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方法文章

人卵巢组织与工程化内皮细胞共移植：一种结合快速灌注与直接旁分泌递送的细胞治疗策略

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DOI：

10.3791/57472

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2018年5月16日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Reproductive Medicine and Infertility, Weill Cornell Medical College, 2Angiocrine Biosciences, Inc., 3Tri-Institutional Stem Cell Derivation Laboratory, Weill Cornell Medical College, 4Joan and Sanford I. Weill Department of Medicine, Weill Cornell Medical College

本文内容

摘要

对于某些患者而言，生育力保存的唯一选择是卵巢组织的冷冻保存。然而，移植后血管重建的延迟会损害卵泡的存活能力。本文介绍了一种将人卵巢组织与内皮细胞共同移植的实验方案，作为一种基于细胞的策略，该方法结合了加速血管灌注和生物活性分子的直接旁分泌递送。

摘要

不孕症是化疗和/或放疗常见的副作用，对某些患者而言，卵母细胞或胚胎的冷冻保存并非可行选择。作为一种替代方案，越来越多的此类患者选择在康复并缓解后，对卵巢组织进行冷冻保存并自体移植。尽管接受冷冻保存卵巢组织自体移植患者的治疗效果已有改善，但移植组织的有效血管重建仍是主要障碍。为减轻缺血并从而改善接受自体移植患者的预后，我们开发了一种基于血管细胞的策略，以加速卵巢组织的灌注。本文描述了一种在小鼠异种移植模型中，将外源性内皮细胞（ExECs）与冷冻保存的卵巢组织共同移植的方法。我们进一步拓展该方法，采用经基因工程改造后持续表达抗苗勒管激素（AMH）的ExECs，从而实现对卵巢移植物的持续旁分泌信号输入。与ExECs共同移植可增加卵泡体积，改善腔隙卵泡发育，而表达AMH的ExECs则促进静息原始卵泡的保留。这一联合策略可能在生育力保存及更广泛的不孕症治疗中，成为减轻缺血和调控卵泡激活的有效工具。

引言

癌症仍然是发达国家的主要死亡原因之一，尽管如此，数十年的研究已使大多数癌症类型的治疗取得显著进展，在某些情况下，患者的生存率几乎翻倍1。然而，化疗药物通常具有生殖腺毒性，会耗竭卵巢中原始卵泡的储备，从而降低生育能力2。这一日益增长的患者群体可从多种生育力保存方法中获益，包括卵母细胞和/或胚胎冷冻保存；但需要立即开始癌症治疗的患者以及青春期前患者并不适合这些方法。作为替代方案，部分患者选择在开始治疗前冷冻保存卵巢组织，并在康复和缓解后，通过自体移植组织以恢复生育能力3。然而迄今为止，自体移植后的移植物存活率及卵泡产出率仍然相对较低4，主要原因在于组织缺血和缺氧5,6,7。尽管已有大量研究尝试通过使用抗氧化剂8,9、促血管生成细胞因子10,11,12,13或机械干预手段14来提高卵巢皮质移植物的存活率，但在移植后5至7天内的移植物缺血问题仍严重损害了移植物的活力与存活7。为解决这一问题，我们开发了一种基于细胞的策略，旨在促进宿主与移植物血管之间的吻合，从而加速卵巢组织的再灌注。

除了移植后窗口期内移植物卵巢组织的缺血性损伤外，卵泡间信号传导的中断也可能导致卵泡储备池的耗竭15,16。由于外源性内皮细胞（ExECs）有助于在移植物周围形成稳定且具有功能的血管，因此它们为向移植组织传递特定分子信号提供了独特的机会。作为概念验证，研究人员对ExECs进行基因工程改造，使其表达超生理水平的抗苗勒管激素（Anti-Mullerian hormone, AMH），该激素属于转化生长因子β（TGFβ）超家族成员，已被证实可抑制卵泡生长17。通过比较与对照细胞或表达AMH的细胞共同移植的移植物中卵泡分布情况，验证了经改造的ExECs所具备的生物学活性与效力。

