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方法文章

小鼠骨髓来源巨噬细胞中炎性小体激活与细胞焦亡的检测

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DOI：

10.3791/57463

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2018年5月21日

 , 
1Department of Laboratory Medicine, University of Washington

本文内容

摘要

我们描述了在细胞水平上通过荧光显微镜检测NLRP3炎性小体活化的方法，该方法利用针对活化型caspase-1和接头蛋白ASC的染色技术。同时提供了一种乳酸脱氢酶释放实验，用于在群体水平上检测细胞焦亡性裂解。这些技术可被调整用于研究炎性小体生物学的多个方面。

摘要

炎性小体是天然免疫信号转导平台，对于有效控制多种病原体至关重要，但同时也可促进炎症性疾病及自身炎症性疾病的发生。炎性小体由胞质内的模式识别受体激活，其中包括核苷酸结合寡聚化结构域样受体（NOD-like receptor, NLR）家族成员。这些受体在识别微生物相关或损伤相关刺激信号后发生寡聚化。随后招募接头蛋白ASC，形成在显微镜下可见的炎性小体复合物，通过邻近诱导的自激活机制激活caspase-1。激活后的caspase-1切割前体形式的IL-1β和IL-18（pro-IL-1β和pro-IL-18），促使这些促炎性细胞因子活化并分泌至胞外。caspase-1还介导一种称为焦亡（pyroptosis）的炎症性细胞死亡方式，其特征为细胞膜完整性丧失及细胞裂解。caspase-1切割gasdermin D蛋白，释放其N端片段，该片段可在细胞膜上形成孔道，导致渗透性裂解。

体外条件下，可通过使用半胱天冬酶-1（caspase-1）活性探针FAM-YVAD-FMK标记骨髓来源的巨噬细胞，并用针对接头蛋白ASC的抗体对细胞进行染色，来检测caspase-1的激活。该技术可利用荧光显微镜在单细胞水平上识别炎性小体的形成及caspase-1的活化。细胞焦亡可通过检测细胞质乳酸脱氢酶释放到培养基中的情况来判定。该方法操作简便、成本低廉，可在96孔板中进行，适用于高通量筛选。在本文中，我们证明了尼日利亚菌素激活NLRP3炎性小体可导致接头蛋白ASC与活化型caspase-1发生共定位，进而引发细胞焦亡。

引言

炎性小体介导的炎症反应是抵御病原体感染的重要防御机制1，但也参与多种疾病的发病机制2。多种感染引发的炎症反应由细胞质中对病原体相关分子模式（PAMPs）或损伤相关分子模式（DAMPs）的识别所触发。模式识别受体（PRR），包括NOD样受体（NLR）家族成员，在识别这些PAMPs和DAMPs后发生寡聚化。这一过程促使形成一种多蛋白复合物，称为炎性小体，其包含PRR、接头蛋白ASC（含C端半胱天冬酶募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白）以及caspase-1的前体形式3,4。该复合物促使caspase-1通过邻近诱导实现自激活。活化的caspase-1进而引发一系列特征性的炎性细胞死亡过程——细胞焦亡。这些事件包括：炎症性细胞因子IL-1β和IL-18的切割与释放、溶酶体外排及其内容物释放至胞外空间、细胞核浓缩以及gasdermin D的切割。gasdermin D被切割后释放的N端结构域插入细胞膜，形成孔道，导致细胞膜破裂并释放炎症物质，同时破坏病原体复制所需的保护性微环境5,6,7。

本文重点介绍已被广泛研究的NLRP3炎症小体。NLRP3炎症小体的活化通过两步过程实现8。第一步为"启动"步骤，由Toll样受体（TLR）识别微生物产物而触发。在实验室条件下，可通过使用LPS刺激TLR4来模拟该过程。这种刺激通过NF-κB信号通路上调NLRP3和前体IL-1β（pro-IL-1β）。此外，启动过程还通过非转录机制使NLRP3获得活化许可，包括诱导其去泛素化9,10以及特定残基的磷酸化或去磷酸化11,12。

