需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

将microRNA导入成年骨髓来源造血干细胞的方案：实现细胞工程与磁性靶向的结合

6.3K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/57474

⸱

2018年6月18日

 ,  ,  ,  , 
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, Rostock University Medical Center, 2Department Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty, Rostock University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案介绍了一种安全且高效的CD133+造血干细胞修饰方法。所展示的非病毒性、基于磁性多聚复合物（polyplex）的技术，可为优化治疗性干细胞效应以及通过磁共振成像监测所给予的细胞产品提供基础。

摘要

尽管CD133+造血干细胞（SCs）已被证实具有在再生医学领域中的巨大应用潜力，但其在注射至受损组织后滞留率低，且伴随大量细胞死亡，导致治疗效果极为有限。为克服这些局限性，我们致力于建立一种非病毒性的细胞工程化方案，用于细胞给药前的优化处理。本研究针对载有microRNA（miR）的磁性多聚复合物对人源表达CD133+的干细胞进行修饰，评估其摄取效率、安全性以及细胞靶向能力。基于本实验方案，可实现80–90%的高效miR摄取率，同时CD133+干细胞特性不受影响。此外，这些经修饰的细胞具备磁性靶向的潜力。本文介绍了一种安全且高效的CD133+干细胞修饰方法。我们预期该技术可成为优化治疗性干细胞效应的标准手段，并可通过磁共振成像（MRI）对所给予的细胞产品进行实时监测。

引言

CD133+ 间充质干细胞代表了一类具有再生医学应用前景的异质性干细胞与祖细胞群体。其具有造血、内皮和肌源性分化潜能1,2,3 能够实现CD133+ 细胞 例如通过分化为新生血管以及通过旁分泌机制激活促血管生成信号，参与血管新生过程4,5,6,7.

尽管在30多项已批准的临床试验（ClinicalTrails.gov）中显示出巨大的潜力，但其治疗效果仍存在争议4。事实上，干细胞（SCs）的临床应用受到其在靶器官中滞留率低和移植后大量细胞早期死亡的限制5,8,9。在移植前对CD133+干细胞进行额外的工程化改造，可能有助于克服这些挑战。

高效细胞治疗的一个先决条件是减少大量初始细胞死亡，以增强治疗相关细胞的植入效果10近期研究表明，在移植后的最初1—2小时内，无论移植细胞类型或给药途径如何，高灌注器官（如脑和心脏）中均出现高达90%—99%的细胞大量丢失11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21利用磁性纳米颗粒（MNPs）对干细胞进行标记，可实现一种创新的非侵入性细胞靶向递送策略22,23,24,25,26 并可同时利用 MRI 进行细胞监测27 以及磁性粒子成像（MPI）。最有效的 体内 采用磁化细胞靶向的研究更倾向于在局部给药后实现细胞滞留，而非静脉注射后的细胞导向23,24,28因此，我们课题组设计了一种由超顺磁性氧化铁纳米颗粒组成的递送系统29. 利用该技术，CD133+ SCs 和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）可被高效靶向，如所示 体外 尝试30,31.

干细胞治疗面临的另一个障碍是移植后受损组织中存在的不利炎症环境，这种环境会导致移植后的初始细胞死亡32除了多项预处理研究外，还测试了具有治疗相关性的miRs的应用33；已成功证明抗凋亡miRs可抑制细胞凋亡 体外 并增强细胞植入效果 体内33这些小分子由20–25个核苷酸组成，在信使RNA（mRNA）的转录后调控中发挥关键作用，从而影响干细胞的命运和行为。34此外，外源性引入miRs可避免其在宿主基因组中发生非预期的稳定整合34.

目前，将核酸（NAs）高效导入原代干细胞（SCs）的主要方法大多基于重组病毒8,35尽管转染效率较高，重组病毒的操作仍是从实验室到临床转化的主要障碍。 例如，不可控的基因表达、致病性、免疫原性以及插入突变35,36因此，开发基于聚合物等非病毒递送系统至关重要。其中，聚乙烯亚胺（PEI）是一种有效的递送载体，可为miRs提供多种优势，包括核酸缩合以防止降解、促进细胞摄取，以及通过内体逃逸实现细胞内释放37,38此外，miR-PEI 复合物在临床试验中表现出良好的生物相容性39因此，我们的递送系统由一种生物素化的支化25 kDa PEI与链霉亲和素包被的MNP核心结合而成30,31,40.

在本论文中，我们提供了一项全面的实验方案，描述了（i）从人骨髓（BM）捐献样本中手动分离CD133+干细胞（SC），并对干细胞产物进行详细表征；以及（ii）采用基于磁性非病毒聚合物递送系统对CD133+干细胞进行microRNA（miR）基因工程改造的高效且温和的转染策略。CD133+干细胞通过表面抗体依赖的磁性激活细胞分选（MACS）系统，从人胸骨骨髓抽吸物中分离并进行磁性富集。随后，采用流式细胞术分析细胞活力及细胞纯度。接着，制备miR/PEI/MNP复合物，并对CD133+干细胞进行转染。转染后18小时，检测转染的摄取效率以及转染对干细胞标志物表达和细胞活力的影响。此外，通过四色标记和结构照明显微镜（SIM）对转染复合物组分的细胞内分布情况进行评估。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

用于细胞分离的胸骨人类骨髓取自知情捐赠者，这些捐赠者已签署书面同意书，同意根据《赫尔辛基宣言》将其样本用于科研。罗斯托克大学伦理委员会已批准本研究（注册编号：A 2010 23，2015年延期）。

