛋白。临床前模型的进展表明，手术切除会引发MSC的过早丢失，从而降低治疗效果。通过将MSC接种于可生物降解的聚乳酸（PLA）支架上，可提高MSC治疗的疗效。将携带MSC的PLA支架植入手术切除腔内，可恢复细胞的滞留能力、持续存在性及杀瘤作用。为研究接种MSC的PLA支架植入对GBM的影响，需要建立精确的临床前模型。本文提供了一种临床前手术方案，用于在免疫缺陷小鼠中进行影像引导下的GBM肿瘤切除，随后植入携带MSC的支架。MSC通过慢病毒载体进行基因改造，以持续表达并分泌具有治疗作用的肿瘤坏死因子α相关凋亡诱导配体（TRAIL），同时表达绿色荧光蛋白（GFP），以便进行荧光追踪。同样，U87肿瘤细胞也被改造为表达mCherry和萤火虫荧光素酶，实现双模态荧光/生物发光追踪。尽管该方案目前用于研究干细胞介导的药物递送，但也可经修改后用于探究手术切除对其他GBM干预措施的影响。

引言

胶质母细胞瘤（GBM）是成人中最常见的原发性脑癌，其中位生存期仅有12-15个月，预后极差^1,2,3,4,5。自2005年确立目前的临床标准治疗方案以来，患者生存率未见显著改善，该方案为最大限度地手术切除肿瘤，随后进行放疗，并联合使用替莫唑胺化疗及辅助化疗^6,7。尽管该治疗方案可暂时缓解患者症状，但标准治疗后几乎不可避免地出现肿瘤复发，其原因是侵袭性癌灶常超出手术切除范围，且血脑屏障（BBB）限制了全身性治疗药物的渗透。因此，迫切需要开发能够靶向侵袭性肿瘤病灶并克服血脑屏障限制的新策略，以有效应对这种侵袭性强且致残率高的疾病。

人源间充质干细胞（MSCs）因其固有的肿瘤趋向性，有望成为胶质母细胞瘤（GBM）的药物递送载体^8,9。MSCs 表达多种受体，可趋向肿瘤分泌的可溶性因子迁移，这些因子包括基质细胞衍生因子1α（SDF-1α）、基质金属蛋白酶-1（MMP-1）和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）等^10,11,12,13。通过基因工程改造 MSCs 使其表达并分泌细胞毒性药物，可将其用作靶向肿瘤的药物递送载体。经改造的 MSCs 能够迁移至侵袭性肿瘤病灶，并递送治疗性蛋白。该策略已在多种GBM临床前模型中证明具有可行性^9,14。然而，尽管手术切除在临床上具有重要意义，但绝大多数现有模型并未纳入该环节。近期采用新型切除模型的研究发现，手术切除肿瘤会降低直接注射至手术腔内干细胞的存留时间¹⁵。细胞活力的丧失导致治疗效果下降，可能原因是递送至侵袭性肿瘤病灶的药物剂量和作用时间减少。

为了提高干细胞的存活率和药物递送效率，可在植入前将间充质干细胞（MSCs）接种于支架材料上。在本方案中，采用生物相容性好且可生物降解的静电纺聚乳酸（PLA）纳米纤维作为MSCs的支架。PLA支架在植入后能够弯曲并贴合切除腔的形状，从而最大化治疗覆盖范围，并缩短MSCs到达肿瘤细胞所需迁移的距离。MSCs在植入过程中保留在支架上，植入后则从支架上迁移并向肿瘤细胞移动^16,17。携带细胞毒性药物的MSCs随后在肿瘤病灶处聚集。将细胞毒性药物递送至肿瘤部位依赖于MSCs的存活及其持续存在，而支架的使用有助于提升这两项特性。

在此实验中，使用慢病毒载体诱导荧光蛋白的稳定表达（体外 追踪）和生物发光（体内 在癌症和干细胞系中使用示踪标记物。人胶质母细胞瘤细胞系 U87 被感染表达 mCherry 和萤火虫荧光素酶（U87 mCh-Fl），非治疗性间充质干细胞则被感染表达 GFP 和海肾荧光素酶（MSC GFP-Rluc）。治疗性间充质干细胞表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（MSC-TRAIL）。TRAIL 是一种持续分泌的蛋白，可结合邻近癌细胞上的死亡受体，启动半胱天冬酶介导的凋亡过程¹⁸.

