本文介绍了一种从血浆和血清中纯化外泌体的方案，可显著减少非外泌体血液蛋白的共纯化。优化后的方案包括超滤、蛋白酶处理和尺寸排阻色谱。外泌体的高效纯化有助于后续分析，包括对外泌体更准确的定量以及蛋白质组学表征。
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本文内容
摘要
摘要
外泌体是一类由所有细胞类型释放的纳米级囊泡，可从任何体液中分离获得。外泌体的内容物（包括蛋白质和RNA）具有其来源细胞的独特特征，可作为疾病指示标志物。目前常用的多种富集方法（如超速离心法）所获得的外泌体通常含有可溶性蛋白质污染物。我们发现，血液中最丰富的蛋白质常常与外泌体共同纯化，干扰下游的蛋白质组学研究，阻碍低丰度生物标志物候选分子的鉴定。另一个令人关注的问题是，由于非外泌体来源蛋白质水平不一致，导致外泌体蛋白质定量结果不可重复。本文详述的实验方案旨在去除与外泌体共同纯化的非外泌体蛋白质，从而提高外泌体纯化的严谨性。本研究使用五名供体配对的血浆和血清样本，比较了五种方法。通过纳米颗粒追踪分析和微定量双辛可宁酸蛋白测定法分析发现，结合超滤和尺寸排阻色谱的联合方案可实现最佳的囊泡富集效果和可溶性蛋白质去除效果。采用蛋白质印迹法验证证实，预期存在的高丰度血液蛋白（包括白蛋白和载脂蛋白）已被有效去除。
引言
外泌体是一类由人体几乎所有细胞释放的纳米级囊泡（大小范围为30 nm至150 nm），在细胞间通讯过程中发挥重要作用1,2。有趣的是，外泌体的组成会因来源细胞类型以及个体健康状况的不同而发生变化3,4,5。此外，外泌体可从多种生物液体中分离获得，例如唾液、尿液和血液2。由于这些特性，外泌体被认为是疾病生物标志物的良好来源。然而，目前尚无标准化的外泌体分离方法。一些实验室将多步离心法（最终在密度梯度条件下以100,000 × g高速离心）视为外泌体分离的金标准方法。但近期研究表明，超速离心会导致外泌体与可溶性蛋白及其他外泌体发生聚集，同时影响外泌体的完整性，这两者均可能妨碍后续应用6,7。其他常见的外泌体分离方法包括但不限于：基于市售聚乙二醇（PEG）试剂的沉淀法、离心超滤法以及尺寸排阻色谱法（SEC）。使用聚乙二醇（PEG）聚合物的商业试剂通过诱导外泌体沉淀并形成沉淀物来富集外泌体。该方法的局限性在于最终产物中可能残留PEG聚合物，并含有大量非外泌体来源的可溶性蛋白。....
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方案
根据科罗拉多州立大学机构审查委员会（IRB）的初步审查，本研究被确定不属于人类受试者研究，因为所有人类样本均来自Bioreclamation IVT生物样本库的去鉴定样本，并且这些样本是在经IRB批准的方案下采集的。
1. 通过沉淀较大囊泡和细胞碎片制备粗样品（血浆或血清）
注意： 安全注意事项：血浆、血清及其他生物液体属于生物危害性材料，必须特别小心处理，并佩戴基本的个人防护装备，包括手套和实验服。强烈建议在生物安全柜中处理生物样本；若无条件提供，则建议佩戴眼部防护装置。
- 将血清或血浆样品置于4 °C冰箱中，在不振荡的条件下过夜平衡（样品可来自-20 °C或-80 °C保存状态）。
- 使用1,000 µL移液器，将250 µL样品分装至微量离心管中。
- 在4 °C条件下，以18,000 × g离心30分钟。
- 使用200 µL移液器，吸取200 µL澄清上清液并转移至新的微量离心管中。转移过程中避免接触沉淀物，并弃去沉淀物。
- 按照生产商说明书，采用二辛可宁酸（BCA）法测定样品的蛋白含量。进行测定时，用1×磷酸盐缓冲液（PBS）将样品稀释1:50。每个样品设两个复孔。
注意：除非另有说明，本实验方案中均使用1× PBS。通常情况下，18,00....