1. 细胞制备

注意：使用肝素钠（250 IU/mL BM）以防止骨髓检查时发生凝血。

  1. CD133+ SC 分离
    1. 所需溶液的配制
      1. 配制磷酸盐缓冲液（PBS）/乙二胺四乙酸（EDTA）储存液（2 mM）：将996 mL的1×PBS与4 mL的EDTA（0.5 M）混合。充分混匀后，使用滤膜过滤溶液 0.45 µm 滤膜。室温（RT）保存。
      2. 通过将995 mL的2 mM PBS/EDTA与5 g牛血清白蛋白（BSA）混合制备MACS缓冲液。充分混匀溶液，并使用滤器过滤 0.45 µm 滤器。储存于 4 °C.
      3. 通过将500 mg胶原酶B（来自 Clostridium histolyticum) 加入 12.5 mL PBS 中，充分混匀，分装成等量 aliquot 350 µL，并于 -20 °C.
      4. 制备脱氧核糖核酸酶（DNAse）I 储存液（10 mg/mL），将 100 mg 牛胰来源的 DNase I 溶于 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中。充分混匀溶液，分装成若干等份 350 µL，并在 -20 °C.
    2. 人骨髓的酶消化
      1. 将人淋巴细胞培养基预热至室温，并解冻酶溶液（每20 mL骨髓样本使用一份数量的胶原酶B和DNA酶）。
      2. 将骨髓从注射器中收集到50 mL锥形管中，轻轻混匀。弃去任何已形成的凝块。
        注意：转移 200 µL 将未稀释的骨髓液转移至1.5 mL离心管中，用于后续流式细胞术分析。储存于 4 °C 直至使用。
      3. 将10 mL BM转移至新的50 mL锥形管中，加入6 mL PBS/EDTA（2 mM）和20 mL人淋巴细胞培养基， 175 µL 胶原酶B（40 mg/mL）以及 175 µL DNase I（10 mg/mL）。轻轻混匀溶液，在摇床中室温孵育30分钟。对剩余的骨髓样本重复此步骤。
    3. 密度梯度离心
      1. 用移液器将15 mL人淋巴细胞分离液加入一支50 mL密度梯度离心管中进行预处理。在1,000 x g 30 秒。
      2. 小心地将35 mL稀释后的骨髓液加至密度梯度离心管滤膜上方，于445 x g条件下离心 g 室温下孵育35分钟。
        注意：离心机设置为低加速度（3）且无刹车（1）。
      3. 从离心机中小心取出离心管，避免振荡。小心弃去上层清液约 20 mL，注意不要触碰滤膜上方的浑浊层。
      4. 小心地将浑浊层（位于滤膜正上方，含有单个核细胞（MNCs））转移至新的50 mL锥形管中，并用PBS/EDTA补至终体积50 mL。
        注意：将一名骨髓（BM）患者样本中的所有单个核细胞（MNCs）合并至一个新离心管中。
      5. 通过转移计数单个核细胞 10 µL 将50 mL细胞悬液转移至1.5 mL离心管中。加入 10 µL 用3%乙酸与亚甲蓝混合液轻轻混匀并涂抹 10 µL 加入计数室。计算单个核细胞（MNC）的数量。
      6. 将单个核细胞悬液在300 x g条件下离心 g 10 分钟后弃去上清液。
        注意：离心期间，将离心机温度从室温降至 4 °C.
    4. CD133 磁珠分选+ 使用人CD133抗体偶联的超顺磁性铁葡聚糖颗粒的SCs
      注意：此步骤需在冰上操作。将溶液保存于冰上直至使用。 4 °C将MACS永久磁铁、分离柱和预分离滤器储存于 4 °C.
      1. 选择色谱柱尺寸。对于 <1.2 × 108 单核细胞（MNCs），使用磁珠分选柱（MS columns），并用于 >1.2 × 108 单核细胞（MNCs），使用LS柱（参见 材料表).
      2. 为1 × 10⁶细胞的磁珠分选做准备8 总细胞数，小心重悬单个核细胞（MNCs）于 300 µL MACS 缓冲液（4 °C）。加入 100 µL FcR封闭试剂（4 °C）和 100 µL CD133抗体偶联的超顺磁性铁葡聚糖颗粒（4 °C).
      3. 轻轻混匀细胞悬液，并在30分钟内于37°C孵育 4 °C孵育期间轻轻振荡细胞悬液（2–3次）。
      4. 加入 2 mL MACS 缓冲液（4 °C) 每 1 × 108 总单个核细胞。轻柔混匀细胞悬液，于300 x g离心 g 10 min 4 °C.
