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方法文章

评估蛋白质聚集对酵母细胞氧化应激的影响

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DOI：

10.3791/57470

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2018年6月23日

 ,  , 
1Institut de Biotecnologia i Biomedicina and Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, Universitat Autònoma de Barcelona

本文内容

摘要

蛋白质聚集会引发细胞氧化应激。本方案描述了一种利用流式细胞术监测淀粉样蛋白及其相关氧化应激状态的细胞内状态的方法。该方法用于研究可溶性及易聚集型淀粉样β肽的行为特征。

摘要

蛋白质错误折叠并聚集形成淀粉样构象，已被证实与多种神经退行性疾病的发病及进展相关。然而，目前关于不溶性蛋白质聚集体如何发挥其毒性作用的机制仍知之甚少。 体内简单的原核和真核模式生物，例如细菌和酵母，已极大地促进了我们对细胞内淀粉样蛋白形成、聚集体传播及其毒性的机制的理解。本方案描述了利用酵母作为模型系统，解析蛋白质聚集体形成与其对细胞氧化应激影响之间关系的方法。该方法结合流式细胞术（FC），同时检测淀粉样蛋白在细胞内的可溶性/聚集状态，并量化其表达所导致的细胞氧化损伤。该方法简便、快速且具有定量性。研究通过将一系列淀粉样β肽变异体引起的细胞氧化应激与其各自的固有聚集倾向进行关联分析，展示了该技术的应用。

引言

蛋白质稳态是细胞适应性和衰老过程的基本决定因素。在细胞中，蛋白质稳态由复杂的蛋白质质量控制网络维持，这些网络旨在通过分子伴侣正确地重折叠错误折叠的蛋白质构象体，和/或通过多种高度保守的机制对其进行靶向降解1,2,3,4,5。大量研究表明，多种人类疾病的发生和发展与蛋白质稳态失衡密切相关，导致蛋白质错误折叠和聚集。例如，蛋白质沉积物的存在被认为是许多神经退行性疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病6,7,8）、朊病毒病以及非退行性淀粉样变性9的病理标志。有研究提出，在聚集反应中早期形成的寡聚体和原纤维结构是细胞毒性的主要诱因，它们可在拥挤的细胞环境中与其他蛋白质发生异常相互作用10。此外，蛋白质包涵体（PI）可在细胞间传播，从而扩散其毒性效应11,12。因此，PI的形成可能实际上是一种解毒机制，将有害的聚集物限制在细胞内的特定区域，使其能够在不产生显著副作用的情况下被处理或积累13,14。

标准的体外生化方法已为聚集反应中不同物种的组成及其特性提供了重要见解15,16。然而，这些检测所使用的条件显然不同于细胞内的实际情况，因而对其生理相关性提出了质疑。由于真核生物中蛋白质质量控制、自噬以及细胞氧化还原状态调控等细胞通路具有显著的保守性17,18，在真核生物之间广泛存在19,20,21,22,23，芽殖酵母Saccharomyces cerevisiae（S. cerevisiae）已成为研究蛋白质聚集的分子决定因素及其在生物学相关环境中所导致的细胞毒性影响的一个理想且简单的细胞模型24,25,26。

蛋白质聚集倾向是固有地编码于其一级序列中的特性。因此，通过识别和评估多肽链中促进聚集区域的活性，可以预测类淀粉样结构的形成。27然而，尽管生物信息学算法在预测方面取得了成功 体外 蛋白质序列的聚集特性，但距离预测这些倾向如何转化为实际行为仍有很大差距 体内 细胞毒性影响。系统性地研究特定蛋白质的聚集状态与其相关细胞损伤之间的关联，可能有助于克服这一计算局限性。本研究利用一组仅单个残基不同的淀粉样蛋白-β肽Aβ42变体，其聚集倾向呈连续分布，深入探讨了这一关联。 体内28特别是，本文描述了一种基于流式细胞术（FC）的方法，用于鉴定酵母细胞中由易聚集蛋白引发氧化损伤的构象物种。该方法具有多种优势，如操作简便、通量高以及可进行精确的定量测量。该方法使得确认PI在抵御氧化应激中发挥保护作用成为可能。

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方案

1. S. cerevisiae 培养与蛋白表达

注意：由于 Aβ42 肽段第19位残基（Phe19）发生突变，Aβ 变体表现出不同的相对聚集倾向（图 1A）。这些肽变体被标记上绿色荧光蛋白（GFP），用作聚集报告分子（图 1）29。