NLRP3 激活的第二个信号被认为涉及线粒体因子、活性氧（ROS）、钾离子外流和钙信号传导，但目前仍不清楚介导 NLRP3 激活的统一机制8。活化的 NLRP3 通过其 NACHT 结构域之间的相互作用发生寡聚化，并通过吡啶结构域（PYD）的结合招募 ASC13。在每个细胞中，这些大分子复合物形成一个在显微镜下可见的单一焦点。ASC 最初被鉴定为一种 22 KDa 的蛋白质，在人白血病细胞凋亡过程中形成"斑点"，因此被命名为含 CARD 的凋亡相关斑点样蛋白14。后续研究发现，ASC 通过其 CARD 结构域与前体半胱天冬酶-1（pro-caspase-1）的 CARD 结构域相互作用，招募前体半胱天冬酶-1，从而形成炎性小体15。

并非所有NLR都需要ASC的存在来诱导caspase-1活化。与NLRP3不同，NLRC4和NLRP1b含有CARD结构域，能够通过CARD-CARD相互作用直接招募前体caspase-1，从而诱导其活化。在缺乏ASC的情况下，活化的caspase-1在细胞质中呈弥散分布，不会形成单一的聚集焦点。这种弥散分布的活化caspase-1足以诱导细胞焦亡，但无法加工前体IL-1β13,16。

在本文中，我们将讨论两种评估炎性小体活化的方法。第一种方法使用荧光活性探针FAM-YVAD-FMK，该探针可结合caspase-1蛋白酶家族。该家族包括caspase-1，以及小鼠的caspase-11和人源的caspase-4与caspase-5。通过在所有实验中使用caspase-1/11缺陷型小鼠来源的巨噬细胞，可验证该探针的特异性。该方法可与炎性小体组分的抗体标记技术联合使用，我们也将对此进行描述。显微观察可识别出含有活化caspase-1和寡聚化ASC的单个细胞。利用该方法，研究人员能够确定其对宿主细胞或所研究病原体的操作在炎性小体形成级联反应中的具体作用位点。例如，可以区分某种干预措施是阻止了ASC向NLRP3复合物的募集，还是影响了后续caspase-1的募集与活化17。仅检测caspase-1活化的下游效应（如IL-1β的分泌）则无法区分这两种情况。此外，IL-1β的分泌可能发生变化，而细胞激活caspase-1并发生焦亡性细胞死亡的能力却未受影响16。

第二种方法通过检测乳酸脱氢酶（LDH）释放到细胞上清液中的情况来评估细胞焦亡，该过程发生在caspase-1激活后巨噬细胞发生裂解时，如上所述。此第二种方法为基于群体的检测方法，因为测量的是整个孔中LDH的释放量。该方法操作简便，可快速分析样本（孵育时间为30分钟），以判断是否存在caspase-1介导的细胞死亡，且可在96孔板中进行。

这些方法具有互补性，各自具有不同的优势，且均易于进行各种修饰。例如，在炎性小体激活之前，用靶向的小分子化合物处理巨噬细胞，可用于研究特定蛋白质在调控炎症反应中的作用。