总之，通过提高移植物的存活率并抑制卵泡池的过早激活，该方法可提高接受生育力保存治疗的患者自体移植卵巢组织的生产效率。此外，基于ExEC的平台能够对已被证实参与卵泡发育的分子调控因子进行实验性研究。

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方案

所有涉及动物受试者的操作均经威尔康奈尔医学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。使用卵巢组织进行的所有异种移植实验均依照相关指南和规定进行。人类卵巢组织采集自因癌症治疗需接受化疗或放疗，或在骨髓移植前的患者。威尔康奈尔医学院机构审查委员会（IRB）批准了组织采集用于潜在自体移植，且在患者知情同意的前提下，最多可捐赠其卵巢组织的10%用于研究用途。

1. 人类卵巢组织的采集

注意：当卵巢组织从偏远机构转运时，运输时间不应超过5小时18,19。

  1. 收集卵巢组织，用无菌生理盐水冲洗。
  2. 将卵巢置于无菌容器中。
  3. 加入Leibovitz's L-15培养基，直至完全浸没卵巢。
  4. 关闭并密封容器。
  5. 将容器置于冰上运输。

2. 卵巢组织处理，改编自 Schmidt 等18

  1. 卵巢处理与冷冻前的准备
    1. 准备 100 mL 处理用培养基：Leibovitz's L-15 培养基 99 mL + 1 mL 抗生素-抗真菌溶液。使用 0.2 µm 滤器过滤培养基。将培养基冷藏保存。
    2. 使用 DMSO 作为冷冻保护剂，配制 100 mL 冷冻液。加入 69.64 mL Leibovitz's L-15 培养基、17.66 mL 胎牛血清（FBS）、3.42 g 蔗糖（终浓度为 0.1 mol/L）、10.65 mL DMSO（终浓度为 1.5 mol/L）以及 1 mL 抗生素-抗真菌溶液。使用 150 mL 滤器装置（0.2 µm）过滤培养基。将冷冻液储存在 4 °C。
    3. 使用设定为包裹固体灭菌程序的高压灭菌器对手术器械进行灭菌。
  2. 组织到达后的处理
    1. 在生物安全柜中放置已灭菌的手术器械：带 21 号刀片的手术刀、精细弯头剪刀，以及不同尺寸的镊子，包括长型（约 150 mm 长）和两个中等尺寸（约 110 mm 长）。
    2. 佩戴无菌手套，在生物安全柜内打开容器。取出卵巢并置于一个 150 mm 的培养皿中，并将步骤 2.1.1 中准备的冷培养基倒在卵巢上方，以防止卵巢组织脱水。
    3. 将卵巢从任何残留组织中分离，并用冷培养基冲洗，直至组织表面无附着物和血液。
    4. 将卵巢放入一个洁净的 150 mm 培养皿中，加入步骤 2.1.1 中准备的冷培养基，使卵巢半浸没于其中。
  3. 卵巢组织的解剖分离
    1. 将卵巢沿中线切开，首先使用弯头精细剪刀锐性分离并去除髓质组织，然后用带 21 号刀片的无菌手术刀刮除残余髓质。继续操作，直至皮质组织厚度为 1–1.5 mm。
    2. 将皮质组织切成 2–3 mm 宽的条状，条带的长度即为所处理卵巢组织的全长。