      5. 设置 MACS 磁力架并安装 MACS 永久磁铁。安装 MACS 分离柱，并将预分离滤器置于其顶部。
      6. 使用0.5 mL（MS）或3 mL（LS）MACS缓冲液平衡第一根MACS MS/LS柱和预分离滤器（4 °C).
        注意：MACS 柱经平衡后，切勿使其干燥。
      7. 弃去上清液，将所得沉淀重悬于 500 µL MACS缓冲液4 °C) 每 1 × 108 总细胞量。将细胞悬液加入预分离滤器中。
      8. 使用MACS缓冲液对MACS柱和分离前滤器进行三次洗涤，每次洗涤使用0.5 mL（MS）或3 mL（LS）MACS缓冲液（4 °C).
        注意：在第三次洗涤步骤期间，将第二个MACS柱安装到MACS永磁体中，并用0.5 mL（MS）或3 mL（LS）MACS缓冲液平衡第二个MACS MS/LS柱（4 °C).
      9. 弃去预分离滤器。
      10. 将细胞组分直接洗脱至第二个MACS柱上：加入1 mL（MS）或5 mL（LS）MACS缓冲液（4 °C) 上样至第一根MACS柱，并将MACS柱从MACS永磁体上取下。立即将第一根MACS柱移至第二根MACS柱上方，使用提供的推杆将细胞悬液通过MACS柱。
      11. 用0.5 mL（MS）或3 mL（LS）MACS缓冲液洗涤MACS柱，共洗涤三次（4 °C).
      12. 通过加入1 mL（MS）或5 mL（LS）MACS缓冲液从柱子中洗脱细胞组分（4 °C) 转移至第二个MACS柱，并将MACS柱从MACS永磁体上取下。立即将第二个MACS柱置于1.5 mL离心管（MS）或15 mL锥形管（LS）上方，使用配套推杆将细胞悬液推过MACS柱。
      13. 300 x g 离心 g 10 分钟 4 °C小心弃去上清液，并将获得的沉淀重悬于 100 µL MACS 缓冲液4 °C).
      14. 计数CD133+ 细胞：转移 6 µL 将细胞悬液转移至1.5 mL离心管中。加入 6 µL 0.4% 台盼蓝溶液。轻轻混匀并应用 10 µL 放入计数室。计算CD133的数量+ 细胞
      15. 储存CD133+ 将细胞置于冰上直至接种。
  2. CD133新鲜分离细胞的表征+ SCs
    注意：以下操作应在避光环境（仅微弱光线）中进行。除非另有说明，所有离心管、缓冲液和抗体均需置于冰上保存。
    1. 用于流式细胞术分析的SCs制备
      1. 使用两个样本（每个 10 µL骨髓等分试样和一份 freshly isolated CD133 样本+ SCs（至少，1 x 104 细胞）用于分析。将细胞转移至1.5 mL离心管中。加入 10 µL FcR封闭试剂，并用MACS缓冲液定容至（4 °C) 至一体积 33 µL.
      2. 将以下抗体分别加入相应试管的内侧（参见 表1：抗-CD34-异硫氰酸荧光素（FITC）（克隆：AC136），抗-CD133/2-藻红蛋白（PE）（克隆：293C3），同型对照小鼠IgG2b-PE，抗-CD45-别藻青蛋白（APC） (APC)-H7（克隆号：2D1）和7-氨基放线菌素（AAD）。所有抗体添加完毕后，轻弹管壁使抗体溶液集中于管底，轻轻混匀溶液（终体积 50 µL）并在该温度下孵育10分钟 4 °C.
      3. 加入1 mL 1×红细胞（RBC）裂解缓冲液，轻轻混匀悬浮液，冰上孵育10 min。将悬浮液在300 x g 10 分钟 4 °C.
      4. 弃去上清液，将所得沉淀重悬于 100 µL PBS（4 °C). 置于冰上保存，直至进行流式细胞术分析。
    2. CD133的流式细胞术分析+ SCs
      1. 为了检测CD133细胞的活力和纯度+ SC，采用改良的国际血液治疗与移植物工程学会（ISHAGE）流式细胞术设门策略41 （参见代表性示意图） 图1）。使用以下顺序：
        步骤1：细胞群体的选择（图1A)
        步骤2：CD45的筛选+ 细胞（图1B)
        第3步：活CD45阳性细胞的筛选+ 细胞（图1C)
        第4步：活CD45阳性细胞的筛选+/CD34+ 细胞（图1D)
        第5步：活CD45阳性细胞的筛选+/CD34+/CD133+ 细胞（图1E)
        运行流式细胞仪（参见 材料表按照制造商的说明进行操作。
      2. 使用以下公式计算细胞活力和纯度：