  1. 将编码20种Aβ42-GFP变异体的质粒转化至具有BY4741亲本背景（MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0）的酵母细胞中30。每种质粒编码一种通过GSSGSSG连接子与GFP融合的Aβ42突变体。所用质粒为pESC(-URA)，并包含可筛选标记URA329。
    1. 配制不含尿嘧啶的合成完全培养基（SC-URA），成分如下：1.9 g/L 无尿嘧啶酵母氮源基础培养基、5 g/L 硫酸铵，以及900 mL ddH2O与100 mL 20% (w/v) 葡萄糖混合液。
    2. 取一个转化酵母菌落接种于20 mL含2%葡萄糖的SC-URA培养基中，在30 °C、210 rpm振荡条件下过夜培养。
  2. 次日，将100 µL过夜培养物接种至5 mL新鲜SC-URA培养基中，培养新的酵母细胞。
  3. 当OD590达到0.5时，以3,000 x g离心4分钟，弃去上清液，并将菌体重悬于等体积含2%棉子糖的新鲜SC-URA培养基中。
  4. 在30 °C、210 rpm振荡条件下孵育30分钟。随后以3,000 x g离心4分钟，弃去上清液，再将细胞重悬于含2%半乳糖的新鲜SC-URA培养基中，以诱导重组蛋白表达。
  5. 在含2%半乳糖的SC-URA培养基中诱导表达16小时后，取1 mL诱导后的细胞转移至无菌微量离心管中，以3,000 x g离心4分钟收集细胞。
    注：最显著的差异出现在诱导16小时后。可通过荧光显微镜观察表达Aβ42-GFP变异体的诱导酵母细胞，以确定重组蛋白在细胞内的分布情况（图2B）。

2. 细胞染色

注意：在流式细胞分析中，需要使用新鲜的未诱导细胞作为阴性对照，以确定荧光阈值。

  1. 取诱导16小时的酵母细胞，测定其在590 nm处的光密度（OD590). 用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）稀释至 OD590 0.1。
    1. 按如下方法配制1×磷酸盐缓冲液：加入8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4，以及 0.24 g KH2PO4 至800 mL ddH₂O2O. 将溶液定容至 1 L ddH₂O2O，用 HCl 调节 pH 至 7.4 后。将缓冲液通过一个 0.2 µm 滤膜
  2. 将表达细胞悬液转移至适当标记的试管（12 × 75 mm 圆底聚苯乙烯管）中，并避光保存。确保其与未诱导和未染色的细胞一同准备好用于流式细胞仪分析。
  3. 加入氧化应激探针（例如， CellROX Deep Red）加入各样品中，终浓度为 5 µM 并在37°C下孵育细胞 30 °C 在避光条件下孵育30分钟。
  4. 孵育后，用1×PBS洗涤细胞3次，并用相同体积的缓冲液重悬，随后通过流式细胞术进行分析。

3. 流式细胞术分析

注意：使用配备合适激光器和滤光片的流式细胞仪（FC）装置，以检测 GFP 和氧化应激探针的荧光信号。可采用配备 488 nm 蓝激光用于检测 GFP、635 nm 红激光用于检测氧化应激探针荧光的流式细胞仪。GFP 和氧化应激探针的发射荧光分别通过 530/30 nm 带通滤光片和 660/20 带通滤光片进行采集（表 1）。

  1. 点击 打开新工作表面板 并创建以下采集的散点图。
    1. 选择 散点图工具 从工具栏中选择并创建一个以侧向散射-面积（SSC-A）为纵坐标的图 与 前向散射-面积（FSC-A）以线性刻度显示在 x 轴上。
    2. 点击 散点图工具 从工具栏中选择并创建一个散点图，x 轴为 FL1-Area（FITC） 与y轴采用对数尺度表示FL3-面积（APC）。
  2. 点击 仪器设置 图标。单击 补偿 调节并设置所有补偿水平。点击 采集 标签并选择总共记录 20,000 个事件。
  3. 点击 流速 切换流速的图标 低.
  4. 点击 获取 切换至开始运行未诱导、未染色的细胞，并调节电压 仪器设置 前向散射和侧向散射的分布，直至细胞群位于中间左侧象限。
    1. 点击 多边形 使用图标在细胞群周围设置一个区域 R1，排除细胞碎片，并将此设门的细胞群 P1 = R1 用于所有荧光散点图和直方图表示图3).
  5. 为调整荧光信号的光电倍增管电压，使用未染色细胞在FL1-FL3散点图中运行，并调节增益 仪器设置 标签，直至细胞分布在左下象限。
  6. 将样本更换为诱导后的细胞，以检测GFP荧光。在 仪器设置 选项卡，设置 FSC-A 的增益 与 当细胞群分布在右下象限时，使用FL1（FITC）定义阳性细胞群，并设置门控（门P2）。
  7. 将样本更换为未诱导染色的细胞，通过FSC-A上的荧光显示氧化应激 与 FL3（APC）散点图。调节增益，使细胞群分布于左上象限。在P3中圈选阳性细胞群。
  8. 制作两个直方图 直方图 用于表示细胞荧光的图标。为表示荧光强度，确保代表GFP荧光的FL1（FITC）位于x轴，代表荧光的FL3（APC）位于y轴，并分别对P2和P3群体应用对数刻度。
    注意：直方图叠加是展示表达不同 Aβ 变体的细胞之间荧光谱型差异的有效方法。