本文提供了一种用于临床前影像引导下胶质母细胞瘤（GBM）手术切除及负载间充质干细胞（MSC）支架植入的实验方案。简言之，首先对裸鼠实施开颅手术，三天后通过立体定位法原位注射U87 mCh-Fl细胞以建立原发性肿瘤模型。移植后的肿瘤生长约一周时间。在切除手术前48小时，将PLA支架接种MSC细胞。随后在荧光引导下切除肿瘤，并将负载MSC的支架植入切除腔内。术后通过生物发光成像（BLI）监测肿瘤负荷及小鼠生存情况。以下为该实验流程的时间线示意图（图1）。

图1：操作时间线。 小鼠首先接受颅窗手术（第0天）。经过三天恢复期后，植入肿瘤（第3天），肿瘤生长约一周时间。在肿瘤切除及植入手术（第10天）前两天，将MSCs接种至支架上（第8天）。术后通过影像学手段持续评估肿瘤进展及治疗效果（第10天之后）。请点击此处查看该图的放大版本。

方案

本文所述所有方法均已获得北卡罗来纳大学教堂山分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

注意：本实验在已进行开颅手术的小鼠上进行，为 Mostany 和 Portera-Cailliau¹⁹ 所述方案的改良版本，其中手术切除的骨组织被弃去，使脑组织暴露，便于建立并最终切除胶质母细胞瘤（GBM）肿瘤。开颅后，通过立体定位植入法建立肿瘤，具体方法如 Ozawa 和 James²⁰ 所述。我们以以下立体定位坐标（以 bregma 为参考点，单位为 mm）植入 1 × 10⁵ 个 U87 mCh-Fl 细胞：(2.5, 0, -0.5)。

1. 细胞培养与支架制备

注意：支架应在小鼠植入前 48 小时制备。以下体积均为单个支架的用量。根据需要制备额外支架时，请相应增加试剂用量。

1. 将PLA支架切割成与切除腔大小相近的片状（约2 mm × 2 mm）。可使用剪刀手动切割，或使用打孔器以保证重复性。
2. 将支架浸入70%乙醇中15分钟进行灭菌，随后浸入磷酸盐缓冲液（PBS）中。在准备细胞接种期间，将支架置于含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中。
3. 使用0.05%胰蛋白酶（T75培养瓶加3–5 mL）消化贴壁的MSCs，37 °C孵育5分钟。确认细胞完全脱落之后，向培养瓶中加入7–10 mL DMEM以中和胰蛋白酶活性。
4. 将培养瓶内容物转移至15 mL离心管中，用血细胞计数板计数细胞。每块支架接种前，取5 × 10⁵个MSCs，以100 × g离心5分钟形成细胞沉淀。
5. 吸除上清液，将每5 × 10⁵个细胞重悬于5 µL DMEM中。
6. 通过轻拍使支架干燥，为接种做准备。
   1. 用镊子将支架从DMEM中取出，暂时放置于6孔板盖上。提起支架，使多余的DMEM液滴留在盖上。
   2. 将支架再次放置于盖上新的干燥位置。重复此操作3–5次，然后将部分干燥的支架转移至新的6孔板中用于接种。每块支架均需重复此步骤。
      注意：部分干燥的支架可获得最佳的细胞接种效果。若支架过湿，细胞会从支架表面滑落并黏附于孔板底部；若支架过干，细胞悬液无法均匀铺展，导致初始细胞分布不均。
7. 使用移液器轻轻吹打干细胞管，使细胞悬液混匀，以防部分细胞沉降至管底。
8. 缓慢将2.5 µL新鲜混匀的MSC悬液直接滴加在支架表面，在支架上方形成一小滴液滴。
9. 向每孔边缘加入300 µL DMEM，以防止细胞液滴过快蒸发。37 °C孵育30分钟，使细胞充分黏附于支架上。
10. 用镊子轻轻将孔板中的支架翻转。在支架另一面接种2.5 µL新鲜混匀的MSC悬液（每块支架总接种量为5 × 10⁵个细胞）。37 °C孵育30分钟，使细胞黏附。
11. 向每孔加入2 mL DMEM完全覆盖支架。轻轻抬起支架，使培养基能够流至其下方。在植入手术前，于37 °C继续孵育48小时。
12. 24小时后检查支架，若观察到过度蒸发或因pH失衡导致培养基变色，应及时补充或更换培养基。

