全细胞膜片钳记录的制备与操作方案 Xenopus laevis 中脑顶盖神经元

摘要

本文中，我们讨论了三种用于全细胞膜片钳记录以研究视网膜-顶盖环路的脑组织制备方法 非洲爪蟾 蝌蚪。每种制备方法都有其特定的优势，有助于提高实验的可操作性 非洲爪蟾 以蝌蚪为模型研究神经环路功能

摘要

这 非洲爪蟾 蝌蚪视网膜-视顶盖环路由眼睛中的视网膜神经节细胞（RGCs）组成，这些细胞直接在视顶盖神经元上形成突触，是研究神经环路如何自我组装的常用模型。能够对视顶盖神经元进行全细胞膜片钳记录，并记录RGC诱发的反应，无论是 体内 或使用全脑制备方法，已产生大量关于正常与异常神经环路形成及功能机制的高分辨率数据。本文描述了如何执行 体内 制备方法、原始的完整脑制备方法，以及近期发展的用于从视顶盖神经元获取全细胞膜片钳记录的水平脑片制备方法。每种制备方法均具有独特的实验优势。 体内 该制备方法能够记录视觉刺激投射到眼睛时顶盖神经元的直接反应。全脑制备可实现对视网膜神经节细胞（RGC）轴突的高度可控激活，而水平脑片制备则允许对顶盖各层进行跨层记录。

引言

视网膜-顶盖通路是两栖动物视觉系统的主要组成部分，由视网膜中的视网膜神经节细胞（RGCs）构成，这些细胞的轴突投射至视顶盖，并与顶盖内突触后神经元形成突触连接。 非洲爪蟾 蝌蚪视网膜-视顶盖环路是研究神经环路发育与功能的常用发育模型。该蝌蚪的视网膜-视顶盖环路具有多种特性，使其成为一种强大的实验模型^1,2,3一个主要特性，也是本文的重点，即能够对视顶盖神经元进行全细胞膜片钳记录， 体内 或使用全脑制备标本。通过配备支持电压钳和电流钳记录模式放大器的电生理设备，全细胞膜片钳记录可实现对神经元电生理特性的高分辨率表征。因此，对视顶盖环路形成关键阶段中顶盖神经元进行的全细胞膜片钳记录，已为内在特性的发展与可塑性提供了详尽而全面的理解^4,5,6,7 和突触^8,9,10,11 特性。结合全细胞膜片钳技术对视顶盖神经元进行记录，可在这些神经元中表达特定基因或吗啉寡核苷酸¹²以及通过已建立的视觉回避测试来评估视觉引导行为的方法¹³ 促进分子、神经环路功能与行为之间关联的鉴定。

需要注意的是，使用新型成像方法（如遗传编码钙指示剂GCaMP6）无法获得全细胞膜片钳记录所能提供的高分辨率数据。尽管钙指示剂能够同时对大量神经元的钙动力学进行成像，但通过测量胞体的荧光变化（ΔF）无法直接或明确地获取特定的电生理参数，也无法对神经元进行电压钳制以测量电流-电压关系。显然，电生理记录与钙成像这两种截然不同的方法具有互补的优势，并产生不同类型的数据。因此，最佳方法的选择取决于所要解决的具体科学问题。

在此，我们介绍一种利用全细胞膜片钳技术从蝌蚪视顶盖神经元记录电生理信号的方法，该方法采用 体内 制备，全脑制备，以及本实验室开发的一种新型改良全脑制备方法¹⁴在代表性结果部分，我们展示了每种制备方法的实验优势以及可获得的不同类型数据。不同制备方法的局限性与优势，以及故障排除建议，均包含在讨论部分。

方案

本文所述所有方法均已获得怀俄明大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。所有操作步骤（包括电生理记录）均在室温下进行，温度约为 23 °C。本文所述所有方法均针对发育阶段 42 至 49 期的蝌蚪顶盖神经元记录进行了优化（发育阶段根据 Neiuwkoop 和 Faber¹⁵ 确定）。