4. 重组蛋白免疫检测

  1. 为测定蛋白质表达水平，将诱导培养16小时的酵母菌液于4,000 x g离心6分钟收集菌体，并将细胞沉淀保存于-80 °C.
    1. 将表达重组蛋白16小时的收集细胞在PBS中重悬。准备 200 µL 每种 Aβ42-GFP 突变体的细胞悬液调整至 OD590 20分之
  2. 用于总蛋白组分分析，收集 100 µL 以14,000 × g离心20分钟收集各突变株细胞，然后将细胞沉淀重悬于相同体积的酵母裂解缓冲液Y-PER（50 mM Tris-HCl pH 8.0，1% DMSO，200 mM NaCl，1 mM EDTA，含10 mg/mL SB3-14（肉豆蔻酰磺基甜菜碱）并补充1 mM苯甲基磺酰氟（PMSF））中。
    1. 在室温下轻轻振荡孵育样品 20 分钟。
  3. 使用Bradford法测定蛋白提取物浓度。最多上样 5 µg 将各样品的蛋白提取物在15%丙烯酰胺SDS-PAGE电泳凝胶上分离，然后在100 V电压下电转印60分钟至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。
    1. 将100 mg考马斯亮蓝G-250溶解于50 mL 95%乙醇中，配制布拉德福试剂，并加入100 mL 85%（w/v）磷酸。待染料完全溶解后，用ddH₂O稀释该混合液。2定容至1 L，使用前用纤维素滤纸过滤。
      注意：Bradford 试剂应为浅棕色。
    2. 制备浓度范围为 5 - 50 μg/mL 的牛血清白蛋白（BSA）标准品 100 µg 蛋白质的 1,000 µL Bradford 试剂
    3. 加入 1 - 10 µL 将蛋白提取物加入1 mL Bradford试剂中，室温孵育5分钟。
    4. 测定标准品和蛋白质提取样品在 OD 的吸光度595.
    5. 对于分析，使用标准品测得的吸光度值绘制图表 与. µg 根据标准曲线，结合体积和稀释倍数（如有），从蛋白含量确定原始样品的浓度。
  4. 用1×Tris缓冲盐水（TBS）含0.1% Tween 20（TTBS）冲洗膜，然后使用含5%（w/v）脱脂奶粉的1×TTBS进行封闭。
    1. 配制 1 L 10x TBS，将 24 g Tris 碱和 88 g NaCl 溶解于 900 mL H₂O 中2Odd 并调节 pH 至 7.6。加入 ddH₂O2O至终体积1 L。配制1x溶液时，将1份10x储存液与9份ddH₂O混合。2O.
  5. 将膜分别在室温下与1:1,000稀释的一抗β-淀粉样蛋白抗体6E10孵育1小时，再与1:10,000稀释的二抗山羊抗小鼠IgG-HRP缀合物孵育1小时。
  6. 使用1 mL Luminata荧光试剂显影膜，并按照步骤5.2所述进行密度分析以定量条带。

5. 数据分析

  1. 为分析流式细胞术（FC）获得的数据，创建一个表格，显示绿色荧光蛋白（GFP）荧光和氧化应激水平的平均荧光强度（MFI）和中位荧光强度及其对应的标准误和/或变异系数（CV）。
    1. 点击Inspector标签页和Statistics图标，以自定义每个通道所需的统计信息。
      注意：在比较蛋白质变体时，应将荧光值数据转换为背景倍数或分辨率度量（RD）：
      Cohen's d 效应量公式，用于说明实验研究中的统计比较。
      在此度量中，样本均值为待测样品的平均荧光强度，对照均值为作为对照的细胞的平均荧光强度，SD 为平均荧光强度的标准差。RD 因子比 MFI 值更准确，因为它不仅计算样品间的差异，还考虑了数据的离散程度。当比较在不同时间进行的多个实验所得数据时，该计算尤为适用。在计算出 RD 值后，建议使用统计检验方法来确认不同蛋白质变体之间差异的显著性。
  2. 对于蛋白质免疫检测，使用 ImageJ 软件通过蛋白质印迹法（Western blot）对重组蛋白水平进行定量。
    1. 在进行密度分析之前，将显影膜的原始图像转换为 JPEG 文件格式并调整为灰度模式。
    2. 调整 ImageJ 中Analyze菜单下的Set Measurements部分，选择Mean Grey Value。
    3. 点击 ImageJ 的Rectangle工具，为条带密度分析定义一个大小一致的兴趣区域（ROI）。将每个条带居中置于所创建的矩形框内，并使用 Ctrl+M（测量命令）逐一记录测量值。
    4. 测量每个条带邻近的局部背景，使用相同的 ROI 区域。测量后，从每个条带的测量值中减去相应的局部背景值。

