利用磁激活细胞分选策略从兔模型中分离和纯化滑膜液来源的间充质干细胞

Zhaofeng Jia; Yujie Liang; Xingfu Li; Xiao Xu; Jianyi Xiong; Daping Wang; Li Duan

doi:10.3791/57466

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方法文章

利用磁激活细胞分选策略从兔模型中分离和纯化滑膜液来源的间充质干细胞

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DOI：

10.3791/57466

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2018年8月10日

Zhaofeng Jia¹^,²^,³ , Yujie Liang⁴^,⁵ , Xingfu Li²^,³ , Xiao Xu¹^,²^,³ , Jianyi Xiong²^,³ , Daping Wang¹^,²^,³ , Li Duan²^,³

¹Postgraduate institution, Guangzhou Medical University, ²Guangdong Provincial Research Center for Artificial Intelligence and Digital Orthopedic Technology, ³Shenzhen Key Laboratory of Tissue Engineering, Shenzhen Laboratory of Digital Orthopaedic Engineering, Shenzhen Second People's Hospital (The First Hospital Affiliated to Shenzhen University), ⁴Department of Chemistry, Chinese University of Hong Kong, ⁵Shenzhen Kangning Hospital, Shenzhen Mental Health Center

本文内容

摘要

本文介绍了一种简单且经济的实验方案，用于直接从新西兰白兔的滑膜液中分离和纯化间充质干细胞。

摘要

间充质干细胞（MSCs）是细胞治疗的主要细胞来源。来源于关节腔滑液的间充质干细胞有望用于软骨组织工程。滑液来源的间充质干细胞（SF-MSCs）被认为是关节再生的潜在理想候选细胞，其潜在的治疗价值使其成为近期重要的研究课题。来源于新西兰白兔膝关节腔的SF-MSCs可作为优化的转化医学模型，用于评估人类再生医学。通过基于CD90的磁性激活细胞分选（MACS）技术，本方案成功地从该兔模型中分离获得兔滑液间充质干细胞（rbSF-MSCs），并进一步通过诱导其向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化，全面验证了这些细胞的MSC表型。因此，该方法可利用简单的设备和操作流程，应用于细胞生物学研究和组织工程领域。

引言

间充质干细胞（MSCs）被认为在再生医学中具有重要价值，尤其适用于软骨损伤的治疗。MSCs具有较高的扩增能力和多向分化潜能，可分化为软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞以及内脏间质细胞，从而大大拓展了干细胞移植的应用范围¹。MSCs可从骨骼肌、滑膜、骨髓和脂肪组织中分离获得²^,³^,⁴。研究结果还证实了滑膜液中存在MSCs，既往研究已将滑膜液来源的间充质干细胞（SF-MSCs）确认为关节再生的潜在理想候选细胞⁵^,⁶。

然而，针对人类样本的研究和临床前实验面临诸多伦理问题。相比之下，兔子一直是并且继续是最常用于证明间充质干细胞（MSCs）移植能够修复软骨损伤的动物物种。近年来，越来越多的研究人员对兔源间充质干细胞（rbMSCs）进行了研究体外和在体，因为这些细胞在细胞生物学和组织生理学方面与人类间充质干细胞（MSCs）相似。同样，兔间充质干细胞（rbMSCs）能够贴附于塑料表面，并呈现类似于人类MSCs的纺锤形成纤维细胞形态。此外，兔源间充质细胞样本易于获取且操作简便⁷此外，最关键的要点是rbMSCs表达表面标志物（如CD44、CD90和CD105），并保留多向分化潜能，这与国际细胞治疗学会（International Society for Cellular Therapy）定义的间充质干细胞群体鉴定标准一致。⁸^,⁹特别是，在TGF-β1诱导下，滑膜液中的软骨祖细胞能够进行非肥大性软骨形成，因此可作为表型稳定的关节软骨再生的适宜细胞来源¹⁰^,¹¹^,¹².