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方案

所有动物实验程序均经华盛顿大学机构动物护理和使用委员会批准，并在其指导下进行。

1. 骨髓的采集

  1. 无菌条件下从小鼠体内取出股骨和胫骨，并使用无菌器械清理骨骼。将清理后的骨骼置于含 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）+ 5 mM HEPES + 0.2 mg/mL L-谷氨酰胺 + 0.05 mM 2-巯基乙醇 + 50 mg/mL 硫酸庆大霉素 + 10,000 U/mL 青霉素/链霉素 + 10% 胎牛血清（FBS，DMEM-10 完全培养基）的溶液中，将试管置于冰上孵育 15 分钟。
  2. 使用剪刀切除近端和远端的球状关节。将连接有装满培养基的 10 mL 注射器的 25 G 针头插入骨骼的空腔内，用 DMEM-10 完全培养基冲洗骨髓。通过轻柔吹打培养基上下混匀，重悬任何形成的细胞团块。
  3. 以 300 × g 离心细胞 10 分钟，并使用血细胞计数板计数细胞数量。此时可选择使用 90% FBS + 10% 二甲基亚砜（DMSO）冷冻保存细胞，或将细胞接种至 15 cm 培养皿中，利用 L929 条件培养基诱导分化为巨噬细胞（见步骤 2.1）。

2. 骨髓来源巨噬细胞的分化

  1. 使用预热的分化培养基（21 mL DMEM-10 完全培养基和 9 mL L929 细胞条件培养基，参照 Swanson et al.18 的方法），将骨髓细胞接种于 15 cm 非组织培养处理的培养皿中（1.2–1.5 × 107 个细胞）。将培养皿置于 37 °C、5% CO2 条件下培养 7 天。在第 3 或第 4 天向培养皿中额外添加 30 mL 分化培养基。
    注意：切勿使用组织培养处理的培养皿，否则巨噬细胞将难以脱离和收获。
  2. 收集巨噬细胞时，先用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗培养皿，然后加入 20 mL 冷 PBS + 1 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）。将培养皿置于 4 °C 孵育 10 分钟。通过用移液器反复吹打 PBS + EDTA 溶液覆盖细胞表面来收获细胞，并用 10 mL PBS 冲洗培养皿。将两次洗涤液合并至两个 15 mL 圆底离心管中。
  3. 以 300 × g 离心 10 分钟，弃上清后将细胞重悬于 10 mL 酚红-free DMEM + 5 mM HEPES + 0.2 mg/mL L-谷氨酰胺 + 0.05 mM 2-巯基乙醇 + 5% FBS（DMEM-5）中，使用血细胞计数板或库尔特计数器进行细胞计数。计数过程中保持细胞置于冰上。
  4. 将巨噬细胞以 2 × 105 个细胞/mL 的密度接种于组织培养包被的培养板中。进行显微镜实验时，在 24 孔板中每孔盖玻片上接种 1 mL 细胞悬液；进行乳酸脱氢酶（LDH）释放检测时，每孔接种 100 µL 细胞悬液至 96 孔板中。进行 LDH 检测时，共接种 9 个孔（3 个孔为未处理对照，3 个孔为 100% 裂解对照，3 个孔为实验刺激组）。
  5. 将 96 孔板以 300 × g 离心 5 分钟，以确保细胞均匀分布于各孔底部。
  6. 在开始启动处理前，将培养板于 37 °C、5% CO2 条件下过夜孵育。

3. 引物预处理

  1. 用含有 100 ng/mL LPS 的新鲜培养基（DMEM-5）替换原培养基（24 孔板每孔 500 μL，96 孔板每孔 50 μL）。
    注意：LPS 存在多种结构变异，会影响其刺激 TLR4 介导的启动能力19。建议使用来自 Salmonella minnesota R595 (Re) 的 LPS，该产品可从多家供应商获得。
  2. 在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 3 小时。

