本文中，我们讨论了三种用于全细胞膜片钳记录以研究视网膜-顶盖环路的脑组织制备方法 非洲爪蟾 蝌蚪。每种制备方法都有其特定的优势，有助于提高实验的可操作性 非洲爪蟾 以蝌蚪为模型研究神经环路功能
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本文内容
摘要
摘要
这 非洲爪蟾 蝌蚪视网膜-视顶盖环路由眼睛中的视网膜神经节细胞（RGCs）组成，这些细胞直接在视顶盖神经元上形成突触，是研究神经环路如何自我组装的常用模型。能够对视顶盖神经元进行全细胞膜片钳记录，并记录RGC诱发的反应，无论是 体内 或使用全脑制备方法，已产生大量关于正常与异常神经环路形成及功能机制的高分辨率数据。本文描述了如何执行 体内 制备方法、原始的完整脑制备方法，以及近期发展的用于从视顶盖神经元获取全细胞膜片钳记录的水平脑片制备方法。每种制备方法均具有独特的实验优势。 体内 该制备方法能够记录视觉刺激投射到眼睛时顶盖神经元的直接反应。全脑制备可实现对视网膜神经节细胞（RGC）轴突的高度可控激活，而水平脑片制备则允许对顶盖各层进行跨层记录。
引言
视网膜-顶盖通路是两栖动物视觉系统的主要组成部分，由视网膜中的视网膜神经节细胞（RGCs）构成，这些细胞的轴突投射至视顶盖，并与顶盖内突触后神经元形成突触连接。 非洲爪蟾 蝌蚪视网膜-视顶盖环路是研究神经环路发育与功能的常用发育模型。该蝌蚪的视网膜-视顶盖环路具有多种特性，使其成为一种强大的实验模型1,2,3一个主要特性，也是本文的重点，即能够对视顶盖神经元进行全细胞膜片钳记录， 体内 或使用全脑制备标本。通过配备支持电压钳和电流钳记录模式放大器的电生理设备，全细胞膜片钳记录可实现对神经元电生理特性的高分辨率表征。因此，对视顶盖环路形成关键阶段中顶盖神经元进行的全细胞膜片钳记录，已为内在特性的发展与可塑性提供了详尽而全面的理解4,5,6,7 和突触8,9,10,<....
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方案
本文所述所有方法均已获得怀俄明大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。所有操作步骤（包括电生理记录）均在室温下进行，温度约为 23 °C。本文所述所有方法均针对发育阶段 42 至 49 期的蝌蚪顶盖神经元记录进行了优化（发育阶段根据 Neiuwkoop 和 Faber15 确定）。
1. 在体 内 准备
- 麻醉蝌蚪。
- 将蝌蚪置于含有含0.01% MS-222的Steinberg溶液的小型培养皿中，约5分钟。
注意：MS-222 又称 "Tricaine" 是一种常用的鱼类和两栖类麻醉剂。蝌蚪在Steinberg's溶液中培养，单位为mM：0.067 KCl，0.034 Ca(NO₃)₂3)2•4H2O, 0.083 MgSO₄4•7H2O, 5.8 NaCl, 4.9 HEPES - 确保蝌蚪已深度麻醉（无反应且不再游动），然后再进行步骤2。
- 将蝌蚪置于含有含0.01% MS-222的Steinberg溶液的小型培养皿中，约5分钟。
- 将麻醉后的蝌蚪固定在解剖/记录皿底部浸没的硅胶块上。
- 使用一次性移液管将麻醉后的蝌蚪转移至含有外部记录液（115 mM NaCl、2 mM KCl、3 mM CaCl₂）的解....
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结果
为记录光诱发的反应，将全视野闪光投射到视网膜上，同时记录单个视顶盖神经元的响应（图4A）。该特定方案旨在测量神经元对光开启时的反应（“开启”反应），以及15秒后光关闭时的反应（“关闭”反应）。视顶盖神经元通常表现出明显的开启和关闭反应（此处显示以电压钳制模式记录，将神经元钳制在-60 mV以测量突触电流（图4B））。通过记录自发性突触事件，可量化任一神经元接收到的突触驱动程度（图4C）。通过逐步将神经元钳制至去极化程度更高的电位，并记录由此产生的电压门控Na+和K+电流，可从同一神经元生成电流-电压关系曲线（I-V曲线），此类记录称为“混合电流记录”（图4D, E
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讨论
本研究中描述的所有方法均针对发育阶段42至49的蝌蚪（根据Neiuwkoop和Faber15分期）的视顶盖神经元记录进行了优化。在第42期时，蝌蚪已足够大且发育充分，可在脑部两侧放置昆虫针，用于进行in vivo记录以及全脑解剖。在更早的阶段，当蝌蚪基本上呈二维（i.e.，扁平）时，此处描述的方法并非最佳选择。
由于视顶盖神经元易于接近并进行全细胞记录，该模型电路已成为研究神经环路在形成过程中如何发挥功能，以及在功能活动中如何形成的诸多基本发现的重要平台19。本文介绍了如何从视顶盖神经元获取全细胞膜片钳记录，包括蝌蚪活体（in vivo）和离体全脑制备方法、不同的记录模式，以及各类数据的示例。接下来将讨论每种制备方法的优势与局限性，并提供获得高质量全细胞记录的实用技巧。
非洲爪蟾 蝌蚪在受精后约7至8天的47/48期开始表现出视觉回避行为
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
由 NIH 资助项目 SBC COBRE 1P20GM121310-01 支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Stemi Stereo 508 | Zeiss | 495009-0006-000 | 解剖显微镜 |
| MS-222 "Tricane" | Finquel | ARF5G | 两栖动物通用麻醉剂 |
| 氯化钠 (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | 用于配制Stienberg溶液和外部溶液 |
| 氯化钾 (KCl) | Fisher Scientific | P217-500 | 用于配制Stienberg溶液和外部溶液 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-1KG | 用于配制Stienberg溶液和外部溶液 |
| 四水合硝酸钙 (Ca(NO3)•4H2O) | Sigma-Aldrich | 237124-500G | 用于配制Stienberg溶液 |
| 硫酸镁 (MgSO4) | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | 用于配制Steinberg溶液 |
| 氯化钙 (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | 用于配制外部记录溶液 |
| 氯化镁 (MgCl2) | J.T. Baker | 2444-01 | 用于配制外部记录溶液 |
| 无水D-葡萄糖 | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | 用于配制外部记录溶液 |
| 五水合氯化筒箭毒碱 | Sigma | T2379 | 烟碱型乙酰胆碱受体拮抗剂 |
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| Micro-g实验台 | TMC | 63-533 | 电生理显微镜用气浮台 |
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| c2400 CCD相机 | Hamamatsu | 70826-5 | 用于电生理成像的电荷耦合器件相机 |
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| 移液管 | Fisher Scientific | 13-711-7M | 一次性聚乙烯移液管 |
参考文献
- Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).
- Pratt, K. G. Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole. Curr. Pathobio. Rep. 3 (2), 129-136 (2015).
- Liu....
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重印与许可