然而，滑膜间充质干细胞（SF-MSCs）的分离方法与其他组织（如脐带、脂肪组织、外周血和骨髓）存在显著差异。目前，用于SF-MSCs纯化和分选的最常用方法是流式细胞术和基于免疫磁珠的分选技术，尽管流式细胞术需要特定的环境和昂贵的仪器设备¹³。

本文介绍了一种从新西兰白兔中简单且微创采集关节滑液样本的方法。在该操作过程中，兔滑膜液间充质干细胞（rbSF-MSCs）可实现稳定扩增体外然后采用基于CD90阳性磁珠的方法进行分离。最后，该方案展示了如何从获取的细胞来源中获得高纯度和高活力的间充质干细胞。

在本实验方案中，分离得到的兔滑膜间充质干细胞（rbSF-MSCs）通过其形态学特征、特定标志物的表达以及干细胞多能性进行表征。基于流式细胞术的免疫表型分析显示，CD44和CD105呈显著阳性表达，而CD45和CD34则为阴性表达。最后，一项体外 rbSF-MSCs 的检测显示了这些细胞的成骨、成脂和成软骨分化能力。

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方案

所有动物实验均遵循地区伦理委员会指南进行，且所有动物操作均获得深圳大学深圳第二人民医院机构动物护理与使用委员会的批准。

1. 分离并培养 rbSF-MSCs

动物实验前准备
1. 准备骨骼成熟的雌性新西兰白兔用于采集兔滑膜液间充质干细胞（rbSF-MSCs）。在麻醉和关节穿刺操作前一天对兔子进行临床检查。
  注：体格检查应包括体重（2.0 - 2.5 kg）、性别（雌性）、体温、呼吸频率和心率。健康兔的临床参数范围为：呼吸频率30 - 50次/分钟，心率220 - 280次/分钟，体温38 - 39 °C。
2. 在麻醉前禁食6小时。
动物麻醉的准备与操作
1. 使用笼具固定兔子（见材料表），然后通过耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠，剂量为1 mL/kg，以实现全身麻醉。
2. 将兔子置于舒适的仰卧位。
3. 在麻醉过程中监测兔子的呼吸频率、心率和体温。
4. 使用眼科软膏涂抹眼睛，防止麻醉期间角膜干燥。
5. 根据Guedel分类法¹⁴评估麻醉深度。
间充质干细胞分离与培养的准备
1. 为培养rbSF-MSCs，准备500 mL商业培养基（见材料表），添加10%商业补充剂（见材料表）、10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素。
2. 将培养基置于37 °C水浴中预热。
3. 准备500 mL磷酸盐缓冲液（PBS），用于细胞分离和洗涤。
4. 准备100 mL等渗盐水溶液，用于膝关节腔穿刺操作。
从兔膝关节采集关节滑膜液
1. 选择膝关节周围约5 x 5 cm的区域，使用安全型电动剃毛器剃除该区域的兔毛。
2. 依次使用聚维酮碘溶液和75%乙醇对操作部位消毒3次。待区域完全干燥后，覆盖无菌洞巾。
3. 使用无菌皮下注射器（2 mL）向膝关节腔的外侧关节间隙注入1 - 2 mL等渗盐水溶液，活动膝关节3 - 4次，然后在室温下抽出全部滑膜液。
4. 在4小时内通过40 µm尼龙细胞滤网过滤滑膜液，以去除任何碎片。
rbSF-MSCs的培养
1. 将过滤后的液体收集至50 mL离心管中，在室温下以1,500 rpm离心10分钟。
2. 离心后弃去上清液，用PBS洗涤沉淀，加入完全培养基重悬细胞，然后接种至100 mm培养皿中。
3. 将培养皿置于含5% CO₂的湿润环境中，37 °C培养。
4. 48小时后更换新鲜培养基，以去除未贴壁细胞。此后每周换液两次，持续2周，此阶段为第0代（P0）。
  注：应获得约1 × 10⁴个贴壁细胞。滑膜液中每毫升活细胞数约为2 × 10²/mL。
5. 初次接种后14天，培养皿中应形成多个细胞集落。选择直径大于2 mm的集落，并通过在培养皿底部描记其轮廓标记所选集落的位置。
6. 使用细胞刮除器弃去直径< 2 mm的集落。用克隆环和约5 µL的0.25%胰蛋白酶消化所选集落，并将其转移至新的培养皿中，作为第1代（P1）。
术后动物护理
1. 遵循机构标准操作规程进行术后监测及麻醉恢复。
2. 每10分钟监测一次兔子的生命体征，直至其恢复意识。最后将清醒的动物转移回笼中。手术后的兔子在完全恢复前不得与其他动物合笼饲养。
3. 术后每天使用0.1%聚维酮碘消毒穿刺部位两次，持续3天。