1. 在体 内 准备

1. 麻醉蝌蚪。
   1. 将蝌蚪置于含有含0.01% MS-222的Steinberg溶液的小型培养皿中，约5分钟。
      ​注意：MS-222 又称 "Tricaine" 是一种常用的鱼类和两栖类麻醉剂。蝌蚪在Steinberg's溶液中培养，单位为mM：0.067 KCl，0.034 Ca(NO₃)₂₃)₂•4H₂O, 0.083 MgSO₄₄•7H₂O, 5.8 NaCl, 4.9 HEPES
   2. 确保蝌蚪已深度麻醉（无反应且不再游动），然后再进行步骤2。
2. 将麻醉后的蝌蚪固定在解剖/记录皿底部浸没的硅胶块上。
   1. 使用一次性移液管将麻醉后的蝌蚪转移至含有外部记录液（115 mM NaCl、2 mM KCl、3 mM CaCl₂）的解剖/记录皿中₂，3 mM MgCl₂₂，5 mM HEPES，1 mM 葡萄糖；用10 N NaOH调节pH至7.25，渗透压为255 mOsm。
      1. 为减少自发性肌肉抽搐，向胞外溶液中加入乙酰胆碱受体阻滞剂筒箭毒碱（100 µM）。（通常使用200 µL移液器将100 µL的10 mM筒箭毒碱储备液加入10 mL胞外溶液中制备。）
   2. 使用昆虫针将蝌蚪背侧朝上固定在浸没的硅橡胶块（如Sylgard 184，参见 材料表 （详见正文），该物已粘附于解剖皿底部。
      注意：针的位置至关重要：应将针放置在脑的两侧，位置足够靠后，以避免刺入从眼睛发出并在视顶盖前方进入脑的传入性视网膜神经节细胞轴突图1A).
3. 沿中线剖开脑组织。
   1. 为清晰观察脑部，使用无菌25号针头沿中线做浅表切口，去除覆盖在脑部的皮肤。
   2. 沿相同的中线轴线，将针插入神经管，轻轻向上（背侧）牵拉，以完整剥离（切断）神经管的背侧部分，同时保持底板完整图1B).
      ​注意：必须保持神经管底板的完整性，因为传入的感觉输入是通过底板进入视顶盖的。
4. 去除覆盖在四叠体神经元上的透明脑室膜。
   1. 将记录培养皿移至电生理装置，使用断裂的玻璃移液管尖端去除覆盖在视顶盖神经元胞体上方的脑室膜。通过将移液管尖端轻轻在精细擦拭纸上拖动以使其断裂。
   2. 将移液管拧入移液管固定器，并通过显微操作仪将其下降至视顶盖。
   3. 使用破损的移液管将脑室膜从视顶盖上剥离。
      注意：无需将膜从整个视顶盖上剥离；开一个小窗即已足够，并可暴露大量神经元。
5. 获取全细胞膜片钳记录。
   注意：从这一点开始的操作方法类似于 Segev 所述的小鼠脑切片全细胞膜片钳记录。 等¹⁶(图1C).
6. 记录投射到视网膜上的全视野闪光所诱发的中脑顶盖神经元反应。
   1. 将光纤置于蝌蚪眼睛附近，以向视网膜投射全视野闪光刺激。光纤的另一端连接一个与可变电阻串联的LED，通过可变电阻调节光照亮度。利用放大器的数字输出信号触发LED，从而实现不同强度全视野闪光刺激的记录。图4A).

2. 全脑制备

1. 执行步骤 1.1 至 1.3。
   注意：此制备过程中，外部溶液中无需添加筒箭毒碱。
2. 分离脑组织。
   1. 使用25号针头切断后脑图2A).
   2. 用针头轻轻从尾侧向头侧方向在蝌蚪脑下方划过，以切断所有侧方和腹侧的结缔组织及神经纤维，从而分离出完整的大脑。
3. 将脑组织固定在硅胶弹性体块上。
   1. 完全游离后，用一根针穿过一侧嗅球，另一根针穿过脑干，将脑固定在硅胶弹性块上图2B这是记录顶盖神经元的最佳配置。
4. 将含有固定好的全脑标本的培养皿从解剖显微镜下移至电生理记录装置。使用步骤1.4中所述的断裂玻璃移液管去除脑室膜。
5. 将双极刺激电极放置在视交叉处（即来自每只眼睛的轴突在中脑交叉的位置），以直接激活视网膜神经节细胞（RGC）轴突。
   1. 将双极刺激电极置于大脑中脑室前方，几乎紧邻其位置。视交叉位于大脑中脑室前方紧邻处。图2B).
      1. 轻轻将刺激电极下放至视交叉上，使组织表面形成轻微凹陷。双极电极由脉冲刺激器驱动，可精确控制刺激强度。
6. 进行全细胞膜片钳记录（图2C如 Segev 所述） 等¹⁶

3. 水平脑切片制备

1. 执行步骤 2.1 至 2.3。
2. 使用剃须刀片切除最外侧的四分之一（即 体内 对应于一侧视顶盖最背侧的四分之一区域。该切口应平行于头尾平面，如图所示。 图3A.
3. 将脑组织重新固定在硅胶弹性体侧面，切面朝上（以便直接接触细胞体和神经 Neuropil 进行记录），脑的脑室面背向硅胶弹性体块图3B（以便将双极电极放置在视交叉上）。
4. 进行全细胞膜片钳或局部场电位记录（图3C如 Segev 所述） 等¹⁶