3. 卵巢组织慢速冷冻，改编自 Newton et al. 和 Oktay et al.6,20

  1. 冷冻前准备
    1. 标记冻存管（1.8 mL）。
    2. 向每支冻存管中加入1.5 mL在步骤2.1.2中配制的冷冻保护液。
    3. 将一条皮质条转移至一支含有冷冻保护液的冻存管中。
    4. 在4 °C条件下，将皮质条置于旋转平台上平衡20分钟，并保持轻柔振荡。
  2. 卵巢组织的程序化慢速冷冻
    1. 将冻存管放入程序降温仪中，起始温度为0 °C。
    2. 以2 °C/min的速率降温至-7 °C。
    3. 在此恒定温度下维持组织10分钟。
    4. 通过将浸入液氮（LN2）的棉签接触每支冻存管，进行人工冰核诱导（播种）。
    5. 继续以0.3 °C/min的速率降温，直至样品温度达到-40 °C。
    6. 随后以较快的10 °C/min速率降温至-140 °C。
    7. 将冻存管转移至杜瓦瓶中，于液氮（-196 °C）中长期保存。

4. 手术准备（双侧卵巢切除术和共移植）

  1. 培养皿的准备
    1. 在解冻用于移植的卵巢组织前一天
      1. 将一块塑料石蜡膜放置在50 mm培养皿底部，喷洒70%乙醇直至完全覆盖。
      2. 将培养皿在生物安全柜中过夜。每只小鼠准备2个培养皿。
    2. 手术当天
      1. 在生物安全柜内，吸除含有塑料石蜡膜的培养皿中的乙醇。
      2. 将培养皿盖半开，直至乙醇完全挥发。
      3. 当塑料石蜡膜完全干燥后，盖上培养皿盖。将其保留在生物安全柜内。
      4. 在6孔板中相应标记各孔：0.1 mol/L蔗糖 + 1 mol/L DMSO、0.1 mol/L蔗糖 + 0.5 mol/L DMSO、0.1 mol/L蔗糖、基础解冻液（BTS）、培养基。
  2. 溶液的配制
    1. 配制100 mL基础解冻液（BTS）：Leibovitz's L-15培养基79 mL + 胎牛血清（FBS）20 mL + 抗生素-抗真菌溶液1 mL。使用0.22 µm滤器系统过滤。
    2. 配制含0.1 mol/L蔗糖的BTS溶液10 mL。称取0.342 g蔗糖，加入10 mL步骤4.2.1中配制的BTS溶液，轻轻搅拌至蔗糖完全溶解。使用0.22 µm注射器滤器过滤该溶液。
    3. 根据表1配制各溶液。用铝箔包裹含DMSO的试管。冷藏保存，直至使用。

5. 卵巢组织快速解冻

  1. 从液氮中取出2 将装有冷冻卵巢组织的冻存管从杜瓦瓶中取出，在室温下放置30秒。
  2. 用纸巾将小瓶擦拭干净。
  3. 将小瓶浸入30 °C水浴中1-2分钟，直至内容物完全解冻。
  4. 打开小瓶，将皮质条放入第一个含有3 ml第一溶液（0.1 mol/L 蔗糖 + 1 mol/L DMSO，步骤4.2.3中配制）的孔中。
    注意：所有涉及打开培养板盖的步骤均须在层流罩内进行。
  5. 将6孔板置于4 °C旋转板上孵育5分钟。此步骤中需用铝箔覆盖孔板。
  6. 将皮质条转移至第二个含有3 mL第二种溶液（0.1 mol/L 蔗糖 + 0.5 mol/L DMSO，按步骤4.2.3配制）的孔中。
  7. 将6孔板置于旋转板上，4 °C轻柔振荡孵育5分钟。此步骤中需用铝箔覆盖孔板。
  8. 将皮质条转移至第三个孔中，该孔含有4 mL溶液（BTS加0.1 mol/L蔗糖，步骤4.2.2中配制）。
  9. 在4 °C下于旋转板上孵育，温和振荡5分钟。
  10. 将皮质条转移至含有4 mL溶液（BTS，按步骤4.2.1配制）的第四个孔中。
  11. 在4 °C下于旋转板上孵育，温和振荡5分钟。
  12. 将皮质条转移至最后一个含有4 mL冷培养基（步骤2.1.1中配制）的孔中。解冻后的卵巢组织需置于冰上保存，直至进行移植操作。