2. 兔滑膜间充质干细胞及原代培养物的CD90阳性磁珠激活细胞分选（MACS）

样品制备
1. 当细胞生长至约80%融合度时，吸除培养基，然后向每皿中加入1 - 2 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液。
2. 将培养皿置于37 °C孵育2 - 3分钟，以促进细胞脱落。
3. 待细胞完全脱落之后，加入等体积的完全培养基以中和胰蛋白酶活性。
4. 将细胞悬液通过40 µm细胞筛网过滤，滤液收集至15 mL离心管中，随后在室温下以600 × g离心10分钟，沉淀细胞。
5. 用MACS缓冲液（PBS，pH 7.2，含0.5%牛血清白蛋白和2 mM EDTA）重悬细胞沉淀，并计数细胞数量。
磁性标记
注意：使用磁性激活细胞分选试剂盒（包含分选柱、支架和分离器）对兔滑膜间充质干细胞（rbSF-MSCs）进行分选（参见材料表）。
1. 使用血细胞计数板确定细胞数量。
2. 在4 °C条件下以300 × g离心10分钟，弃去上清液。
3. 每10⁷个总细胞加入80 µL重悬缓冲液。
4. 每10⁷个总细胞加入20 µL偶联单克隆抗兔CD90抗体的磁珠。
5. 将磁珠与细胞充分混匀后，于4 °C避光孵育15分钟。
6. 每10⁷个细胞向管中加入1 mL缓冲液，然后在4 °C以300 × g离心10分钟洗涤细胞。离心后弃去上清液。
7. 每10⁷个细胞用500 µL缓冲液重悬细胞沉淀。
磁性分离
1. 将分选柱有翼一侧朝前插入磁性分离器的磁场中。
2. 用每10⁷个细胞500 µL的缓冲液冲洗磁性分离（MS）分选柱。
3. 将单细胞悬液转移至分选柱中，让未标记的阴性细胞流过分选柱并弃去。
4. 用每10⁷个细胞500 µL的缓冲液洗涤分选柱1 - 2次，弃去流出液。
5. 将分选柱转移至一个15 mL离心管中。
6. 每10⁷个细胞向分选柱中加入1 mL缓冲液，立即推动推杆，将磁性标记的细胞洗脱下来。
7. 使用第二个MS分选柱重复上述步骤，以提高CD90⁺细胞的纯度，从而富集洗脱组分。
8. 将细胞悬液以300 × g离心10分钟，吸除上清液，用完全培养基重悬细胞。
CD90⁺ rbSF-MSCs的培养
1. 磁性激活细胞分选后，将细胞接种于100 mm培养皿中。
2. 将培养皿置于37 °C、含5% CO₂的湿润化细胞培养箱中孵育。
3. 当原代培养细胞达到80 - 90%融合度时（约7 - 10天），使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化贴壁细胞，并按1:2比例传代，获得第2代细胞（P2）。
4. 采用相同方法将细胞传至第3代（P3），可用于后续体外实验。
  注意：经过传代与纯化后，可获得约1 × 10⁷个rbSF-MSCs。