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结果

本方案描述了如何使用一组包含20种Aβ42肽变异体的集合，其中Phe19被突变为所有天然蛋白源性氨基酸28。可利用两种不同的生物信息学算法（AGGRESCAN 和 TANGO31,32）分析这些蛋白质的理论聚集倾向。在这两种情况下，分析结果均呈现出聚集趋势的渐进分级，通常将最高值赋予疏水性残基，最低值赋予带电荷和极性残基（图1B、1C）。

为了在实验上追踪不同 Aβ42 变体在细胞内的聚集状态，本实验需将一种质粒转化至S. cerevisiae中，该质粒编码由半乳糖诱导型GAL1启动子调控的Aβ42，并与GFP融合（图1A

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讨论

多种疾病与错误折叠蛋白在细胞内的积聚形成沉积物有关6,7,8,33已采用计算方法对触发这些疾病发生的分子机制进行了大量研究，但这些方法未考虑蛋白质浓度，或 体外 方法，其中反应过程中蛋白质浓度保持恒定。然而，在细胞内，蛋白质在拥挤且非均一的环境中持续地合成与降解。这解释了体外实验结果与 计算机模拟, 体外 和 体内 淀粉样蛋白的聚集特性

使用酵母等简单的细胞模型在更接近生物学的背景下研究与神经退行性疾病相关的蛋白质聚集及其毒性，具有多种合理原因。例如，这些模型使我们能够利用此处所采用的快速分析方法，检测蛋白质错误折叠聚集对完整细胞群体的影响。然而，我们应当考虑到不同酵母菌株之间的氧化水平可能存在差异。因此，为了在菌株之间，甚至在不同蛋白质、氧化剂和还原剂之间...

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
酵母细胞 BY4741 ATCC201388基因型：MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0
pESC(-Ura) 质粒 Agilent Genomics217454带有 Gal 启动子的酵母表达质粒。筛选标记为 URA3
酵母合成缺失培养基补充剂SigmaY1501粉末
不含氨基酸的酵母氮源基础培养基SigmaY0626粉末
棉子糖SigmaR7630粉末
葡萄糖SigmaG7021粉末
半乳糖SigmaG0750粉末
磷酸盐缓冲液（PBS）Fisher ScientificBP3991 10X 溶液
CellROX Deep Red 试剂 Life TechnologiesC10422自由基细胞通透性荧光探针，在还原状态下无荧光，当被活性氧（ROS）氧化后产生强荧光，其吸收/发射最大值分别为 644/665 nm。 
Y-PER 蛋白提取试剂 Thermo Scientific78990液体细胞裂解缓冲液
丙烯酰胺/双丙烯酰胺SigmaA6050溶液
Bradford 染料试剂Bio-Rad 5000205用于一步法测定蛋白质浓度的染料试剂
β-淀粉样蛋白抗体 6E10 BioLegend803001小鼠 IgG1。表位位于 β-淀粉样蛋白的第 3-8 位氨基酸（EFRHDS）。
山羊抗小鼠 IgG-HRP 偶联物 Bio-Rad1721011
Immobilion-P 膜，PVDFMilliporeIPVH00010
Luminata forteMerkWBLUF0100预混型即用型化学发光 HRP 检测试剂
苯甲基磺酰氟溶液（PMSF）Sigma93482蛋白酶抑制剂。以乙醇溶解至 0.1 M
FACSCanto 流式细胞仪 BD Biosciences657338配备 488 nm 蓝色激光用于检测 GFP，以及 635 nm 红色激光 / 530/30 nm 带通滤光片和 660/20 带通滤光片
Mini Trans-Blot 电泳转移装置Bio-Rad1703930蛋白质转移系统
Mini-PROTEAN Tetra 手动灌胶系统Bio-Rad1658000FC电泳系统

参考文献

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