评估蛋白质聚集对酵母细胞氧化应激的影响

摘要

蛋白质聚集会引发细胞氧化应激。本方案描述了一种利用流式细胞术监测淀粉样蛋白及其相关氧化应激状态的细胞内状态的方法。该方法用于研究可溶性及易聚集型淀粉样β肽的行为特征。

摘要

蛋白质错误折叠并聚集形成淀粉样构象，已被证实与多种神经退行性疾病的发病及进展相关。然而，目前关于不溶性蛋白质聚集体如何发挥其毒性作用的机制仍知之甚少。 体内简单的原核和真核模式生物，例如细菌和酵母，已极大地促进了我们对细胞内淀粉样蛋白形成、聚集体传播及其毒性的机制的理解。本方案描述了利用酵母作为模型系统，解析蛋白质聚集体形成与其对细胞氧化应激影响之间关系的方法。该方法结合流式细胞术（FC），同时检测淀粉样蛋白在细胞内的可溶性/聚集状态，并量化其表达所导致的细胞氧化损伤。该方法简便、快速且具有定量性。研究通过将一系列淀粉样β肽变异体引起的细胞氧化应激与其各自的固有聚集倾向进行关联分析，展示了该技术的应用。

引言

蛋白质稳态是细胞适应性和衰老过程的基本决定因素。在细胞中，蛋白质稳态由复杂的蛋白质质量控制网络维持，这些网络旨在通过分子伴侣正确地重折叠错误折叠的蛋白质构象体，和/或通过多种高度保守的机制对其进行靶向降解^1,2,3,4,5。大量研究表明，多种人类疾病的发生和发展与蛋白质稳态失衡密切相关，导致蛋白质错误折叠和聚集。例如，蛋白质沉积物的存在被认为是许多神经退行性疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病^6,7,8）、朊病毒病以及非退行性淀粉样变性⁹的病理标志。有研究提出，在聚集反应中早期形成的寡聚体和原纤维结构是细胞毒性的主要诱因，它们可在拥挤的细胞环境中与其他蛋白质发生异常相互作用¹⁰。此外，蛋白质包涵体（PI）可在细胞间传播，从而扩散其毒性效应^11,

方案

1. S. cerevisiae 培养与蛋白质表达

注意：由于 Aβ42 肽段第19位残基（Phe19）发生突变，Aβ 变体表现出不同的相对聚集倾向（图 1A）。这些肽变体标记有绿色荧光蛋白（GFP），可作为聚集报告分子（图 1）²⁹。

1. 将编码20种Aβ42-GFP变异体的质粒转化至具有BY4741亲本背景（MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0）的酵母细胞中³⁰。每种质粒均编码一种通过GSSGSSG连接子与GFP融合的Aβ42突变体。所用质粒为pESC(-URA)，并包含可筛选标记URA3²⁹。
   1. 配制不含尿嘧啶的合成完全培养基（SC-URA），成分如下：1.9 g/L 无尿嘧啶酵母氮源基础培养基、5 g/L 硫酸铵，以及900 mL ddH₂O与100 mL 20%（w/v）葡萄糖混合液。
   2. 取一个转化后的酵母单菌落接种于20 mL含2%葡萄糖的SC-URA培养基中，在30 °C、210 rpm振荡条件下过夜培....

结果

本方案描述了如何使用一组包含20种Aβ42肽变体的集合，其中Phe19被突变为所有天然蛋白源性氨基酸²⁸。可利用两种不同的生物信息学算法（AGGRESCAN和TANGO^31,32）分析这些蛋白质的理论聚集倾向。在这两种情况下，分析结果均呈现出聚集倾向的渐进分级，通常将最高值赋予疏水性残基，最低值赋予带电荷和极性残基（图1B、1C）。

为了在实验上追踪不同Aβ42变体在细胞内的聚集状态，本实验需要将一种质粒转化至S. cerevisiae中，该质粒编码Aβ42，并在其C端融合GFP（图1A），其表达由半乳糖诱导型GAL1启.......

讨论

多种疾病与错误折叠蛋白在细胞内的积聚形成沉积物有关^6,7,8,33已采用计算方法对触发这些疾病发生的分子机制进行了大量研究，但这些方法未考虑蛋白质浓度，或 体外 方法，其中反应过程中蛋白质浓度保持恒定。然而，在细胞内，蛋白质在拥挤且非均一的环境中持续地合成与降解。这解释了体外实验结果与 计算机模拟, 体外 和 体内 淀粉样蛋白的聚集特性

使用酵母等简单的细胞模型在更接近生物学的背景下研究与神经退行性疾病相关的蛋白质聚集及其毒性，具有多种合理原因。例如，这些模型使我们能够利用此处所采用的快速分析方法，检测蛋白质错误折叠聚集对完整细胞群体的影响。然而，我们应当考虑到不同酵母菌株之间的氧化水平可能存在差异。因此，为了在菌株之间，甚至在不同蛋白质、氧化剂和还原剂之间.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
酵母细胞 BY4741	ATCC	201388	基因型：MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0
pESC(-Ura) 质粒	Agilent Genomics	217454	带有 Gal 启动子的酵母表达质粒。筛选标记为 URA3
酵母合成缺失培养基补充剂	Sigma	Y1501	粉末
不含氨基酸的酵母氮源基础培养基	Sigma	Y0626	粉末
棉子糖	Sigma	R7630	粉末
葡萄糖	Sigma	G7021	粉末
半乳糖	Sigma	G0750	粉末
磷酸盐缓冲液（PBS）	Fisher Scientific	BP3991	10X 溶液
CellROX Deep Red 试剂	Life Technologies	C10422	自由基细胞通透性荧光探针，在还原状态下无荧光，当被活性氧（ROS）氧化后产生强荧光，其吸收/发射最大值分别为 644/665 nm。
Y-PER 蛋白提取试剂	Thermo Scientific	78990	液体细胞裂解缓冲液
丙烯酰胺/双丙烯酰胺	Sigma	A6050	溶液
Bradford 染料试剂	Bio-Rad	5000205	用于一步法测定蛋白质浓度的染料试剂
β-淀粉样蛋白抗体 6E10	BioLegend	803001	小鼠 IgG1。表位位于 β-淀粉样蛋白的第 3-8 位氨基酸（EFRHDS）。
山羊抗小鼠 IgG-HRP 偶联物	Bio-Rad	1721011
Immobilion-P 膜，PVDF	Millipore	IPVH00010
Luminata forte	Merk	WBLUF0100	预混型即用型化学发光 HRP 检测试剂
苯甲基磺酰氟溶液（PMSF）	Sigma	93482	蛋白酶抑制剂。以乙醇溶解至 0.1 M
FACSCanto 流式细胞仪	BD Biosciences	657338	配备 488 nm 蓝色激光用于检测 GFP，以及 635 nm 红色激光 / 530/30 nm 带通滤光片和 660/20 带通滤光片
Mini Trans-Blot 电泳转移装置	Bio-Rad	1703930	蛋白质转移系统
Mini-PROTEAN Tetra 手动灌胶系统	Bio-Rad	1658000FC	电泳系统