将microRNA导入成年骨髓来源造血干细胞的方案：实现细胞工程与磁性靶向的结合

摘要

本方案介绍了一种安全且高效的CD133⁺造血干细胞修饰方法。所展示的非病毒性、基于磁性多聚复合物（polyplex）的技术，可为优化治疗性干细胞效应以及通过磁共振成像监测所给予的细胞产品提供基础。

摘要

尽管CD133⁺造血干细胞（SCs）已被证实具有在再生医学领域中的巨大应用潜力，但其在注射至受损组织后滞留率低，且伴随大量细胞死亡，导致治疗效果极为有限。为克服这些局限性，我们致力于建立一种非病毒性的细胞工程化方案，用于细胞给药前的优化处理。本研究针对载有microRNA（miR）的磁性多聚复合物对人源表达CD133⁺的干细胞进行修饰，评估其摄取效率、安全性以及细胞靶向能力。基于本实验方案，可实现80–90%的高效miR摄取率，同时CD133⁺干细胞特性不受影响。此外，这些经修饰的细胞具备磁性靶向的潜力。本文介绍了一种安全且高效的CD133⁺干细胞修饰方法。我们预期该技术可成为优化治疗性干细胞效应的标准手段，并可通过磁共振成像（MRI）对所给予的细胞产品进行实时监测。

引言

CD133⁺ 间充质干细胞代表了一类具有再生医学应用前景的异质性干细胞与祖细胞群体。其具有造血、内皮和肌源性分化潜能^1,2,3 能够实现CD133⁺ 细胞 例如通过分化为新生血管以及通过旁分泌机制激活促血管生成信号，参与血管新生过程^4,5,6,7.

尽管在30多项已批准的临床试验（ClinicalTrails.gov）中显示出巨大的潜力，但其治疗效果仍存在争议⁴。事实上，干细胞（SCs）的临床应用受到其在靶器官中滞留率低和移植后大量细胞早期死亡的限制^5,8,9。在移植前对CD133⁺干细胞进行额外的工程化改造，可能有助于克服....

方案

用于细胞分离的胸骨人类骨髓取自知情捐赠者，这些捐赠者已签署书面同意书，同意根据《赫尔辛基宣言》将其样本用于科研。罗斯托克大学伦理委员会已批准本研究（注册编号：A 2010 23，2015年延期）。

1. 细胞制备

注意：使用肝素钠（250 IU/mL BM）以防止骨髓检查时发生凝血。

1. CD133⁺ SC 分离
   1. 所需溶液的配制
      1. 配制磷酸盐缓冲液（PBS）/乙二胺四乙酸（EDTA）储存液（2 mM）：将996 mL的1×PBS与4 mL的EDTA（0.5 M）混合。充分混匀后，使用滤膜过滤溶液 0.45 µm 滤膜。室温（RT）保存。
      2. 通过将995 mL的2 mM PBS/EDTA与5 g牛血清白蛋白（BSA）混合制备MACS缓冲液。充分混匀溶液，并使用滤器过滤 0.45 µm 滤器。储存于 4 °C.
      3. 通过将500 mg胶原酶B（来自 Clostridium histolyticum) 加入 12.5 mL PBS 中，充分混匀，分装成等量 aliquot 350 µL，并于 -20 °C.
      4. 制备脱氧核糖核酸酶（DNAse）I 储存液（10 mg/mL），将 100 mg 牛胰来源的 DNase I 溶于....

结果

本方案描述了一种从人骨髓来源的CD133细胞中进行手动分离及磁珠富集的方法⁺ 非侵入性技术，用于病毒非依赖性细胞工程策略的SCs 体外 细胞操作与 体内 监测工具

这种三步分离技术可通过密度梯度离心法从预消化的胸骨骨髓中分离出单个核细胞（MNCs）。随后，可利用相应的分离技术通过磁性富集获得CD133⁺细胞组分。该方法可实现CD133⁺干细胞（SCs）的富集，其存活率和纯度均高于80%，可通过流式细胞术进行测定（图1）。此后，仅使用符合要求的干细胞产品进行后续实验。

本文所述转染方法可高效地将miR导入新分离的人CD133⁺干细胞中，活细胞摄取率约为8.......