2. 荧光引导切除与支架植入

注意：手术开始前对所有工具进行灭菌。按照你方规定的方案给予预防性镇痛处理。 机构动物护理和使用委员会（IACUC）方案

1. 将立体定位仪放置在荧光解剖显微镜的载物台上。
2. 在诱导室中使用吸入式异氟烷对小鼠进行麻醉。麻醉后，通过异氟烷鼻罩适配器持续供给吸入麻醉气体，将小鼠固定于立体定位仪中。使用加热垫和/或体温探头维持小鼠体温。
   注意：4-5% 异氟烷适用于诱导麻醉，2-3% 适用于维持麻醉，但需根据每只小鼠的具体情况调整并密切监测。
3. 在眼睛上涂抹眼用软膏，防止角膜干燥。使用三轮酒精棉片和三轮聚维酮碘棉片交替擦拭消毒头皮切口部位。
4. 对每条肢体进行足趾夹捏反射测试，确认无反应以确保麻醉充分。维持稳定的呼吸频率，约为 55–65 次/分钟。
5. 使用镊子夹起并轻轻提起头皮，用手术剪沿中线做前后方向的直线切口。用 PBS 冲洗切口部位，并以棉签头以环形刷拭动作清除皮下脂肪。调整皮肤位置，使先前建立的颅窗完全暴露可见。
6. 使用 18 号针头在颅窗边界内侧轻轻穿刺硬脑膜。重复操作，直至切口完整沿颅窗内缘走行。
7. 用精细镊子将硬脑膜剥离移除，暴露出下方的脑实质和肿瘤组织。
8. 关闭室内光源，打开体视显微镜的荧光模式，定位 U87 mCh-Fl 肿瘤。准备切除时，将 1–200 µL 移液器吸头插入真空泵管路末端。
9. 开启真空泵，通过轻柔抽吸荧光组织进行肿瘤切除，直至无荧光信号残留。关闭真空泵，丢弃移液器吸头。关闭荧光模式，恢复室内照明。
   注意：如需控制出血，可用冷 PBS 冲洗，并以棉签头持续施加压力。在出血较严重的情况下，可暂时用止血剂 填塞切除腔，但必须在止血后将其完全清除，并再次用 PBS 冲洗。
10. 在植入前立即缓慢将接种了间充质干细胞（MSC）的 PLA 支架浸入 PBS 中，以去除不需要的培养基及相关成分。将支架植入肿瘤切除腔内。如需要，可加入 1 µL 纤维蛋白原（67–106 mg/mL），随后加入 1 µL 凝血酶（400–625 U/mL），以固定支架位置。
11. 由于硬脑膜已去除，且颅窗的骨瓣已被丢弃，可直接缝合皮肤并涂抹外科粘合胶封闭伤口。将动物脱离吸入麻醉，置于加热表面使其恢复。
12. 待小鼠能够自主活动后，将其放回笼中。按照 IACUC 批准的方案给予镇痛处理。对每只小鼠重复上述操作。