细胞活力公式，活力 [%] = (有活力的 CD45+ 细胞 / CD45+ 细胞) × 100，方程。   公式 1

细胞分析纯度计算公式，细胞群体百分比计算公式，CD标志物。   公式 2

  1. 新鲜分离的 CD133+ 造血干细胞的细胞培养
    1. 将100倍浓度的重组人细胞因子补充剂分装为每份100 µL，于-20 °C保存。在配制培养基前，取出一份100倍浓度的分装液进行解冻。
    2. 配制CD133+ 造血干细胞培养基：无血清造血细胞扩增培养基，添加重组人细胞因子补充剂（终浓度为1倍）和1%青霉素/链霉素。
    3. 在24孔板中，每孔加入500 µL培养基，接种5 × 104个新鲜分离的CD133+ 造血干细胞用于转染。将细胞置于37 °C、5% CO2 和20% O2 条件下培养。
      注意：另设一组5 × 104个新鲜分离的CD133+ 造血干细胞作为对照，用于流式细胞术分析。

2. 转染复合物的制备

注意：在此步骤中，使用RNA酶去污染溶液保持整个工作区域无RNA酶（RNAse），并仅使用无RNA酶的一次性耗材。

  1. miR 的制备
    注意：以下操作应在避光环境（仅微弱光照）中进行。
    注意：对于 miR 样本：使用 Cy3 荧光素标记的前体 miR 和未标记的前体 miR。
    1. 配制 miR 储存液（50 µM），将所需量的 miR 溶解于适量无核酸酶水中（例如，将 5 nmol miR 溶于 100 µL 水中）。轻轻混匀溶液，分装 miR 储存液（每份 5 µL），并于 -20 °C 以下保存。
  2. PEI 的制备
    1. 按照标准操作流程制备 PEI，并记录 PEI 储存液浓度31,42。
  3. MNP 的制备
    1. 按照标准操作流程制备 MNPs，并记录 MNP 储存液浓度31,42。
  4. miR/PEI 复合物的制备
    1. 将 D-(+)-葡萄糖溶于无核酸酶水中，配制 5% 葡萄糖溶液。轻轻混匀溶液，分装储存液（每份 1.5 mL），并于 4 °C 保存。
      注意：以下操作应在避光环境（仅微弱光照）中进行。
    2. 每孔 24 孔板使用 20 pmol miR30。将 miR 用 5% 葡萄糖溶液稀释至终浓度为 0.25 pmol miR/µL。
    3. 根据 miR 用量（20 pmol，步骤 2.3.1）和最佳氮（PEI 中的 N）与磷酸根（miR 中的 P）摩尔比（N/P 比），结合 PEI 储存液浓度（步骤 2.2.1；本实验采用 7.5 的比例）30，计算所需 PEI 用量。根据以下公式，将 PEI 用等体积的 5% 葡萄糖溶液稀释：
      基因递送效率优化的 N/P 比公式；公式涉及 PEI 和 miR 浓度。
      该公式可重排为：
      PEI 体积公式，数学方程，用于基因转染的生化计算。    公式 3
      其中 PEI 体积单位为 µL，[PEI] 单位为 mM，N/P 比（本方案已优化）为 0.75，0.12 是 miR 特有的换算系数。
    4. 将预先稀释的 PEI 加入预先稀释的 miR 中，涡旋混匀 30 秒。
    5. 将 miR/PEI 复合物在室温下孵育 30 分钟。
  5. miR/PEI/MNP 复合物的制备
    注意：以下操作应在避光环境（仅微弱光照）中进行。
    1. 在孵育 miR/PEI 复合物的同时，将 MNPs 置于室温超声水浴中，以 35 kHz 超声处理 20 分钟，确保颗粒充分悬浮且不发生聚集。
    2. 根据 MNP 储存液浓度（步骤 2.3.1），计算所需 MNPs 的数量（3 µg 铁/mL）。
    3. 将超声处理后的 MNPs 加入 miR/PEI 复合物中，涡旋混匀 30 秒。将 miR/PEI/MNP 复合物在室温下孵育 30 分钟。
  6. 用于 SIM 四色标记的转染复合物的制备
    注意：使用未标记的前体 miR。
    1. 使用 Cy5 荧光素 miR 标记试剂盒（见材料表），按照制造商说明书对 miR 进行标记。使用所列分光光度计（见材料表），根据制造商提供的预设条件（核酸，RNA-40）测定最终 miR 浓度。分装 miR（每份 5 µL），避光保存于 -80 °C。
    2. 使用合适的蛋白质标记试剂盒（见材料表），按照制造商说明书用强绿色荧光染料对 PEI 进行标记。通过茚三酮法（步骤 2.2.1）确定最终 PEI 浓度。将 PEI 分装（体积根据公式 3计算），避光保存于 4 °C。
    3. 以 1:1,000（w/w，染料:MNP）的比例，使用与生物素偶联的罗丹明染料对 MNPs 进行标记。在 miR/PEI 复合物形成的同时，将罗丹明染料与 MNPs 混合，并在避光条件下孵育 30 分钟。标记后的 MNPs 可直接使用。

3. CD133+ 干细胞的转染

注意：此步骤中，需使用RNA酶去污染溶液保持整个工作区域无RNA酶，并仅使用无RNA酶的一次性耗材。
注意：以下操作应在避光房间内进行（仅使用昏暗照明）。

  1. 将制备好的miRNA/PEI/MNP复合物逐滴直接加入含有 freshly isolated CD133+ SCs 的培养基的相应孔中。
  2. 轻轻来回摇动培养板以混匀。将细胞在37 °C、5% CO2 和20% O2 条件下孵育18小时。