6. 卵巢组织的包封

  1. 配制以下溶液
    1. 配制25 mL含0.9%氯化钠的20 mmol/L HEPES缓冲液。过滤后于4 °C保存。
    2. 配制1 mL浓度为1 mol/L的CaCl2溶液。过滤后于4 °C保存。
  2. 配制50 mg/mL纤维蛋白原储备液
    1. 在37 °C下，数小时内将1 g纤维蛋白原缓慢加入20 mL含0.9%氯化钠的20 mmol/L HEPES缓冲液中，同时缓慢混合。
    2. 标记1.7 mL微量离心管。
    3. 将溶液先经0.45 µm注射器滤器过滤，再经0.2 µm注射器滤器过滤。
    4. 将溶液分装至微量离心管中，每管200 µL，并于-20 °C保存。
  3. 配制100 U/mL凝血酶储备液
    注意：凝血酶溶液易吸附于玻璃表面，请将溶液分装至塑料管/小瓶中。
    1. 向250 U凝血酶中加入2.5 mL 0.9%无菌氯化钠溶液。
    2. 轻轻振荡，直至溶液完全溶解。
    3. 标记1.7 mL微量离心管。
    4. 经0.2 µm注射器滤器过滤后，将溶液以每管50 µL分装至微量离心管中，并于-80 °C保存。
  4. 制备70 µL纤维蛋白凝块，终浓度为10 mg/mL纤维蛋白原和5 U/mL凝血酶
    注意：操作需迅速，溶液在数秒内即凝固。同时避免向混合物中引入气泡。
    1. 在1.7 mL微量离心管中配制纤维蛋白原溶液。
      1. 向第6.2.4步中分装的200 µL纤维蛋白原储备液中加入360 µL含0.9%氯化钠的20 mmol/L HEPES缓冲液。
      2. 通过轻柔吹打混匀。
      3. 置于冰上保存。
    2. 在第二个微量离心管中配制凝血酶溶液。
      1. 向第6.3.4步中分装的50 µL凝血酶储备液中加入148.7 µL DMEM培养基。
      2. 通过轻柔吹打混匀。
      3. 加入1.3 µL 1 mol/L CaCl2。
      4. 通过轻柔吹打混匀。
      5. 置于冰上保存。
    3. 在第三个微量离心管中制备单细胞悬液。
      1. 使用酶法细胞解离液将基因工程改造的内皮细胞从培养板上解离下来。
      2. 离心收集细胞，并使用带盖玻片的血细胞计数板进行细胞计数。
      3. 每1 mm2卵巢组织使用20,000个细胞。根据卵巢组织面积（mm2）计算所需细胞总数（20,000×面积）。
      4. 离心收集基因工程改造的内皮细胞，并用基础培养基（DMEM）重悬，调整总体积至16.8 µL。
      5. 置于冰上保存。
    4. 将一块卵巢组织置于无菌纱布上，干燥数秒。
    5. 将卵巢组织放置于50 mm培养皿内的塑料石蜡膜上。
    6. 向第6.4.3.4步制备的细胞悬液中加入39.2 µL第6.4.1.2步制备的纤维蛋白原溶液，轻柔吹打混匀。置于冰上保存。
    7. 加入14 µL第6.4.2.4步制备的凝血酶溶液，仅轻柔吹打一次混匀。操作需迅速。
    8. 将混合液滴加至卵巢组织表面，以拉长液滴的形式加样。
    9. 将含有凝块的培养皿置于37 °C培养箱中孵育。