讨论

近年来，CD133⁺ 干细胞（SCs）已成为基于干细胞治疗的一种有前景的细胞群体，这一点已得到多项 I 期、II 期和 III 期临床试验的支持^{43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
7-AAD	BD Biosciences	559925
含亚甲蓝的乙酸	Stemcell Technologies	7060	3%
抗CD133/2-PE抗体（克隆号：293C3）	Miltenyi Biotec GmbH	130-090-853
抗CD34-FITC抗体（克隆号：AC136）	Miltenyi Biotec GmbH	130-081-001
抗CD45-APC-H7抗体（克隆号：2D1）	BD Biosciences	560178
罗丹明染料；与生物素偶联的Atto 565染料	ATTO-TEC GmbH	AD 565-71
BD FACS LSRII 流式细胞仪	BD Biosciences
BD FACSDiva 软件 6.1.2	BD Biosciences
BSA	Sigma-Aldrich GmbH	A7906
CD133抗体偶联的超顺磁性铁葡聚糖颗粒；CD133 MicroBead试剂盒	Miltenyi Biotec GmbH	130-097-049
胶原酶B	Roche Diagnostics GmbH	11088831001
计数板	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG
氰基3染料标记的前体miR；Cy3染料标记的Pre-miR阴性对照#1	Ambion	AM17120
氰基5染料miR标记试剂盒；Cy5染料Label IT miRNA标记试剂盒	Mirus Bio	MIR 9650
DNase I	Roche Diagnostics GmbH	10104159001	(100 U/mL)
ELYRA PS.1 LSM 780 共聚焦显微镜	Carl Zeiss Jena GmbH
人FcR阻断试剂	Miltenyi Biotec GmbH	130-059-901
亮绿色蛋白标记试剂盒；Oregon Green 488蛋白标记试剂盒	Thermo Fisher Scientific	O10241
水性封片剂；Fluoroshield	Sigma-Aldrich GmbH	F6182
密度梯度离心管；Leukosep离心管	Greiner Bio-One	89048-932
MACS磁铁架；MACS MultiStand	Miltenyi Biotec GmbH	130-042-303
MACS预分离滤器	Miltenyi Biotec GmbH	130-041-407	30 µm
MACS分离柱（MS / LS）	Miltenyi Biotec GmbH	130-042-201 / 130-042-401
MACS永磁体；MACS分选器	Miltenyi Biotec GmbH	130-042-302
Millex-HV PVDF滤膜	Merck	SLHV013SL	0.45 μm
小鼠IgG 2b-PE	Miltenyi Biotec GmbH	130-092-215
胺反应性染料；近红外LIVE/DEAD可固定死细胞染色试剂盒	Thermo Fisher Scientific	L10119
人淋巴细胞分离液；Pancoll	Pan Biotech GmbH	P04-60500	密度：1.077 g/mL
PBS	Pan Biotech GmbH	P04-53500	不含Ca和Mg
PEI	Sigma-Aldrich GmbH	408727	支化；25 kDa
青霉素/链霉素	Thermo Fisher Scientific	15140122	100 U/mL, 100 μg/mL
PFA	Merck Schuchardt OHG	1040051000
未标记前体miR；Pre-miR miRNA前体阴性对照#1	Ambion	AM17110
红细胞裂解缓冲液	eBioscience	00-4333-57
RNase去污染溶液；RNaseZap	Thermo Fisher Scientific	AM9780
人淋巴细胞培养基；Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640培养基	Pan Biotech GmbH	P04-16500
重组人细胞因子添加剂；StemSpan CC100	Stemcell Technologies	2690
无血清造血细胞扩增培养基；StemSpan H3000	Stemcell Technologies	9800
链霉亲和素磁性微球	Promega Corporation	Z5481
台盼蓝溶液	Sigma-Aldrich GmbH	T8154	0.4 %
UltraPure EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575020	0.5 M；pH 8.0
ZEN2011软件	Carl Zeiss Jena GmbH
NanoDrop 1000分光光度计	Thermo Fisher Scientific
Sonorex RK 100 SH超声水浴器	Bandelin electronic		超声额定输出：80 W；超声频率：35 kHz