4. miR 转染的分析

  1. 检测miR摄取效率及转染复合物的细胞毒性
    注意：用于miR样本时，采用Cy3荧光标记的miR前体进行摄取评估，并以未转染的CD133+干细胞作为流式细胞术对照门控样本。
    注意：以下操作应在避光环境中进行（仅保留弱光照明）。
    注意：除非另有说明，所有离心管、缓冲液和抗体均需置于冰上保存。
    1. 通过将4 g多聚甲醛（PFA）溶于100 mL PBS中，并加热至80 °C，配制4% PFA储存液。充分搅拌溶液，并将pH值调节至7.3。分装PFA储存液（每份1.5 mL），于-20 °C保存。
    2. 转染后18 h，将每孔细胞分别收集至1.5 mL离心管中。每孔用500 µL PBS洗涤一次，并将洗涤液转移至同一离心管中。
    3. 在4 °C条件下以300 x g离心10 min。弃去上清液，将沉淀重悬于100 µL、4 °C的MACS缓冲液中。
    4. 加入0.5 µL胺反应性染料以区分活细胞与死细胞，轻轻混匀后于4 °C孵育10 min。加入1 mL（4 °C）PBS，于4 °C以300 x g离心10 min。
    5. 弃去上清液，将所得沉淀重悬于100 µL PBS中，加入33 µL PFA（4%），冰上或4 °C保存，直至进行流式细胞术分析。
    6. 根据图2所示代表性示意图设置门控策略。按照制造商说明，在流式细胞仪（见材料表）上运行样本。
  2. miR转染后CD133+干细胞的表征
    注意：使用未标记的miR前体以及未转染的CD133+干细胞作为流式细胞术对照门控样本。
    1. 将每孔细胞分别收集至1.5 mL离心管中，在4 °C条件下以300 x g离心10 min。
    2. 采用步骤1.2中所述的门控策略。
  3. 利用SIM技术检测转染复合物的细胞内分布
    1. 按照第2节和第3节所述方法制备复合物并进行细胞转染。
    2. 转染后18 h，将每孔细胞分别收集至1.5 mL离心管中。每孔用500 µL PBS洗涤一次，将洗涤液转移至对应离心管中。在4 °C条件下以300 x g离心10 min。
    3. 弃去上清液，将所得沉淀重悬于含2%胎牛血清（FBS）的1 mL PBS中，轻轻混匀后，在4 °C条件下以300 x g离心10 min。
    4. 弃去上清液，将沉淀重悬于100 µL PBS中，加入33 µL PFA（4%），固定20 min。
    5. 将细胞悬液转移至含有无菌玻璃盖玻片的新24孔培养板中，在4 °C条件下以300 x g离心10 min。
    6. 弃去上清液，加入500 µL PBS，轻轻振荡培养板后弃去PBS。
    7. 使用水性封片剂将制备好的盖玻片置于显微镜载玻片上，室温干燥至少1 h以保持荧光信号。
    8. 使用100X油镜采集图像。SIM设置参数如下：激发波长为405、488、561和633 nm；z轴层扫深度为16位，每个角度采集3相位图像，平均次数为4；各激光线对应的光栅周期分别为：23 µm（405 nm）、34 µm（488 nm）、42 µm（561 nm）、51 µm（633 nm）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

本方案描述了一种从人骨髓来源的CD133细胞中进行手动分离及磁珠富集的方法+ 非侵入性技术，用于病毒非依赖性细胞工程策略的SCs 体外 细胞操作与 体内 监测工具

这种三步分离技术可通过密度梯度离心法从预消化的胸骨骨髓中分离出单个核细胞（MNCs）。随后，可利用相应的分离技术通过磁性富集获得CD133+细胞组分。该方法可实现CD133+干细胞（SCs）的富集，其存活率和纯度均高于80%，可通过流式细胞术进行测定（图1）。此后，仅使用符合要求的干细胞产品进行后续实验。

本文所述转染方法可高效地将miR导入新分离的人CD133+干细胞中，活细胞摄取率约为8...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

近年来，CD133+ 干细胞（SCs）已成为基于干细胞治疗的一种有前景的细胞群体，这一点已得到多项 I 期、II 期和 III 期临床试验的支持43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由德国联邦教育与研究部（FKZ 0312138A 和 FKZ 316159）、梅克伦堡-前波美拉尼亚州政府及欧盟结构基金（ESF/IVWM-B34-0030/10 和 ESF/IVBM-B35-0010/12）、德国研究基金会（DFG，项目号 DA1296/2-1）、德国心脏基金会（F/01/12）、联邦教育与研究部（BMBF，项目号 VIP+ 00240）以及 DAMP 基金会资助。此外，F.H. 和 P.M. 还获得罗斯托克大学医学中心 FORUN 项目（889001）的支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
7-AADBD Biosciences559925
含亚甲蓝的乙酸Stemcell Technologies70603%
抗CD133/2-PE抗体（克隆号：293C3）Miltenyi Biotec GmbH130-090-853
抗CD34-FITC抗体（克隆号：AC136）Miltenyi Biotec GmbH130-081-001
抗CD45-APC-H7抗体（克隆号：2D1）BD Biosciences560178
罗丹明染料；与生物素偶联的Atto 565染料ATTO-TEC GmbHAD 565-71
BD FACS LSRII 流式细胞仪BD Biosciences
BD FACSDiva 软件 6.1.2BD Biosciences
BSASigma-Aldrich GmbHA7906
CD133抗体偶联的超顺磁性铁葡聚糖颗粒；CD133 MicroBead试剂盒Miltenyi Biotec GmbH130-097-049
胶原酶BRoche Diagnostics GmbH11088831001
计数板Paul Marienfeld GmbH & Co. KG
氰基3染料标记的前体miR；Cy3染料标记的Pre-miR阴性对照#1AmbionAM17120
氰基5染料miR标记试剂盒；Cy5染料Label IT miRNA标记试剂盒Mirus BioMIR 9650
DNase IRoche Diagnostics GmbH10104159001(100 U/mL)
ELYRA PS.1 LSM 780 共聚焦显微镜Carl Zeiss Jena GmbH
人FcR阻断试剂Miltenyi Biotec GmbH130-059-901
亮绿色蛋白标记试剂盒；Oregon Green 488蛋白标记试剂盒Thermo Fisher ScientificO10241
水性封片剂；FluoroshieldSigma-Aldrich GmbHF6182
密度梯度离心管；Leukosep离心管Greiner Bio-One89048-932
MACS磁铁架；MACS MultiStandMiltenyi Biotec GmbH130-042-303
MACS预分离滤器Miltenyi Biotec GmbH130-041-40730 µm
MACS分离柱（MS / LS）Miltenyi Biotec GmbH130-042-201 / 130-042-401
MACS永磁体；MACS分选器Miltenyi Biotec GmbH130-042-302
Millex-HV PVDF滤膜MerckSLHV013SL0.45 μm
小鼠IgG 2b-PEMiltenyi Biotec GmbH130-092-215
胺反应性染料；近红外LIVE/DEAD可固定死细胞染色试剂盒Thermo Fisher ScientificL10119
人淋巴细胞分离液；PancollPan Biotech GmbHP04-60500密度：1.077 g/mL
PBSPan Biotech GmbHP04-53500不含Ca和Mg
PEISigma-Aldrich GmbH408727支化；25 kDa
青霉素/链霉素Thermo Fisher Scientific15140122100 U/mL, 100 μg/mL
PFAMerck Schuchardt OHG1040051000
未标记前体miR；Pre-miR miRNA前体阴性对照#1AmbionAM17110
红细胞裂解缓冲液eBioscience00-4333-57
RNase去污染溶液；RNaseZapThermo Fisher ScientificAM9780
人淋巴细胞培养基；Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640培养基Pan Biotech GmbHP04-16500
重组人细胞因子添加剂；StemSpan CC100Stemcell Technologies2690
无血清造血细胞扩增培养基；StemSpan H3000Stemcell Technologies9800
链霉亲和素磁性微球Promega CorporationZ5481
台盼蓝溶液Sigma-Aldrich GmbHT81540.4 %
UltraPure EDTAThermo Fisher Scientific155750200.5 M；pH 8.0
ZEN2011软件Carl Zeiss Jena GmbH
NanoDrop 1000分光光度计Thermo Fisher Scientific
Sonorex RK 100 SH超声水浴器Bandelin electronic超声额定输出：80 W；超声频率：35 kHz