7. 人卵巢组织与工程化内皮细胞联合移植至NSG小鼠的双侧卵巢切除术

注意：使用10至14周龄的雌性NSG小鼠21（Jackson Labs）。

  1. 准备好所有手术器械（详见步骤2.1.3），并确保缝合线、敷料和手术胶带均已备齐、便于取用。
  2. 使用异氟烷麻醉系统对小鼠进行麻醉。
    1. 将小鼠放入诱导室，盖上盖子并打开相应的旋塞阀。
    2. 将流量计调至1,000 mL/min。打开蒸发器，并将其设置为输出2-3.5%。
    3. 观察麻醉效果；意识丧失，呼吸缓慢且规律。
    4. 转移到鼻罩以维持麻醉。根据生命体征将挥发罐调节至输送1-3%的麻醉气体。
    5. 确认足底或尾部反射消失。若反射仍存在，增加异氟烷剂量直至反射消失。
  3. 使用电动理发器修剪小鼠背部毛发，从尾部向上至锁骨连线处。
  4. 将小鼠俯卧位放置于手术平台上。
  5. 使用手术胶带将鼻锥固定在手术平台上。
  6. 使用宽1.25 cm的手术纸胶带将小鼠的四肢轻轻固定在手术台上。
  7. 使用无菌润滑胶冻，经直肠插入体温计。用宽1.25 cm的带孔塑料手术胶带将体温计固定于手术台。
  8. 使用宽度为2.5 cm的手术纸胶带将尾巴固定在手术平台上。
  9. 使用红外线或热水加热垫加热，并在操作过程中监测小鼠的体温，保持体温在35–37 °C范围内。
  10. 用无菌聚维酮碘溶液棉签清洁修剪区域，再用无菌酒精棉片擦拭。
  11. 重复步骤6.9两次。
  12. 在每只小鼠的眼睛上滴加一滴无菌眼用润滑软膏，以防止脱水和角膜损伤。
  13. 用无菌手术巾覆盖小鼠。
  14. 皮下注射布托啡诺（1 mg/kg）。
  15. 使用手术刀（21号刀片）沿纵行正中背侧做切口。
  16. 采用背侧入路进行双侧卵巢切除术。
    1. 使用剪刀通过钝性分离松解皮下结缔组织。
    2. 在中线外侧捏住筋膜，用尖头剪刀做切口并进入腹膜腔。
    3. 用镊子轻轻夹住卵巢脂肪垫和卵巢，并将其从腹腔中拉出。
    4. 用血管钳夹住卵巢和脂肪垫。
    5. 在卵巢基部、输卵管远端处，使用4/0单股可吸收缝线结扎卵巢和脂肪垫。
    6. 在结扎远端剪断卵巢。确保残端基部无出血。
    7. 将组织放回腹腔，并使用6/0编织可吸收缝线缝合筋膜。
    8. 在对侧重复步骤 7.15.1–7.15.7。
  17. 共同移植卵巢组织。
    1. 在臀大肌上方的筋膜处做一个与血块尺寸相适应长度的横向切口。将剪刀伸入筋膜下方，在此虚拟空间内分离形成一个腔隙。
    2. 取一块按步骤6.4.8制备的包埋皮质组织，放入此孔穴中。
    3. 使用6/0编织可吸收缝线缝合筋膜。
  18. 在对侧重复步骤 7.16.1–7.16.3。
  19. 使用4/0单丝可吸收缝线，采用间断单纯缝合关闭背侧壁。
  20. 在切口部位皮下注射利多卡因 0.5%（1.2 mL/kg）。
  21. 使用无菌酒精棉片清洁皮肤。
  22. 在监测小鼠体温的同时关闭异氟烷。
  23. 提供1-2分钟的O₂2，不使用异氟烷。持续保温直至小鼠开始活动并恢复意识。
  24. 将小鼠放入干净的恢复笼中，之后将其单独饲养在另一个笼子中，直至手术伤口完全愈合。
  25. 术后24小时内，根据需要每8-12小时皮下注射一次布托啡诺（1 mg/kg）。
  26. 在实验结束前，将小鼠饲养于独立笼具中，所有食物、水、垫料和笼具均需经过高压灭菌处理。笼具应置于正压通风房间内。每次接触小鼠时均需穿戴个人防护装备。