3. rbSF-MSCs 的鉴定

通过流式细胞术对兔骨髓间充质干细胞（rbSF-MSCs）的表面标志物进行鉴定
1. 当P3代MSCs融合度达到80%–90%时，用PBS洗涤细胞，并加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA处理。随后，于37 °C孵育2–3分钟，直至细胞脱落。
2. 使用10 mL PBS收集细胞，转移至15 mL锥形管中，在室温下以300 × g离心5分钟。
3. 弃去上清液。将细胞沉淀重悬于500 µL PBS中，并转移至1.5 mL离心管中。
4. 在4 °C避光孵育FITC偶联和PE偶联抗体（同型对照、FITC-CD34/PE-CD45、FITC-CD105/PE-CD44）1:100稀释液1小时。
5. 将该混合物在室温下以300 × g离心5分钟，并用PBS洗涤细胞两次，每次均以300 × g离心5分钟。弃去上清液。
6. 将细胞重悬于500 µL PBS中，转移至圆底试管（5 mL），并用流式细胞仪进行分析。
  注意：使用配备两个荧光通道（533/30 和 585/40）的流式细胞仪获取数据。针对每种同型荧光，利用同型对照调整相应的激光电压，并设定最低强度，以获得能同时显示峰左侧和右侧边缘的荧光直方图。每样本至少采集 10,000 个事件用于统计分析。
rbSF-MSCs的多向分化
注意：使用第3代rbSF-MSCs进行实验体外多向分化检测
1. 成骨分化
  1. 制备成骨诱导培养基：含50 mM L-抗坏血酸-2-磷酸、10 mM α-甘油磷酸钠和100 nM 地塞米松的DMEM基础培养基（1x）。
  2. 以每孔10个细胞的密度接种细胞³ 细胞/厘米² 在6孔组织培养板中培养细胞，并加入成骨诱导培养基。
  3. 每3天更换一次诱导培养基，持续3周。
  4. 分化完成后，在室温下用 4% 甲醛固定细胞 30 分钟，用 1% 茜素红染色 5 分钟，然后用 PBS 洗涤 3 次¹⁵.
2. 脂肪细胞分化
  1. 配制成脂诱导培养基：含100 mM吲哚美辛、10 mg/mL重组人胰岛素、1 mM地塞米松和0.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的DMEM基础培养基（1x）。
  2. 将P3代rbSF-MSCs在成脂诱导培养基中培养3周。
  3. 3周后，使用油红O染色中性脂质空泡以确认成脂分化。在室温下用4%甲醛溶液固定细胞30分钟，然后用PBS洗涤3次。¹⁶.
3. 软骨形成分化
  1. 制备软骨诱导培养基：含10 ng/mL TGFβ1、1% ITS添加剂、0.35 mM L-脯氨酸、100 nM 地塞米松、50 mM L-抗坏血酸-2-磷酸和1 mM 丙酮酸钠的DMEM基础培养基（1x）。
  2. 使用团块培养法进行软骨诱导。离心5×10⁵细胞。⁵ 在聚丙烯管（15 mL）中以1500 rpm离心10分钟，使第3代rbSF-MSCs形成沉淀。
  3. 将沉淀物在软骨诱导培养基中培养3周。
  4. 每3天更换一次培养基，持续3周。
  5. 经过3周诱导后，将细胞沉淀用石蜡包埋，切成4 mm切片，并在室温下用0.1%甲苯胺蓝染色30分钟¹⁷.
总RNA提取及定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）分析
1. 使用商用RNA提取试剂盒（参见 材料表).
  1. 移去培养皿中的培养基，然后加入1 mL分离试剂。
  2. 通过反复吹打裂解细胞，直至溶液呈均一状态。室温孵育3分钟。
  3. 将细胞裂解液转移至1.5 mL微量离心管中。
  4. 加入100 µL氯仿，手动振荡15次，室温孵育3 min。
  5. 在 4 °C 条件下，以 12,000 × g 离心 15 分钟。将上清液转移至新的 1.5 mL 微量离心管中。
  6. 加入500 µL异丙醇，在室温下沉淀RNA 10分钟。
  7. 在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 10 分钟。RNA 沉淀应可见于管底。
  8. 移去上清液，然后加入 500 µL 75% 乙醇。短暂离心数秒以洗涤 RNA 沉淀。在 4 °C 条件下，于 7,500 × g 离心 5 分钟。
  9. 去除残留的乙醇。
  10. 将RNA沉淀溶解于10 µL的DEPC水中，将离心管置于冰上。
2. 使用DNA合成试剂盒将总RNA逆转录为cDNA（参见 材料表).
  注意：以下所有步骤均需在冰上操作。
  1. 配制反转录主混合液。
  2. 向每管加入25 µL经DNase处理的RNA，使每管含1 µg RNA。
  3. 使用PCR扩增仪将混合物在以下温度孵育：26 °C孵育10分钟（使随机六聚体退火），42 °C孵育45分钟（逆转录），75 °C孵育10分钟（灭活逆转录酶）。
  4. 立即通过定量实时 PCR 分析所得 cDNA，或将其保存于 -20 °C。
3. 使用定量实时PCR系统进行基因表达分析。
  1. 使用qRT-PCR预混液（参见 材料表) 进行 PCR。GAPDH、Runx2、Agg 和 PPARγ 的 PCR 引物序列如下所示：表1.
  2. 使用2⁻ΔΔCt法计算基因表达量⁻^ΔΔCT 方法
  3. 使用标准统计软件进行统计分析。采用独立样本 t 检验比较组间均值。

