通过流式细胞术对小鼠原位同系移植（同源性）KPC 胰腺导管腺癌进行免疫表型分析

摘要

小鼠原位胰腺导管腺癌同种移植瘤免疫表型分析的实验步骤旨在对肿瘤免疫微环境进行特征分析。通过手术将肿瘤原位植入小鼠体内。收获体积为200–600 mm³的肿瘤组织并进行解离，制备单细胞悬液，随后使用不同荧光标记抗体进行多免疫标志物的流式细胞术分析。

摘要

同基因型移植物（同系）肿瘤是当今肿瘤免疫学（I/O）临床前研究的主要模型。肿瘤微环境（TME），尤其是其免疫组分，对预后及治疗效果（特别是免疫治疗）的预测至关重要。TME的免疫组分由多种肿瘤浸润性免疫细胞亚群构成，可通过多色流式细胞术（FACS）进行分析。胰腺导管腺癌（PDAC）是致死率最高的恶性肿瘤之一，目前缺乏有效的治疗手段，存在迫切而未被满足的临床需求。PDAC对多种疗法（化疗、靶向治疗、免疫治疗）不敏感的重要原因之一在于其富含纤维母细胞和白细胞的复杂TME，这些成分可保护肿瘤细胞免受治疗攻击。与传统的皮下（SC）移植模型相比，原位移植的PDAC模型被认为能更真实地模拟人类胰腺癌的肿瘤微环境。

同系移植肿瘤（KPC）来源于基因工程KPC小鼠（Kras^G12D/+/P53^-/-/Pdx1-Cre）自发产生的胰腺导管腺癌（PDAC），并将其移植到小鼠体内（KPC-GEMM）。将原发肿瘤组织切成小片段（约2 mm³），皮下（SC）移植至同系受体小鼠（C57BL/6，7–9周龄）。随后，将这些同系移植瘤通过手术原位移植到新的C57BL/6小鼠的胰腺上，同时进行皮下植入，17天后肿瘤体积达到300–1,000 mm³。根据批准的解剖程序，仅采集体积为400–600 mm³的肿瘤，并清除周围非肿瘤组织。按照方案使用组织解离仪将肿瘤解离为单细胞悬液，随后用针对不同免疫细胞（淋巴细胞、髓系细胞、NK细胞、树突状细胞）多种标志物的荧光标记抗体组合进行染色。染色后的样本通过多色流式细胞术（FACS）分析，以确定不同谱系免疫细胞的数量及其在肿瘤内的相对比例。随后将原位移植肿瘤的免疫谱型与皮下移植肿瘤进行比较。初步数据显示，位于胰腺上的肿瘤中肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）显著升高，且原位移植肿瘤中B细胞的浸润程度高于皮下移植肿瘤。

引言

胰腺导管腺癌（PDAC）每年在全球造成近五十万人死亡，是位居前五位的癌症致死原因之一。目前有效的治疗手段极为有限，且尚无获批的免疫疗法，因此迫切需要开发新的治疗方法。除了已知的遗传性疾病属性外，癌症正越来越多地被认识到也是一种免疫学疾病，包括胰腺导管腺癌（PDAC）在内。免疫学和遗传学因素可能共同决定疾病的预后以及治疗效果。肿瘤能够逃逸宿主的免疫监视，并最终进展导致死亡。许多此类免疫过程发生在肿瘤微环境（TME）^1,2,3,4中，在该环境中，不同类型的免疫细胞通过细胞因子直接或间接地与肿瘤细胞、彼此之间以及其他肿瘤间质成分相互作用，最终决定疾病的发展结局。因此，对TME中肿瘤免疫组分的特征分析，即肿瘤免疫表型分析，包括对不同谱系免疫细胞的分型、计数和定位，对于理解抗肿瘤免疫反应至关重要。在PDAC的情况下，已有研究提出，肿瘤内浸润的抑制性巨噬细胞（TAM）和B细胞水平升高，可能导致T细胞无法浸润和/或活化，并伴随高水平的纤维化^5,6。

实验性研究免疫肿瘤微环境（TME）的常用方法是使用替代性肿瘤临床前动物模....

方案

所有涉及动物护理与使用的方案、修订或操作程序，均须在研究开始前提交至冠科生物机构动物护理与使用委员会（IACUC）进行审查和批准。动物的护理与使用通常将依照美国实验动物评估与认可协会（AAALAC）国际指南进行，该指南载于《实验动物护理与使用指南》（美国国家研究委员会，2011年）。所有动物实验操作均须在SPF（无特定病原体）设施的无菌条件下进行，并严格遵循来自不同政府机构（e.g. 美国国立卫生研究院）发布的《实验动物护理与使用指南》。相关方案必须获得实验设施所属机构动物实验伦理委员会（e.g. 机构IACUC委员会）的批准。

1. 肿瘤移植的准备工作

1. 动物饲养
   1. 从商业繁殖供应商处获取普通的 C57BL/6 小鼠。
   2. 将小鼠（5只）饲养在独立通风笼具中，饲养条件如下：温度：20–26 °C；湿度：30–70%；光照周期：12 小时光照和 12 小时黑暗。
   3. 使用玉米芯垫料，并每周更换一次。
   4. 饮食方面，在整个研究期间提供经辐照灭菌的干颗粒饲料。
   5. 饮水方面，为动物提供自由饮用的无菌饮用水。
2. 供体肿瘤组织片段制备
   1. 首先通过电子天平称重监测荷瘤供体小鼠的体重（BW）和使用游标卡尺....