4. 使用尼日利亚菌素激活NLRP3炎症小体并用FAM-YVAD-FMK标记

  1. 移除培养基，并加入含有 5 μM 尼日霉素和 5 mM 甘氨酸的 290 μL DMEM-5。添加甘氨酸以减少在caspase-1激活过程中发生的细胞裂解5。在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育 60 分钟。使用野生型和caspase-1缺陷型巨噬细胞，以确保观察到的标记特异性针对caspase-1。
  2. 在最后 45 分钟内，加入按制造商说明配制的 10 μL 30x FAM-YVAD-FMK。
  3. 60 分钟后，移除培养基，并用 1 mL 冷 PBS 洗涤细胞三次，每次 5 分钟。
  4. 向每孔中加入 250 μL 2% 多聚甲醛，在冰上避光（用铝箔覆盖）孵育 30 分钟。
  5. 在最后 5 分钟时，加入 4 μL 0.2 mM 远红荧光核酸染料以标记细胞核。也可使用 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）或其他染料标记 DNA。
  6. 用 1 mL 冷 PBS 洗涤细胞三次，然后将盖玻片用 7 μL 抗荧光淬灭封片剂封固于显微镜载玻片上。待封片剂过夜固化后，再用指甲油将盖玻片密封至载玻片。
  7. 通过共聚焦显微镜观察巨噬细胞。FAM-YVAD-FMK 的激发/发射波长为 492/520 nm，远红荧光核酸染料为 642/661 nm。务必设置显微镜，使未经处理的细胞在 488 通道中不显示任何背景染色。否则将检测到 FAM-YVAD-FMK 的背景染色，而非真实的活化caspase-1。
    注意：显微镜设置详见第 6 节。

5. 抗体染色

注意：为了使用抗体标记细胞以检测ASC，需将细胞接种、预处理并用尼日里辛处理，操作步骤与前一节相同。之后的处理步骤如下：

  1. 用 1 mL 冷 PBS 每次 5 分钟，洗涤细胞三次。加入 250 μL 固定和透化溶液。将细胞置于冰上避光孵育 30 分钟。
  2. 用 1 mL 洗涤缓冲液每次 5 分钟，洗涤巨噬细胞三次。
  3. 加入 250 μL 以洗涤缓冲液按 1:500 稀释的抗 ASC 一抗，冰上孵育 1 小时。设置一个不加一抗但仅加二抗的盖玻片，用于显微镜调试时设定正确的偏移值。
  4. 用 1 mL 洗涤缓冲液每次 5 分钟，洗涤细胞三次。
  5. 加入 250 μL 以洗涤缓冲液按 1:500 稀释的二抗（荧光染料标记的羊抗小鼠抗体），冰上孵育 1 小时。在孵育的最后 5 分钟加入 4 μL 0.2 mM 的远红外荧光核酸染料以标记细胞核。
  6. 用 1 mL 冷洗涤缓冲液洗涤细胞三次，每次 5 分钟，然后用 7 μL 抗荧光淬灭封片剂将盖玻片封固于载玻片上。待封片剂过夜固化后，用透明指甲油将盖玻片边缘密封。
  7. 通过共聚焦显微镜观察巨噬细胞。二抗的激发/发射波长为 555/580 nm，远红外荧光核酸染料为 642/661 nm（如下所述）。
    注意：可结合 FAM-YVAD-FMK 标记与抗体标记，以显示活化型 caspase-1 与 ASC 的共定位。具体操作为：先按照 FAM-YVAD-FMK 标记条件处理，随后切换至抗体标记方案进行后续步骤。

6. 共聚焦显微镜对标记巨噬细胞的成像

注意：染色后的细胞需待盖玻片在室温下固化过夜，并用指甲油封固于显微镜载玻片上后，方可观察。此处描述的是使用共聚焦显微镜进行成像的方法。细胞也可通过标准的荧光显微镜观察。