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结果

兔骨髓间充质干细胞的分离、纯化与培养
本方案采用磁珠分选技术（MACS），根据间充质干细胞表面标志物CD90的表达情况分离兔滑膜间充质干细胞（rbSF-MSCs）。兔滑膜间充质干细胞的分离、纯化及鉴定流程示意图以及体外培养方案如图所示图1.

使用 CD90 进行磁性激活细胞分选（MACS）后的细胞形态：
首先，进行 MACS 时，用 CD90 磁珠对间充质干细胞（MSCs）进行免疫标记。离心后，将最多 10⁷ 个细胞重悬于 80 µL 预冷的分选缓冲液中，然后加入 20 µL CD90 磁珠，涡旋混匀，并在 4 °C 下孵育 15 分钟。随后，用 1 mL 分选缓冲液洗涤细胞，并将细胞重悬于 500 µL 分选缓冲液中。在进行磁性分选前，重复一次洗涤步骤。这一关键步...

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讨论

滑膜液中存在间充质干细胞（MSCs），为基于细胞的治疗提供了另一种选择。既往研究表明，损伤部位滑膜液中的间充质干细胞含量更高，这可能与损伤后的时期呈正相关⁵。滑膜液中的MSCs可能有助于促进损伤后的自发性组织修复¹⁸^,¹⁹。关于滑膜液间充质干细胞（SF-MSCs）的临床应用，文献报道较少，主要原因是SF-MSCs在关节内的作用机制尚未明确²⁰。Jones et al.²¹ 报道，在骨关节炎（OA）早期，膝关节内人源滑膜液间充质干细胞（hSF-MSCs）的数量显著增加7倍。他们认为，增多的SF-MSCs可能有助于维持关节的生理稳态。

理想的动物模型是利用再生医学和转化医学开发治疗方法过程中不可或缺的工具。尽管人类与兔子之间存在明显差异，兔子仍被广泛用作组织再生研究的动物模型^...