参考文献

  1. Meregalli, M., Farini, A., Belicchi, M., Torrente, Y. CD133(+) cells isolated from various sources and their role in future clinical perspectives. Expert opinion on biological therapy. 10 (11), 1521-1528 (2010).
  2. Lee, S., Yoon, Y. -S. Revisiting cardiovascular regeneration with bone marrow-derived angiogenic and vasculogenic cells. British journal of pharmacology. 169 (2), 290-303 (2013).
  3. Beksac, M., Preffer, F. Is it time to revisit our current hematopoietic progenitor cell quantification methods in the clinic? Bone marrow transplantation. 47 (11), 1391-1396 (2012).
  4. Bongiovanni, D., et al. The CD133+ cell as advanced medicinal product for myocardial and limb ischemia. Stem cells and development. 23 (20), 2403-2421 (2014).
  5. Wang, X., et al. The Clinical Status of Stem Cell Therapy for Ischemic Cardiomyopathy. Stem cells international. 2015, 135023(2015).
  6. Ma, N., et al. Intramyocardial delivery of human CD133+ cells in a SCID mouse cryoinjury model: Bone marrow vs. cord blood-derived cells. Cardiovascular research. 71 (1), 158-169 (2006).
  7. Rafii, S., Lyden, D. Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. Nature medicine. 9 (6), 702-712 (2003).
  8. Wang, D., Gao, G. State-of-the-art human gene therapy: part I. Gene delivery technologies. Discovery medicine. 18 (97), 67-77 (2014).
  9. Sart, S., Ma, T., Li, Y. Preconditioning stem cells for in vivo delivery. BioResearch open access. 3 (4), 137-149 (2014).
  10. Liu, J., et al. Early stem cell engraftment predicts late cardiac functional recovery: preclinical insights from molecular imaging. Circulation. Cardiovascular imaging. 5 (4), 481-490 (2012).
  11. Lang, C., et al. In vivo comparison of the acute retention of stem cell derivatives and fibroblasts after intramyocardial transplantation in the mouse model. European journal of nuclear medicine and molecular imaging. 41 (12), 2325-2336 (2014).
  12. Goussetis, E., et al. Intracoronary infusion of CD133+ and CD133-CD34+ selected autologous bone marrow progenitor cells in patients with chronic ischemic cardiomyopathy: cell isolation, adherence to the infarcted area, and body distribution. Stem cells. 24 (10), Dayton, Ohio. 2279-2283 (2006).
  13. Caveliers, V., et al. In vivo visualization of 111In labeled CD133+ peripheral blood stem cells after intracoronary administration in patients with chronic ischemic heart disease. Q J Nucl Med Mol Imaging. 51 (1), 61-66 (2007).
  14. Terrovitis, J. V., Smith, R. R., Marbán, E. Assessment and optimization of cell engraftment after transplantation into the heart. Circulation research. 106 (3), 479-494 (2010).
  15. Rosado-de-Castro, P. H., et al. Biodistribution of bone marrow mononuclear cells after intra-arterial or intravenous transplantation in subacute stroke patients. Regenerative medicine. 8 (2), 145-155 (2013).
  16. Kang, W. J., Kang, H. -J., Kim, H. -S., Chung, J. -K., Lee, M. C., Lee, D. S. Tissue distribution of 18F-FDG-labeled peripheral hematopoietic stem cells after intracoronary administration in patients with myocardial infarction. Journal of nuclear medicine official publication, Society of Nuclear Medicine. 47 (8), 1295-1301 (2006).
  17. Blocklet, D., et al. Myocardial homing of nonmobilized peripheral-blood CD34+ cells after intracoronary injection. Stem cells. 24 (2), Dayton, Ohio. 333-336 (2006).
  18. Penicka, M., et al. One-day kinetics of myocardial engraftment after intracoronary injection of bone marrow mononuclear cells in patients with acute and chronic myocardial infarction. Heart (British Cardiac Society). 93 (7), 837-841 (2007).
  19. Schächinger, V., et al. Pilot trial on determinants of progenitor cell recruitment to the infarcted human myocardium. Circulation. 118 (14), 1425-1432 (2008).
  20. Dedobbeleer, C., et al. Myocardial homing and coronary endothelial function after autologous blood CD34+ progenitor cells intracoronary injection in the chronic phase of myocardial infarction. Journal of cardiovascular pharmacology. 53 (6), 480-485 (2009).
  21. Musialek, P., et al. Randomized transcoronary delivery of CD34(+) cells with perfusion versus stop-flow method in patients with recent myocardial infarction: Early cardiac retention of (m)Tc-labeled cells activity. Journal of nuclear cardiology official publication of the American Society of Nuclear Cardiology. 18 (1), 104-116 (2011).
  22. Kyrtatos, P. G., et al. Magnetic tagging increases delivery of circulating progenitors in vascular injury. JACC. Cardiovascular interventions. 2 (8), 794-802 (2009).