3. 术后影像学检查

1. 使用28-G胰岛素注射器，按150 mg/kg剂量经腹腔注射D-荧光素酶底物（D-luciferin）至小鼠体内。
2. 等待10分钟，使荧光素在体内充分循环，并与脑内表达荧光素酶的癌细胞发生反应，以达到最强信号表达。
3. 在异氟烷麻醉下（如前所述），将小鼠置于生物发光成像（BLI）系统中进行成像，以可视化肿瘤。根据肿瘤大小，按需调整曝光时间（数秒至数分钟）。
4. 根据需要重复成像操作，以确定肿瘤生长动力学。持续监测动物健康状况。
   注意：治疗性间充质干细胞（MSCs）将持续表达TRAIL，从而杀伤癌细胞并抑制肿瘤整体生长。每2至5天进行一次成像可满足此目的。
5. 当达到IACUC方案中预先规定的实验终点时，通过心脏灌注法处死小鼠，并采集组织用于后续分析。

结果

在注射前，U87 肿瘤细胞经基因工程改造以表达 mCherry 和萤火虫荧光素酶（U87 mCh-Fl），以便进行影像引导切除和生物发光追踪（图 2A-C）。干细胞同样经基因工程改造，分别表达诊断用 GFP-Rluc（MSC-GFP）或治疗用 GFP-TRIAL（MSC-TRAIL），并接种于 PLA 支架上，以确认细胞的黏附与增殖情况（图 2D-F）。

讨论

只要注意以下要点以最大限度地提高精确性并避免耗时的错误，通常每只小鼠的手术可在30分钟内完成。首先，在开始手术前，确保小鼠在立体定位仪中位置正确。头部的不必要移动会影响开颅、肿瘤植入位置以及肿瘤切除程度的手术精度。在切除肿瘤前，应完全去除覆盖在肿瘤上的硬脑膜部分。坚韧的纤维性硬脑膜在抽吸过程中脱水后会变硬。如果未完全去除，硬化后的硬脑膜可能限制吸引器尖端的移动性，从而妨碍肿瘤的完全切除。在切除过程中，血管常会随肿瘤被意外切除，导致明显出血。过多的血液会减弱荧光信号强度并遮蔽肿瘤。在切除过程中保持肿瘤的可见性，有助于确保切除范围恰当，并减少健康组织的损伤和过度出血。对于较小的出血，可用冷生理盐水冲洗受损血管，并用棉签轻轻加压止血 。如果出血持续，可将止血剂填塞入腔内2-3分钟，然后用镊子取出。在植入细胞接种的支架前，需用PBS冲洗以恢复生理pH值。当肿瘤切除完成 且出血停止后，最后一个常见问题是皮肤切口闭合不充分。这通常是由于残留过多液体（PBS或血液）导致手术胶水无法有效粘合切开的皮肤。为避免此问题，可在涂抹胶水前用棉签轻轻擦干皮肤。此外，若在使用胶水前未先用镊子将伤口缝隙夹闭固定，还可能意外将皮肤直接粘附到颅骨上。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
仅适用于小鼠立体定位仪	Stoelting	51730	在手术期间保持头部稳定定位
荧光解剖体视显微镜	Leica	M165 FC	可在肿瘤切除过程中实现实时成像
电动一体化立体定位注射系统（ISI）	Stoelting	53315	可精确控制肿瘤细胞注射体积与速率
Vetbond 组织粘合剂	3M	1469	用于闭合皮肤切口的外科胶水
人工泪液	Akorn	664268	防止手术期间眼睛干涩
Webcol 酒精消毒棉片	Covidien	6818	消毒手术切口部位
聚维酮碘外科 scrub	Purdue Fredick Company	6761815117	消毒手术切口部位
棉签	Fisherbrand	23-400-115	手术工具
E-vac 吸引系统	Argos	EV310	用于切除肿瘤的真空泵
从即用型 TISSEEL 中提取的纤维蛋白原和凝血酶	Baxter		用于暂时固定切除腔内的支架
IVIS Kinetic 活体光学成像系统	Caliper Life Science		生物发光成像仪
D-荧光素钾盐	PerkinElmer	122799	活体成像试剂