利用磁激活细胞分选策略从兔模型中分离和纯化滑膜液来源的间充质干细胞

摘要

本文介绍了一种简单且经济的实验方案，用于直接从新西兰白兔的滑膜液中分离和纯化间充质干细胞。

摘要

间充质干细胞（MSCs）是细胞治疗的主要细胞来源。来源于关节腔滑液的间充质干细胞有望用于软骨组织工程。滑液来源的间充质干细胞（SF-MSCs）被认为是关节再生的潜在理想候选细胞，其潜在的治疗价值使其成为近期重要的研究课题。来源于新西兰白兔膝关节腔的SF-MSCs可作为优化的转化医学模型，用于评估人类再生医学。通过基于CD90的磁性激活细胞分选（MACS）技术，本方案成功地从该兔模型中分离获得兔滑液间充质干细胞（rbSF-MSCs），并进一步通过诱导其向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化，全面验证了这些细胞的MSC表型。因此，该方法可利用简单的设备和操作流程，应用于细胞生物学研究和组织工程领域。

引言

间充质干细胞（MSCs）被认为在再生医学中具有重要价值，尤其适用于软骨损伤的治疗。MSCs具有较高的扩增能力和多向分化潜能，可分化为软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞以及内脏间质细胞，从而大大拓展了干细胞移植的应用范围¹。MSCs可从骨骼肌、滑膜、骨髓和脂肪组织中分离获得^2,3,4。研究结果还证实了滑膜液中存在MSCs，既往研究已将滑膜液来源的间充质干细胞（SF-MSCs）确认为关节再生的潜在理想候选细胞^5,6。

然而，针对人类样本的研究和临床前实验面临诸多伦理问题。相比之下，兔子一直是并且继续是最常用于证明间充质干细胞（MSCs）移植能够修复软骨损伤的动物物种。近年来，越来越多的研究人员对兔源间充质干细胞（rbMSCs）进行了研究 体外 和 在体，因为这些细胞在细胞生物学和组织生理学方面与人类间充质干细胞（MSCs）相似。同样，兔间充质干细胞（rbMSCs）能够贴附于塑料表面，并呈现类似于人类MSCs的纺锤形成纤维细胞形态。此外，兔源间充质细胞样本易于获取且操作简便

方案

所有动物实验均遵循地区伦理委员会指南进行，且所有动物操作均获得深圳大学深圳第二人民医院机构动物护理与使用委员会的批准。

1. 分离并培养 rbSF-MSCs

1. 动物实验前准备
   1. 准备骨骼成熟的雌性新西兰白兔用于采集兔滑膜液间充质干细胞（rbSF-MSCs）。在麻醉和关节穿刺操作前一天对兔子进行临床检查。
      注：体格检查应包括体重（2.0 - 2.5 kg）、性别（雌性）、体温、呼吸频率和心率。健康兔的临床参数范围为：呼吸频率30 - 50次/分钟，心率220 - 280次/分钟，体温38 - 39 °C。
   2. 在麻醉前禁食6小时。
2. 动物麻醉的准备与操作
   1. 使用笼具固定兔子（见材料表），然后通过耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠，剂量为1 mL/kg，以实现全身麻醉。
   2. 将兔子置于舒适的仰卧位。
   3. 在麻醉过程中监测兔子的呼吸频率、心率和体温。
   4. 使用眼科软膏涂抹眼睛，防止麻醉期间角膜干燥。
   5. 根据Guedel分类法¹⁴评估麻醉深度。
3. 间充质干细胞分离与培....

结果

兔骨髓间充质干细胞的分离、纯化与培养
本方案采用磁珠分选技术（MACS），根据间充质干细胞表面标志物CD90的表达情况分离兔滑膜间充质干细胞（rbSF-MSCs）。兔滑膜间充质干细胞的分离、纯化及鉴定流程示意图以及 体外 培养方案如图所示 图1.

使用 CD90 进行磁性激活细胞分选（MACS）后的细胞形态：
首先，进行 MACS 时，用 CD90 磁珠对间充质干细胞（MSCs）进行免疫标记。离心后，将最多 10⁷ 个细胞重悬于 80 µL 预冷的分选缓冲液中，然后加入 20 µL CD90 磁珠，涡旋混匀，并在 4 °C 下孵育 15 分钟。随后，用 1 mL 分选缓冲液洗涤细胞，并将细胞重悬于 500 µL 分选缓冲液中。在进行磁性分选前，重复一次洗涤步骤。这一关键步.......