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结果
以下数据来自五名健康献血者的配对血浆和血清样本。为确定每个处理步骤的影响，对本方案进行了五种不同变体的操作，并比较了外泌体回收率及非外泌体蛋白的去除效果。试验的方法包括：1）700 kDa 尺寸排阻层析（SEC）+ 3 kDa 超滤；2）100 kDa 超滤；3）蛋白酶K处理 + 100 kDa 超滤；4）700 kDa 尺寸排阻层析 + 100 kDa 超滤；以及 5）蛋白酶K处理 + 100 kDa 超滤 + 700 kDa 尺寸排阻层析 + 3 kDa 超滤。
总体而言，使用 SEC 700 kDa 方法（1、4 和 5）在两种样本类型（血清和血浆）中每微克蛋白所产生的囊泡数量均显著更高（图 1A-B）。然而，方法 5 在血浆中每微克蛋白所产生的囊泡数量显著高于血清（图 1C）。相反，采用基于 .......
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讨论
一种优化的血液外泌体纯化与得率提升方法将增强准确挖掘细胞外囊泡作为多种疾病生物标志物来源的能力。目前用于分离外泌体的标准方法，特别是超速离心法和沉淀法，存在若干缺点，包括外泌体聚集以及可溶性蛋白质的共沉淀7,17,18或者，使用SEC在外泌体分离方面已显示出显著改进，可保护外泌体免于聚集，并提高去除常见非外泌体污染物蛋白的效果9,11,18,19。然而，载脂蛋白10，如果仅使用尺寸排阻色谱法（SEC），较大的囊泡及蛋白质聚集体（包括白蛋白）常会与外泌体共同被分离出来。本方案中两个关键步骤有助于克服上述后两种局限性。首先，将血浆或血清样本在18,000 .......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到了科罗拉多州立大学（CSU）内部资金（资助对象：KMD）、美国典型培养物保藏中心（ATCC）合同 #2016-0550-0002（美国国家过敏与传染病研究所 NIAID HHSN272201600013C 的分包合同）以及比尔和梅琳达·盖茨基金会（OPP1039688）（资助对象：KMD/NKG）的支持。我们感谢科罗拉多州立大学国家科学基金会本科生科研实习（REU）暑期项目提供的额外支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 纳米颗粒追踪分析仪 | Malvern | NS300 | |
| 台式微量离心机 | Thermo | Legend Mico21 | |
| 台式离心机 | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| 水浴锅 | Benchmark | B2000-4 | |
| 酶标仪 | BIOTEK | Epoch | |
| Pierce BCA 蛋白检测试剂盒 | THERMO | 23227 | |
| 微量 BCA 蛋白检测试剂盒 | THERMO | 23235 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Corning | 21-040-CV | |
| 96 孔板 | Corning | 15705-066 | |
| Amicon Ultra-0.5 离心过滤单元（含 Ultracel-100 膜） | EMD-Millipore | UFC510096 | |
| Amicon Ultra-4 离心过滤单元 | EMD-Millipore | UFC800324 | |
| Capto Core 700 | GE Healthcare | 17548103 | |
| Poly-Prep 层析柱 | BIORAD | 7311550 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris 蛋白凝胶 | THERMO | NP0323BOX | |
| 硝酸纤维素膜，卷状，0.2 µm | BIORAD | 1620112 | |
| 蛋白酶 K， Tritirachium album | EMD-Millipore | 539480 | |
| SimplyBlue SafeStain | THERMO | LC6065 | |
| SIGMAFAST BCIP/NBT | Millipore-SIGMA | B5655 | |
| 4-氯-1-萘酚 | Millipore-SIGMA | C6788 | |
| 抗 CD63 抗体（兔抗人）及羊抗兔 HRP 二抗 | SYSTEM BIOSCIENCES | EXOAB-CD63A-1 | 一抗和二抗 |
| ALB 抗体 (F-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-271605 | 一抗 |
| apoB 抗体 (C1.4) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-13538 | 一抗 |
| apoA-I 抗体 (B-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-376818 | 一抗 |
参考文献
- Stoorvogel, W., Kleijmeer, M. J., Geuze, H. J., Raposo, G. The biogenesis and functions of exosomes. Traffic. 3 (5), 321-330 (2002).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
- Schorey, J. S., Ha....
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重印与许可