  23. Vandergriff, A. C., et al. Magnetic targeting of cardiosphere-derived stem cells with ferumoxytol nanoparticles for treating rats with myocardial infarction. Biomaterials. 35 (30), 8528-8539 (2014).
  24. Huang, Z., et al. Magnetic targeting enhances retrograde cell retention in a rat model of myocardial infarction. Stem cell research & therapy. 4 (6), 149(2013).
  25. Yanai, A., et al. Focused magnetic stem cell targeting to the retina using superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Cell transplantation. 21 (6), 1137-1148 (2012).
  26. Arbab, A. S., Jordan, E. K., Wilson, L. B., Yocum, G. T., Lewis, B. K., Frank, J. A. In vivo trafficking and targeted delivery of magnetically labeled stem cells. Human gene therapy. 15 (4), 351-360 (2004).
  27. Cores, J., Caranasos, T. G., Cheng, K. Magnetically Targeted Stem Cell Delivery for Regenerative Medicine. Journal of functional biomaterials. 6 (3), 526-546 (2015).
  28. Cheng, K., et al. Magnetic enhancement of cell retention, engraftment, and functional benefit after intracoronary delivery of cardiac-derived stem cells in a rat model of ischemia/reperfusion. Cell transplant. 21 (6), 1121-1135 (2012).
  29. Li, W., et al. Enhanced thoracic gene delivery by magnetic nanobead-mediated vector. The journal of gene medicine. 10 (8), 897-909 (2008).
  30. Müller, P., et al. Magnet-Bead Based MicroRNA Delivery System to Modify CD133+ Stem Cells. Stem cells international. 2016, 7152761(2016).
  31. Voronina, N., et al. Non-viral magnetic engineering of endothelial cells with microRNA and plasmid-DNA-An optimized targeting approach. Nanomedicine nanotechnology, biology, and medicine. , (2016).
  32. Noort, W. A., et al. Mesenchymal stromal cells to treat cardiovascular disease: strategies to improve survival and therapeutic results. Panminerva Med. 52 (1), 27-40 (2010).
  33. Jakob, P., Landmesser, U. Role of microRNAs in stem/progenitor cells and cardiovascular repair. Cardiovascular Research. 93 (4), 614-622 (2012).
  34. Sen, C. K. MicroRNAs as new maestro conducting the expanding symphony orchestra of regenerative and reparative medicine. Physiological genomics. 43 (10), 517-520 (2011).
  35. Papapetrou, E. P., Zoumbos, N. C., Athanassiadou, A. Genetic modification of hematopoietic stem cells with nonviral systems: past progress and future prospects. Gene therapy. 12, Suppl 1. S118-S130 (2005).
  36. Chira, S., et al. Progresses towards safe and efficient gene therapy vectors. Oncotarget. 6 (31), 30675-30703 (2015).
  37. Hobel, S., Aigner, A. Polyethylenimines for siRNA and miRNA delivery in vivo. Wiley interdisciplinary reviews. Nanomedicine and nanobiotechnology. 5 (5), 484-501 (2013).
  38. Villate-Beitia, I., Puras, G., Zarate, J., Agirre, M., Ojeda, E., Pedraz, J. L. First Insights into Non-invasive Administration Routes for Non-viral Gene Therapy. Gene Therapy - Principles and Challenges. Hashad, D. , (2015).
  39. Cubillos-Ruiz, J. R., Sempere, L. F., Conejo-Garcia, J. R. Good things come in small packages: Therapeutic anti-tumor immunity induced by microRNA nanoparticles. Oncoimmunology. 1 (6), 968-970 (2012).
  40. Schade, A., et al. Magnetic nanoparticle based nonviral microRNA delivery into freshly isolated CD105(+) hMSCs. Stem Cells Int. 2014, 197154(2014).
  41. Sutherland, D. R., Anderson, L., Keeney, M., Nayar, R., Chin-Yee, I. The ISHAGE guidelines for CD34+ cell determination by flow cytometry. International society of hematotherapy and graft engineering. Journal of hematotherapy. 5 (3), 213-226 (1996).
  42. Voronina, N., et al. Preparation and in vitro characterization of magnetized mir-modified endothelial cells. Journal of visualized experiments. (123), (2017).
  43. Stamm, C., et al. Intramyocardial delivery of CD133+ bone marrow cells and coronary artery bypass grafting for chronic ischemic heart disease:Safety and efficacy studies. The journal of thoracic and cardiovascular surgery. 133 (3), 717-725 (2007).
  44. King, A., et al. REpeated AutoLogous Infusions of STem cells In Cirrhosis (REALISTIC): A multicentre, phase II, open-label, randomised controlled trial of repeated autologous infusions of granulocyte colony-stimulating factor (GCSF) mobilised CD133+ bone marrow stem cells in patients with cirrhosis. A study protocol for a randomised controlled trial. BMJ open. 5 (3), e007700(2015).