讨论

滑膜液中存在间充质干细胞（MSCs），为基于细胞的治疗提供了另一种选择。既往研究表明，损伤部位滑膜液中的间充质干细胞含量更高，这可能与损伤后的时期呈正相关⁵。滑膜液中的MSCs可能有助于促进损伤后的自发性组织修复^18,19。关于滑膜液间充质干细胞（SF-MSCs）的临床应用，文献报道较少，主要原因是SF-MSCs在关节内的作用机制尚未明确²⁰。Jones et al.²¹ 报道，在骨关节炎（OA）早期，膝关节内人源滑膜液间充质干细胞（hSF-MSCs）的数量显著增加7倍。他们认为，增多的SF-MSCs可能有助于维持关节的生理稳态。

理想的动物模型是利用再生医学和转化医学开发治疗方法过程中不可或缺的工具。尽管人类与兔子之间存在明显差异，兔子仍被广泛用作组织再生研究的动物模型^.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
MesenGro	StemRD	MGro-500 1703	使用前在37 °C水浴中预热
MesenGro Supplement	StemRD	MGro-500 M1512	间充质干细胞培养基组分
DMEM basic	Gibco Inc.	C11995500BT	间充质干细胞分化培养基
等渗盐溶液	Litai, China	5217080305	关节腔穿刺术试剂
磷酸盐缓冲液（PBS）	HyClone Inc.	SH30256.01B	PBS，不含Ca2+/Mg2+
胎牛血清（FBS）	Gibco Inc.	10099-141	间充质干细胞培养基组分
聚维酮碘溶液	Guangdong, China	150605	消毒剂
75%乙醇	Lircon, china	170917	消毒剂
0.25%胰蛋白酶/EDTA	Gibco Inc.	25200-056	细胞解离试剂
1%青霉素-链霉素	Gibco Inc.	15140-122	间充质干细胞培养基组分
MACS Running Buffer	MiltenyiBiotec	5160112089	含磷酸盐缓冲液（PBS）、0.5%牛血清白蛋白（BSA）和2 mM EDTA
CD90抗体偶联微珠	MiltenyiBiotec	5160801456	用于磁性激活细胞分选
丙酮酸钠	Sigma-Aldrich	P2256	间充质干细胞软骨分化培养基组分
地塞米松	Sigma-Aldrich	D1756	间充质干细胞成骨分化培养基组分
ITS	BD	354352	1%，间充质干细胞软骨分化培养基组分
L-脯氨酸	Sigma-Aldrich	P5607	0.35 mM，间充质干细胞软骨分化培养基组分
L-抗坏血酸-2-磷酸	Sigma-Aldrich	A8960	50 mM，间充质干细胞软骨分化培养基组分
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤	Sigma-Aldrich	I5879	0.5 mM，脂肪分化培养基组分
吲哚美辛	Sigma-Aldrich	I7378	100 mM，脂肪分化培养基组分
TGFβ1	Peprotech	100-21	10 ng/mL，间充质干细胞软骨分化培养基组分
α-甘油磷酸	Sigma-Aldrich	G6751	间充质干细胞成骨分化培养基组分
CD34多克隆抗体，FITC标记	Bioss	bs-0646R-FITC	造血干细胞标志物
兔抗小鼠CD44	Bio-Rad	MCA806GA	Thy-1膜糖蛋白（间充质干细胞标志物）
CD45（单克隆抗体）	Bio-Rad	MCA808GA	造血干细胞标志物
CD105抗体	Genetex	GTX11415	间充质干细胞标志物
异丙醇	Sigma-Aldrich	I9030	沉淀RNA提取中的有机相
三氯甲烷	Wenge, China	61553	提取总RNA
Trizol	Invitrogen	15596-018	分离总RNA
SYBR Green预混液	Takara Bio, Japan	RR420A	PCR检测
cDNA合成试剂盒	Takara Bio, Japan	RR047A	逆转录为互补DNA
茜素红	Sigma-Aldrich	A5533	钙化合物染色
甲苯胺蓝	Sigma-Aldrich	89640	软骨组织染色
油红O溶液	Sigma-Aldrich	O1391L	脂质空泡染色
设备
MiniMACS分离器	MiltenyiBiotec	130-042-102	用于磁性激活细胞分选
MultiStand	MiltenyiBiotec	130-042-303	用于磁性激活细胞分选
MS柱	MiltenyiBiotec	130-042-201	用于磁性激活细胞分选
细胞筛	FALCON Inc.	352340	40 μm尼龙
血细胞计数板	ISOLAB Inc.	075.03.001	细胞计数
Falcon 100 mm培养皿	Corning	353003	细胞培养皿
微量离心管	Axygen	MCT-150-C	RNA提取和PCR
离心管	Sigma-Aldrich	91050	γ射线灭菌
高速离心机	Eppendorf	5804R	离心细胞
二氧化碳细胞培养箱	Thermo scientific	3111	细胞培养
实时荧光定量PCR仪	Life Tech	QuantStudio	实时定量聚合酶链式反应
流式细胞仪	BD Biosciences	342975	细胞分析仪
移液器	Eppendorf	O25456F	液体转移
克隆环	Sigma-Aldrich	C3983-50EA	分离并挑选单个细胞克隆
无菌皮下注射器	Double-Dove, China	131010	关节腔穿刺术操作
兔笼	Zhike, China	ZC-TGD	固定兔子