结果

PDAC的原位移植导致肿瘤快速生长，其生长速度与皮下移植相似。根据步骤2.1和2.2中所述方案，将供体肿瘤组织片段分别皮下和原位移植至受体小鼠后，所移植的KPC同源移植物肿瘤均表现出类似的快速生长趋势，如图1A所示。在不同时间点收获的KPC同源移植物肿瘤如图1B所示，代表性H&E染色图像见图1C。我们的数据表明，皮下移植与原位移植的肿瘤生长情况相似。

无论是原位移植还是皮下移植来源的活体肿瘤细胞以及肿瘤微环境（TME）中的细胞（包括肿瘤浸润性免疫细胞）均可被高效回收。肿瘤组织经收获并消化后，按照第4步所述方案，使用商用组织解离仪制备单细胞悬液，用于后续的流式细胞术（FACS）分析（图2A）。通常情况下，两种移.......

讨论

尽管使用皮下肿瘤的研究更容易开展，但原位移植肿瘤模型在临床前药理学研究（特别是免疫肿瘤学研究）中可能更具相关性，能够提供更强的可转化性。本报告旨在帮助感兴趣的读者直接观察可在各自研究中使用的技术操作流程。我们的实验方案表明，胰腺导管腺癌（PDAC）的原位移植可实现高效的肿瘤生长，效果与皮下移植相似。我们的观察结果还提示，不同移植方式所产生的肿瘤微环境（TME）具有不同的免疫特征。与皮下移植相比，原位移植的主要挑战在于需要复杂的技术操作，过程耗时较长，移植手术本身劳动强度大，且在活体中监测原位肿瘤生长存在困难。

确保正位胰腺肿瘤实验成功进行的关键步骤有四个：1）移植手术操作；2）对肿瘤发育的仔细且及时的监测；3）在正式实验前先开展预实验，以熟悉操作流程，并评估成瘤率和肿瘤生长速度；4）采用解离肿瘤获得的单细胞悬液作为替代性的移植方法。本报告所述方案有助于读者开展此类同系移植研究，以及其他胰腺正位模型，甚至涉及开腹手术的其他正位模型的研究。

流式细胞术或荧光激活细胞分选（FACS）目前是进行免疫谱型分析最重要的工具。FACS 对肿.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
麻醉机	\	SAS3119	\
穿刺器 20	\	\	2 mm
培养皿	\	\	20 mm
100倍抗生素和抗真菌剂	\	\	\
碘伏棉签	\	\	每日药房采购
酒精棉签	\	\	每日药房采购
液氮	Air chemical	\	\
生物安全柜	AIRTECH	BSC-1300IIA2	\
FACS 机器 LSRFortessa X-20	BD	LSR Fortessa	\
抗体	BD	\	\
Trevigen MD 或 BD Matrigel 基底膜基质 高浓度	BD	354248	\
FACS 缓冲液	BD	554656	剪碎缓冲液
Brilliant 染色缓冲液	BD	563794	\
小鼠 BD Fc 封闭剂	BD	553142	\
细胞滤器	BD-Falcon	352350	70 µm
常规采血管	BD-Vacutainer	365974	2 mL
Kaluza	Beckman		vs 1.5
6 孔板	Corning	3516	\
Foxp3 固定/破膜试剂盒	ebioscience	00-5523-00	\
UltraComp eBeads	ebioscience	01-2222-42	\
离心机	eppendorf	5810R,5920R	\
FlowJo 软件	FlowJo LLC	\	vs 10.0
PBS	Hyclone	SH30256.01	50 mL
RPMI 1640	Hyclone	SH30809.01	\
一次性无菌手术刀片	Jin zhong	J12100	11#
刀柄	Jin zhong	J11010	\
眼科剪和镊子	Jin zhong	Y00030	眼科剪 10 cm
眼科剪和镊子	Jin zhong	JD1060	带齿眼科镊 10 cm
便携式液氮罐	Jinfeng	YDS-175-216	\
电子天平	Metter Toledo	AL204	0-100 g
Miltenyi C 管	Miltenyi	130-096-334	\
Miltenyi Gentle MACS 配加热模块	Miltenyi	120-018-306	\
肿瘤解离试剂盒	Miltenyi	130-096-730	\
细胞计数仪	Nexcelom	Cellometer	Cellometer Auto T4
冻存管	Nunc	375418	1.8 mL
Cultrex 高蛋白浓度 (HC20+) BME	PathClear	3442-005-01	\
注射器	上海 MIWA 医疗工业	\	1-5 mL
Studylog 软件	Studylog	\	软件
Studylog-电子天平及配套 USB	OHAUS	SE601F	电子天平及配套 USB
Studylog-游标卡尺数据线	Sylvac	926.6721	游标卡尺数据线
游标卡尺	Sylvac	910.1502.10	Sylvac S-Cal pro
无菌离心管	Thermo	339653	50 mL
无菌离心管	Thermo	339651	15 mL
冰桶	Thermo	KLCS-288	4 °C
冰桶	Thermo	PLF-276	-20 °C
冰桶	Thermo	DW-862626	-80 °C
RNAlater	Thermo	am7021	\