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结果

为了确定联合移植ExECs是否对患者组织有益，将解冻的卵巢皮质条分成大小相等的片段，并双侧移植到免疫缺陷的NOD scid gamma（NSG）小鼠体内。其中一侧仅嵌入纤维蛋白凝块（无ECs），另一侧则含有ExECs（图1a），每只小鼠均作为自身的对照。ExECs通过从人脐带中分离原代内皮细胞，并用腺病毒基因片段E4-ORF1进行后续处理而获得，方法如前所述22,23。在第2至第5代期间，人脐静脉内皮细胞（hUVEC）用编码腺病毒基因片段E4-ORF1的慢病毒颗粒处理，以实现该基因cDNA的组成型表达。该处理可增强内皮细胞的存活能力及其血管生成潜能，如前所述22,23。移植两周后，在宿主组织与移植物交界处，由GFP标记的exECs形成了功能性的灌注血管（

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讨论

在此，我们证明了在小鼠异种移植模型中，联合移植exECs可显著改善卵巢组织的存活率与功能。目前，卵巢组织自体移植用于生育力保存的临床应用标准尚未建立，其最佳参数（如组织大小、移植部位、移植物存留时间等） 等等.)32,33,34 卵泡池增强恢复的方法仍不明确。进行自体移植时，主要将解冻的卵巢皮质组织以无血管方式移植至盆腔部位，如剩余卵巢、卵巢窝或阔韧带35,36由于未进行端对端吻合，这种移植方法会导致缺血性组织丢失以及移植物内卵泡的过早激活。因此，尽管与外源性内皮细胞（exECs）共移植涉及递送需要进一步深入研究才能考虑用于临床应用的增殖性内皮细胞，但该方法可加速组织再血管化，可能挽救卵巢移植物内相当比例的卵泡。

这些发现提出了一种基于血管细胞的新型策略，可优化卵...

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披露

Michael Ginsberg 是位于美国加利福尼亚州圣迭戈市（邮编 92130）的 Angiocrine Biosciences, Inc. 公司的雇员，该公司分离、转染了 E4-ORF-1 并标记了我们所使用的内皮细胞。

致谢

感谢 Omar Alexander Man 提供插图。
L.M. 获得了康奈尔临床与转化科学中心的试点奖和美国生殖医学学会（ASRM）研究基金的资助。
作者感谢 James 实验室成员对稿件的审阅。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Leibovitz’s L-15 培养基Gibco11415064
抗生素-抗真菌剂Gibco15240062Anti-Anti X100
蔗糖SigmaS 1888
纤维蛋白原SigmaF 8630来源于牛血浆
凝血酶SigmaT 1063来源于人血浆
DMSOSigmaD 2650
DMEMGibco12491015
酶法细胞解离培养基Invitrogen00-4555-56Accutase
塑料石蜡膜Bemis NAParafilm M
外科纸胶带 2.5 cm3M1530-1Micropore
外科纸胶带 1.25 cm3M1530-0Micropore
带穿孔的塑料外科胶带 1.25 cm3M1527-0Transpore
单丝可吸收缝线CovidienUM-203Biosyn
编织可吸收缝线CovidienGL-889Polysorb
聚维酮碘溶液 USP 10%Purdue Products67618-153-01Betadine 溶液棉签棒
冻存管Nunc377267CryoTube
无菌眼用润滑剂Dechra17033-211-38Puralube
1.7 ml 微型离心管DenvilleC-2172Eppendorf
麻醉系统VetEquipV-1 台式系统，带废气清除装置
内皮细胞Angiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, USA分离的、转染 E4-ORF-1 并标记的内皮细胞
三色染色液SigmaHT15-1kt三色染色（Masson）试剂盒
异凝集素InvitrogenI32450来自 Griffonia simplicifolia 的异凝集素 GS-IB4，Alexa Fluor™ 647 标记物

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