结果

为了记录光诱发的反应，将全视野闪光投射到视网膜上，同时记录单个视顶盖神经元的反应（图4A）。该特定实验方案旨在测量神经元对光开启时的反应（“开启”反应），以及15秒后光关闭时的反应（“关闭”反应）。视顶盖神经元通常表现出明显的开启和关闭反应（此处以电压钳模式记录，将神经元钳制在-60 mV以测量突触电流）（图4B）。通过记录自发性突触事件，可量化任一神经元接收到的突触驱动程度（图4C）。通过逐步将神经元钳制到越来越去极化的电位，并记录由此产生的电压激活的Na⁺和K⁺电流，可从同一神经元生成电流-电压关系曲线（I-V曲线），此类记录被称为“混合电流记录”（图4D, E

讨论

本研究中描述的所有方法均针对发育阶段42至49的蝌蚪（根据Neiuwkoop和Faber¹⁵分期）的视顶盖神经元记录进行了优化。在第42期时，蝌蚪已足够大且发育充分，可在脑部两侧放置昆虫针，用于进行in vivo记录以及全脑解剖。在更早的阶段，当蝌蚪基本上呈二维（i.e.，扁平）时，此处描述的方法并非最佳选择。

由于视顶盖神经元易于接近并进行全细胞记录，该模型电路已成为研究神经环路在形成过程中如何发挥功能，以及在功能活动中如何形成的诸多基本发现的重要平台¹⁹。本文介绍了如何从视顶盖神经元获取全细胞膜片钳记录，包括蝌蚪活体（in vivo）和离体全脑制备方法、不同的记录模式，以及各类数据的示例。接下来将讨论每种制备方法的优势与局限性，并提供获得高质量全细胞记录的实用技巧。

非洲爪蟾 蝌蚪在受精后约7至8天的47/48期开始表现出视觉回避行为

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Stemi Stereo 508	Zeiss	495009-0006-000	解剖显微镜
MS-222 "Tricane"	Finquel	ARF5G	两栖动物通用麻醉剂
氯化钠 (NaCl)	Fisher Scientific	S271-3	用于配制Stienberg溶液和外部溶液
氯化钾 (KCl)	Fisher Scientific	P217-500	用于配制Stienberg溶液和外部溶液
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-1KG	用于配制Stienberg溶液和外部溶液
四水合硝酸钙 (Ca(NO3)•4H2O)	Sigma-Aldrich	237124-500G	用于配制Stienberg溶液
硫酸镁 (MgSO4)	Mallinckrodt Chemicals	6066-04	用于配制Steinberg溶液
氯化钙 (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C5080-500G	用于配制外部记录溶液
氯化镁 (MgCl2)	J.T. Baker	2444-01	用于配制外部记录溶液
无水D-葡萄糖	Mallinckrodt Chemicals	6066-04	用于配制外部记录溶液
五水合氯化筒箭毒碱	Sigma	T2379	烟碱型乙酰胆碱受体拮抗剂
昆虫用固定针	Fine Science Tools	26002-10	直径0.1 mm的不锈钢针
Sylgard 184硅胶弹性体套件	Dow Corning	761028	预称量的单体与固化剂套件
无菌聚苯乙烯培养皿 - 60×15 mm	Fisher Scientific	AS4052	小型培养皿
PrecisionGlide 针头 25G×5/8 (0.5 mm × 16 mm)	BD	305122	注射器针头
1 mL滑动式乳头结核注射器	BD	309659	一次性无菌注射器
硼硅酸盐玻璃毛细管	Sutter Instrument	BF150-86-10HP	使用拉管机制备成所需规格的微电极
Flaming/Brown微电极拉制仪	Sutter Instruments	P-97	用于制备电生理记录用微电极
Kimwipes Kimtech擦拭纸	Kimberly-Clark	34120	适用于精细操作的无尘擦拭纸
Axon Instruments MultiClamp 700B前置放大器 CV-7B	Molecular Devices	1-CV-7B	电流钳和电压钳前置放大器
MP-285电动显微操作器（含桌面控制器）	Sutter Instrument	MP-285/T	电生理装置中前置放大器的控制设备
光纤耦合LED（绿色）	Thorlabs	M530F2	与绿色LED配对的光纤电缆
簇状双极刺激电极（直径25µm）	FHC	30207	双极刺激电极
ISO-Flex刺激隔离器	A.M.P.I. (Israel)	联系制造商	灵活的刺激隔离装置
Axon Instruments 700B多通道膜片钳放大器	Molecular Devices	2500-0157	用于电压钳和电流钳记录的放大器
Digidata 1322A数据采集卡	Molecular Devices	2500-135	电生理记录用数据采集系统
Axio Examiner.A1	Zeiss	491404-0001-000	用于电生理实验的显微镜
Micro-g实验台	TMC	63-533	电生理显微镜用气浮台
配备Windows 7 64位系统的Inspiron 620台式计算机	Dell	D06D001	运行电生理软件的计算机
c2400 CCD相机	Hamamatsu	70826-5	用于电生理成像的电荷耦合器件相机
7 O'Clock超级铂金不锈钢剃须刀片	Gillette	CMM01049	镀铂不锈钢刀片
移液管	Fisher Scientific	13-711-7M	一次性聚乙烯移液管