  1. 将未处理对照组细胞的载玻片置于显微镜载物台上，并将显微镜聚焦于细胞。
  2. 利用显微镜的查找表（LUT）设置，调节偏移量，使未处理细胞中无明显的FAM-YVAD-FMK染色信号。此步骤也可使用caspase-1缺陷型巨噬细胞进行。
    注意：实验中使用的每个通道均需调整偏移量，但FAM-YVAD-FMK通道及荧光抗体通道的偏移量设置尤为关键，而DNA通道的偏移量相对不敏感。一旦设定偏移量，在后续实验过程中不得再进行调整。
  3. 更换为尼日利亚菌素处理的样本载玻片。寻找一个同时包含FAM-YVAD-FMK染色阳性与阴性细胞的视野。将FAM-YVAD-FMK通道的成像平面调整至阳性信号最强的层面，通常为炎性小体焦点中心所在的成像平面。
  4. 调节增益，使具有浓缩细胞核的细胞中可见清晰的焦点信号。在完成增益和偏移量设置后，整个成像过程中保持这些参数不变。
    注意：判断细胞是否发生焦亡的一个简便方法是观察细胞核形态。激活caspase-1的细胞表现为细胞核呈圆形且浓缩，而未激活caspase-1的细胞则可见核仁，其核形态与未处理细胞相似。
  5. 以100倍总放大倍数随机选取5个视野采集图像，每个图像通常包含约40个细胞。对每个样本重复此过程。
  6. 使用图像分析软件统计每张图像中的细胞总数，再统计其中FAM-YVAD-FMK染色阳性细胞的数量。将caspase-1的激活水平表示为FAM-YVAD-FMK阳性细胞所占的百分比。

7. LDH 释放检测

注意：进行LDH释放实验时，除使用96孔板外，其余细胞接种和预处理步骤均如前一节所述进行。预处理后不要移除培养基。

  1. 向实验孔中加入 50 μL 含 10 μM 尼日尔菌素的 DMEM-5，向自发裂解和 100% 裂解对照孔中各加入 50 μL DMEM-5。本实验中不添加甘氨酸，因为目的是测量细胞裂解。在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育 60 分钟。
  2. 孵育 30 分钟后，向 100% 裂解对照孔中加入 10 μL 10 倍裂解缓冲液，向其余孔中加入 10 μL DMEM-5。在此孵育期间，从冰箱中取出 1 瓶底物混合物（1.5 mL 冻干底物）和 1 份检测缓冲液（约 12 mL），避光置于室温下使其解冻。
    注意：底物混合物含有四氮唑盐（碘硝基氯化四氮唑蓝），可转化为红色甲臜产物。
  3. 完成总共 60 分钟的孵育后，在 10 °C 下以 500 × g 离心 5 分钟。将 50 μL 上清液转移至透明平底板中。在此期间，将 12 mL 检测缓冲液加入底物混合物小瓶中，混匀后于室温避光孵育 5 分钟，再进行后续使用。
  4. 向每孔加入 50 μL 底物溶液，在避光条件下孵育 30 分钟。设置仅含培养基的孔作为空白对照。在 15 分钟后检查微孔板，确保信号不会超过酶标仪的检测上限。
  5. 孵育 30 分钟后，向每孔加入 50 μL 终止液（1 M 乙酸），使用酶标仪测定 OD490 值。
  6. 使用以下公式计算细胞裂解百分比：
    % 细胞毒性 = ((实验组 - 自发裂解组)/(最大裂解组 - 自发裂解组)) × 100
    实验组：尼日尔菌素处理的细胞；自发裂解组：未处理细胞；最大裂解组：暴露于裂解缓冲液的细胞

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结果

为了检测尼日利亚菌素处理后caspase-1的活化情况，细胞按照方案部分所述进行处理。我们同时结合了FAM-YVAD-FMK和ASC抗体标记，以显示在NLRP3介导的炎性小体活化后，ASC与活化的caspase-1发生共定位。图1A显示，暴露于5 μM尼日利亚菌素的野生型巨噬细胞在核周区域形成了ASC焦点。这些焦点也包含活化的caspase-1，表现为ASC与FAM-YVAD-FMK信号的共定位。显示caspase-1活化的细胞同时表现出细胞核浓缩，表明这些细胞正在经历焦亡。图1B显示，caspase-1/11缺陷小鼠的巨噬细胞虽然也能形成ASC焦点，但该焦点中无任何活化的caspase-1，表现为FAM-YVAD-FMK染色缺失。这些细胞的细胞核未发生浓缩，表明未发生焦亡性细胞死亡。图像使用配备63X油镜的扫描共聚焦显微镜采集，以TIFF格式保存，未经任何后续处理。