  45. Martinez, H. R., et al. Stem cell transplantation in amyotrophic lateral sclerosis patients: methodological approach, safety, and feasibility. Cell transplantation. 21 (9), 1899-1907 (2012).
  46. Jimenez-Quevedo, P., et al. Selected CD133(+) progenitor cells to promote angiogenesis in patients with refractory angina: final results of the PROGENITOR randomized trial. Circulation research. 115 (11), 950-960 (2014).
  47. Raval, A. N., et al. Bilateral administration of autologous CD133+ cells in ambulatory patients with refractory critical limb ischemia: lessons learned from a pilot randomized, double-blind, placebo-controlled trial. Cytotherapy. 16 (12), 1720-1732 (2014).
  48. Andreone, P., et al. Reinfusion of highly purified CD133+ bone marrow-derived stem/progenitor cells in patients with end-stage liver disease: A phase I clinical trial. Digestive and liver disease. 47 (12), 1059-1066 (2015).
  49. Arici, V., et al. Autologous immuno magnetically selected CD133+ stem cells in the treatment of no-option critical limb ischemia: clinical and contrast enhanced ultrasound assessed results in eight patients. Journal of translational medicine. 13, 342(2015).
  50. Zali, A., et al. Intrathecal injection of CD133-positive enriched bone marrow progenitor cells in children with cerebral palsy: feasibility and safety. Cytotherapy. 17 (2), 232-241 (2015).
  51. Al-Zoubi, A., et al. Transplantation of purified autologous leukapheresis-derived CD34+ and CD133+ stem cells for patients with chronic spinal cord injuries: long-term evaluation of safety and efficacy. Cell transplantation. 23, Suppl 1. S25-S34 (2014).
  52. Isidori, A., et al. Positive selection and transplantation of autologous highly purified CD133(+) stem cells in resistant/relapsed chronic lymphocytic leukemia patients results in rapid hematopoietic reconstitution without an adequate leukemic cell purging. Biology of blood and marrow transplantation. 13 (10), 1224-1232 (2007).
  53. Nasseri, B. A., et al. Autologous CD133+ bone marrow cells and bypass grafting for regeneration of ischaemic myocardium: the Cardio133 trial. European heart journal. 35 (19), 1263-1274 (2014).
  54. Steinhoff, G., et al. Cardiac Function Improvement and Bone Marrow Response -: Outcome Analysis of the Randomized PERFECT Phase III Clinical Trial of Intramyocardial CD133(+) Application After Myocardial Infarction. EBioMedicine. 22, 208-224 (2017).
  55. Muller, P., et al. Intramyocardial fate and effect of iron nanoparticles co-injected with MACS(R) purified stem cell products. Biomaterials. 135, 74-84 (2017).
  56. Müller, P., Gaebel, R., Lemcke, H., Steinhoff, G., David, R. Data on the fate of MACS® MicroBeads intramyocardially co-injected with stem cell products. Data in brief. 13, 569-574 (2017).
  57. Skorska, A., et al. GMP-conformant on-site manufacturing of a CD133+ stem cell product for cardiovascular regeneration. Stem cell research & therapy. 8 (1), 33(2017).
  58. Delyagina, E., Li, W., Ma, N., Steinhoff, G. Magnetic targeting strategies in gene delivery. Nanomedicine (Lond). 6 (9), 1593-1604 (2011).
  59. Schade, A., et al. Innovative strategy for microRNA delivery in human mesenchymal stem cells via magnetic nanoparticles. International journal of molecular sciences. 14 (6), 10710-10726 (2013).
  60. Delyagina, E., et al. Improved transfection in human mesenchymal stem cells: Effective intracellular release of pDNA by magnetic polyplexes. Nanomedicine. 9 (7), London, England. 999-1017 (2014).
  61. Yin, H., Kanasty, R. L., Eltoukhy, A. A., Vegas, A. J., Dorkin, J. R., Anderson, D. G. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
  62. Chen, J., Guo, Z., Tian, H., Chen, X. Production and clinical development of nanoparticles for gene delivery. Molecular therapy. Methods & clinical development. 3, 16023(2016).
  63. Juliano, R. L. The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 44 (14), 6518-6548 (2016).
  64. Soenen, S. J., Rivera-Gil, P., Montenegro, J. -M., Parak, W. J., de Smedt, S. C., Braeckmans, K. Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation. Nano today. 6 (5), 446-465 (2011).
  65. Estelrich, J., Sánchez-Martín, M. J., Busquets, M. A. Nanoparticles in magnetic resonance imaging: From simple to dual contrast agents. International journal of nanomedicine. 10, 1727-1741 (2015).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

CD133
将microRNA导入成年骨髓来源造血干细胞的方案：实现细胞工程与磁性靶向的结合
联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。