人卵巢组织与工程化内皮细胞共移植：一种结合快速灌注与直接旁分泌递送的细胞治疗策略

摘要

对于某些患者而言，生育力保存的唯一选择是卵巢组织的冷冻保存。然而，移植后血管重建的延迟会损害卵泡的存活能力。本文介绍了一种将人卵巢组织与内皮细胞共同移植的实验方案，作为一种基于细胞的策略，该方法结合了加速血管灌注和生物活性分子的直接旁分泌递送。

摘要

不孕症是化疗和/或放疗常见的副作用，对某些患者而言，卵母细胞或胚胎的冷冻保存并非可行选择。作为一种替代方案，越来越多的此类患者选择在康复并缓解后，对卵巢组织进行冷冻保存并自体移植。尽管接受冷冻保存卵巢组织自体移植患者的治疗效果已有改善，但移植组织的有效血管重建仍是主要障碍。为减轻缺血并从而改善接受自体移植患者的预后，我们开发了一种基于血管细胞的策略，以加速卵巢组织的灌注。本文描述了一种在小鼠异种移植模型中，将外源性内皮细胞（ExECs）与冷冻保存的卵巢组织共同移植的方法。我们进一步拓展该方法，采用经基因工程改造后持续表达抗苗勒管激素（AMH）的ExECs，从而实现对卵巢移植物的持续旁分泌信号输入。与ExECs共同移植可增加卵泡体积，改善腔隙卵泡发育，而表达AMH的ExECs则促进静息原始卵泡的保留。这一联合策略可能在生育力保存及更广泛的不孕症治疗中，成为减轻缺血和调控卵泡激活的有效工具。

引言

癌症仍然是发达国家的主要死亡原因之一，尽管如此，数十年的研究已使大多数癌症类型的治疗取得显著进展，在某些情况下，患者的生存率几乎翻倍¹。然而，化疗药物通常具有生殖腺毒性，会耗竭卵巢中原始卵泡的储备，从而降低生育能力²。这一日益增长的患者群体可从多种生育力保存方法中获益，包括卵母细胞和/或胚胎冷冻保存；但需要立即开始癌症治疗的患者以及青春期前患者并不适合这些方法。作为替代方案，部分患者选择在开始治疗前冷冻保存卵巢组织，并在康复和缓解后，通过自体移植组织以恢复生育能力³。然而迄今为止，自体移植后的移植物存活率及卵泡产出率仍然相对较低⁴，主要原因在于组织缺血和缺氧^5,6,7。尽管已有大量研究尝试通过使用抗氧化剂^8,9、促血管生成细胞因子^{10,11,12,....}

方案

所有涉及动物受试者的操作均经威尔康奈尔医学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。使用卵巢组织进行的所有异种移植实验均依照相关指南和规定进行。人类卵巢组织采集自因癌症治疗需接受化疗或放疗，或在骨髓移植前的患者。威尔康奈尔医学院机构审查委员会（IRB）批准了组织采集用于潜在自体移植，且在患者知情同意的前提下，最多可捐赠其卵巢组织的10%用于研究用途。

1. 人类卵巢组织的采集

注意：当卵巢组织从偏远机构转运时，运输时间不应超过5小时^18,19。

1. 收集卵巢组织，用无菌生理盐水冲洗。
2. 将卵巢置于无菌容器中。
3. 加入Leibovitz's L-15培养基，直至完全浸没卵巢。
4. 关闭并密封容器。
5. 将容器置于冰上运输。

2. 卵巢组织处理，改编自 Schmidt 等¹⁸

1. 卵巢处理与冷冻前的准备
   1. 准备 100 mL 处理用培养基：Leibovitz's L-15 培养基 99 mL + 1 mL 抗生....

结果

为了确定联合移植ExECs是否对患者组织有益，将解冻的卵巢皮质条分成大小相等的片段，并双侧移植到免疫缺陷的NOD scid gamma（NSG）小鼠体内。其中一侧仅嵌入纤维蛋白凝块（无ECs），另一侧则含有ExECs（图1a），每只小鼠均作为自身的对照。ExECs通过从人脐带中分离原代内皮细胞，并用腺病毒基因片段E4-ORF1进行后续处理而获得，方法如前所述^22,23。在第2至第5代期间，人脐静脉内皮细胞（hUVEC）用编码腺病毒基因片段E4-ORF1的慢病毒颗粒处理，以实现该基因cDNA的组成型表达。该处理可增强内皮细胞的存活能力及其血管生成潜能，如前所述^22,23。移植两周后，在宿主组织与移植物交界处，由GFP标记的exECs形成了功能性的灌注血管（

讨论

在此，我们证明了在小鼠异种移植模型中，联合移植exECs可显著改善卵巢组织的存活率与功能。目前，卵巢组织自体移植用于生育力保存的临床应用标准尚未建立，其最佳参数（如组织大小、移植部位、移植物存留时间等） 等等.)^32,33,34 卵泡池增强恢复的方法仍不明确。进行自体移植时，主要将解冻的卵巢皮质组织以无血管方式移植至盆腔部位，如剩余卵巢、卵巢窝或阔韧带^35,36由于未进行端对端吻合，这种移植方法会导致缺血性组织丢失以及移植物内卵泡的过早激活。因此，尽管与外源性内皮细胞（exECs）共移植涉及递送需要进一步深入研究才能考虑用于临床应用的增殖性内皮细胞，但该方法可加速组织再血管化，可能挽救卵巢移植物内相当比例的卵泡。

这些发现提出了一种基于血管细胞的新型策略，可优化卵.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Leibovitz’s L-15 培养基	Gibco	11415064
抗生素-抗真菌剂	Gibco	15240062	Anti-Anti X100
蔗糖	Sigma	S 1888
纤维蛋白原	Sigma	F 8630	来源于牛血浆
凝血酶	Sigma	T 1063	来源于人血浆
DMSO	Sigma	D 2650
DMEM	Gibco	12491015
酶法细胞解离培养基	Invitrogen	00-4555-56	Accutase
塑料石蜡膜	Bemis NA		Parafilm M
外科纸胶带 2.5 cm	3M	1530-1	Micropore
外科纸胶带 1.25 cm	3M	1530-0	Micropore
带穿孔的塑料外科胶带 1.25 cm	3M	1527-0	Transpore
单丝可吸收缝线	Covidien	UM-203	Biosyn
编织可吸收缝线	Covidien	GL-889	Polysorb
聚维酮碘溶液 USP 10%	Purdue Products	67618-153-01	Betadine 溶液棉签棒
冻存管	Nunc	377267	CryoTube
无菌眼用润滑剂	Dechra	17033-211-38	Puralube
1.7 ml 微型离心管	Denville	C-2172	Eppendorf
麻醉系统	VetEquip	V-1 台式系统，带废气清除装置
内皮细胞	Angiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, USA		分离的、转染 E4-ORF-1 并标记的内皮细胞
三色染色液	Sigma	HT15-1kt	三色染色（Masson）试剂盒
异凝集素	Invitrogen	I32450	来自 Griffonia simplicifolia 的异凝集素 GS-IB4，Alexa Fluor™ 647 标记物