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披露

作者声明不存在任何竞争性财务利益。

致谢

本研究获得以下基金资助：国家自然科学基金（编号 81572198；编号 81772394）；深圳大学高水平医学学科建设基金（编号 2016031638）；中国广东省医学科研基金（编号 A2016314）；深圳市科技计划项目（编号 JCYJ20170306092215436；编号 JCYJ20170412150609690；编号 JCYJ20170413161800287；编号 SGLH20161209105517753；编号 JCYJ20160301111338144）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
试剂
MesenGro	StemRD	MGro-500 1703	使用前在37 °C水浴中预热
MesenGro Supplement	StemRD	MGro-500 M1512	间充质干细胞培养基组分
DMEM basic	Gibco Inc.	C11995500BT	间充质干细胞分化培养基
等渗盐溶液	Litai, China	5217080305	关节腔穿刺术试剂
磷酸盐缓冲液（PBS）	HyClone Inc.	SH30256.01B	PBS，不含Ca²⁺/Mg²⁺
胎牛血清（FBS）	Gibco Inc.	10099-141	间充质干细胞培养基组分
聚维酮碘溶液	Guangdong, China	150605	消毒剂
75%乙醇	Lircon, china	170917	消毒剂
0.25%胰蛋白酶/EDTA	Gibco Inc.	25200-056	细胞解离试剂
1%青霉素-链霉素	Gibco Inc.	15140-122	间充质干细胞培养基组分
MACS Running Buffer	MiltenyiBiotec	5160112089	含磷酸盐缓冲液（PBS）、0.5%牛血清白蛋白（BSA）和2 mM EDTA
CD90抗体偶联微珠	MiltenyiBiotec	5160801456	用于磁性激活细胞分选
丙酮酸钠	Sigma-Aldrich	P2256	间充质干细胞软骨分化培养基组分
地塞米松	Sigma-Aldrich	D1756	间充质干细胞成骨分化培养基组分
ITS	BD	354352	1%，间充质干细胞软骨分化培养基组分
L-脯氨酸	Sigma-Aldrich	P5607	0.35 mM，间充质干细胞软骨分化培养基组分
L-抗坏血酸-2-磷酸	Sigma-Aldrich	A8960	50 mM，间充质干细胞软骨分化培养基组分
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤	Sigma-Aldrich	I5879	0.5 mM，脂肪分化培养基组分
吲哚美辛	Sigma-Aldrich	I7378	100 mM，脂肪分化培养基组分
TGFβ1	Peprotech	100-21	10 ng/mL，间充质干细胞软骨分化培养基组分
α-甘油磷酸	Sigma-Aldrich	G6751	间充质干细胞成骨分化培养基组分
CD34多克隆抗体，FITC标记	Bioss	bs-0646R-FITC	造血干细胞标志物
兔抗小鼠CD44	Bio-Rad	MCA806GA	Thy-1膜糖蛋白（间充质干细胞标志物）
CD45（单克隆抗体）	Bio-Rad	MCA808GA	造血干细胞标志物
CD105抗体	Genetex	GTX11415	间充质干细胞标志物
异丙醇	Sigma-Aldrich	I9030	沉淀RNA提取中的有机相
三氯甲烷	Wenge, China	61553	提取总RNA
Trizol	Invitrogen	15596-018	分离总RNA
SYBR Green预混液	Takara Bio, Japan	RR420A	PCR检测
cDNA合成试剂盒	Takara Bio, Japan	RR047A	逆转录为互补DNA
茜素红	Sigma-Aldrich	A5533	钙化合物染色
甲苯胺蓝	Sigma-Aldrich	89640	软骨组织染色
油红O溶液	Sigma-Aldrich	O1391L	脂质空泡染色
设备
MiniMACS分离器	MiltenyiBiotec	130-042-102	用于磁性激活细胞分选
MultiStand	MiltenyiBiotec	130-042-303	用于磁性激活细胞分选
MS柱	MiltenyiBiotec	130-042-201	用于磁性激活细胞分选
细胞筛	FALCON Inc.	352340	40 μm尼龙
血细胞计数板	ISOLAB Inc.	075.03.001	细胞计数
Falcon 100 mm培养皿	Corning	353003	细胞培养皿
微量离心管	Axygen	MCT-150-C	RNA提取和PCR
离心管	Sigma-Aldrich	91050	γ射线灭菌
高速离心机	Eppendorf	5804R	离心细胞
二氧化碳细胞培养箱	Thermo scientific	3111	细胞培养
实时荧光定量PCR仪	Life Tech	QuantStudio	实时定量聚合酶链式反应
流式细胞仪	BD Biosciences	342975	细胞分析仪
移液器	Eppendorf	O25456F	液体转移
克隆环	Sigma-Aldrich	C3983-50EA	分离并挑选单个细胞克隆
无菌皮下注射器	Double-Dove, China	131010	关节腔穿刺术操作
兔笼	Zhike, China	ZC-TGD	固定兔子

参考文献

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利用磁激活细胞分选策略从兔模型中分离和纯化滑膜液来源的间充质干细胞

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