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讨论

在本论文中，我们介绍了两种技术，用于检测NLRP3刺激后小鼠骨髓来源巨噬细胞中炎性小体的活化以及caspase-1活化所产生的后果。第一种技术使研究人员能够在单细胞水平上测定caspase-1的活化程度，使用的是荧光报告分子FAM-YVAD-FMK。该报告分子对caspase-1酶家族具有高度特异性，这一点在caspase-1/11缺陷型巨噬细胞中无染色信号的结果中得以证实。LaRock 等在其描述耶尔森菌蛋白YopM对caspase-1活化作用的论文中也验证了其特异性。在该研究中，他们显示FAM-YVAD-FMK形成的荧光焦点与针对caspase-1的抗体标记的焦点完全重合17。

与任何实验一样，为避免出现假阳性结果，必须遵循一些关键步骤。首先，必须同时使用野生型和caspase-1/11缺陷型巨噬细胞。通过使用这两种细胞类型，可排除导致非特异性染色的条件，从而避免其进入后续分析。其次，与任何抗体或活性探针标记实验一样，在使用FAM-YVAD-FMK染色后，必须对细胞进行充分洗涤。通过进行三次每次...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露

致谢

所有显微镜实验均在W. M. Keck显微镜中心完成，由Nathaniel Peters提供支持，并获得NIH资助S10OD016240的支持。S.L.F.获得NIH资助K08AI119142和R21AI130281的支持。我们感谢Richard Flavell博士和Brad Cookson博士提供caspase-1/11缺陷型小鼠，以及Brad Cookson博士共享实验室设施和设备。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
E-MEMATCC30-2003用于培养 L929 细胞
NCRC clone 929 (L929)ATCCCCL-1
固定/透化试剂盒BD Biosciences554714包含固定液、透化液和洗涤缓冲液；专有配方；含 4.2% 甲醛
甘氨酸Biorad161-0718
Cytotox96 非放射性细胞毒性检测试剂盒Fisher ScientificPR-G1780包含底物混合液和检测试剂缓冲液；专有配方；终止液为 1 M 乙酸
FAM-YVAD-FMKImmunocytochemistry Technologies98
DMEM，高糖，不含谷氨酰胺Invitrogen11960044
DMEM，高糖，不含谷氨酰胺，不含酚红Invitrogen31053028
Dulbecco's PBS，不含钙、不含镁Invitrogen14190144
胎牛血清，经鉴定，美国来源Invitrogen26140079在 55°C 下热灭活 50 分钟
庆大霉素Invitrogen15750060
ProLong Gold 封片剂Invitrogenp36934专有配方；固化封片介质；固化后折射率为 1.46
山羊抗小鼠 ALEXA555InvitrogenA-21422
HEPES（超纯）Invitrogen11344041
L-谷氨酰胺Invitrogen21051024
青霉素-链霉素Invitrogen15140122
TO-PRO-3 碘化物InvitrogenT3605远红荧光核酸染料
C57BL/6J 小鼠Jackson Laboratory000664
caspase-1/11-/- 小鼠Jackson Laboratory016621
Leica SP8X 共聚焦显微镜Leica
来自 Salmonella minnesota R595 (Re) 的超纯 LPSList Biologicals434
抗 ASC 单克隆抗体，克隆号 2EI-7Millipore-Sigma04-417
β-巯基乙醇Millipore-SigmaM6250-10ML
DMSOMillipore-SigmaD2650-5X10ML
EDTAMillipore-SigmaE5391
Spectramax M3 酶标仪Molecular Devices5000414

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Caspase 1 ASC LDH FAM YVAD FMK Gasdermin D
小鼠骨髓来源巨噬细胞中炎性小体激活与细胞焦亡的检测
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