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用于药物筛选的高通量三维肿瘤球体的生成

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DOI：

10.3791/57476

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2018年9月5日

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1Oncology Drug Discovery: Molecular Pharmacology, Novartis Institutes for Biomedical Research, 2Chemical Biology and Therapeutics, Novartis Institutes for Biomedical Research

本文内容

摘要

在多种疾病适应症中，越来越多具有更高生理相关性的模型正被开发并应用于药物发现项目。本文所述的新型模型系统展示了如何在高通量的1536孔板系统中培养和筛选三维肿瘤球体，以寻找新的肿瘤学药物。

摘要

癌细胞通常在塑料表面进行二维（2D）培养。然而，这种技术缺乏肿瘤组织在体内所处的真实环境 体内实体瘤并非以附着于塑料表面的单层形式生长，而是以克隆性细胞群体的形式在三维（3D）空间中生长，与邻近细胞相互作用，并表现出特定的空间特性，例如正常细胞极性的破坏。这些相互作用使得在三维培养条件下的细胞获得更接近体内肿瘤的形态学和细胞学特征 体内 肿瘤。此外，肿瘤组织直接与其他细胞类型（如基质细胞和免疫细胞）以及来自所有其他细胞类型的细胞外基质相接触。所沉积的基质由胶原蛋白和纤连蛋白等大分子组成。

为了促进肿瘤学研究发现从实验室向临床应用的转化，许多研究团队已开始在其药物开发策略中探索使用三维模型系统。这些系统被认为更具生理相关性，因为它们试图重现肿瘤复杂且异质的微环境。然而，这些系统可能相当复杂，尽管可在96孔板中培养，甚至部分已实现384孔板培养，但在大规模培养与高通量筛选方面仍缺乏可行的选择。这一局限性促使了本文详细描述的方法的开发，即在1536孔板中以高通量方式培养肿瘤类球体。这些方法在高度复杂的基于基质的系统（难以进行筛选）与传统的二维检测之间实现了折中。本研究成功筛选了携带不同基因突变的多种癌细胞系，并利用一个经过精心筛选的化合物文库检测化合物的药效，该文库中的化合物靶向丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase, MAPK）通路。随后将类球体培养的反应结果与二维培养细胞的反应进行比较，并报告其活性差异。这些方法提供了一种独特的实验方案，可用于在高通量三维环境下检测化合物的生物活性。

引言

在过去十年中，越来越多的研究采用3D细胞培养模型来探索那些在塑料表面进行2D培养时无法完全重现的生物学现象。这些现象包括正常上皮细胞极性的改变1，其中细胞顶面与基底面的空间取向丧失，以及细胞外基质在调控细胞存活和命运决定中的作用。肿瘤学研究尤其利用3D模型来理解癌细胞的基本生物学特性，以及2D与3D细胞培养系统之间的差异3,4。随着更先进的细胞培养技术的发展及其在多孔板格式中的进一步应用，人们得以在3D环境中开展新药筛选。与在2D条件下培养的细胞相比，肿瘤的3D模型在复杂性上各不相同，从分层的细胞体系5，到不同大小的单细胞类型球体，再到复杂的多细胞类型球体6,7,8。因此，在药物研发项目中，发现能够有效诱导这些3D模型系统中细胞死亡的新型化合物或生物制剂具有高度研究价值。这些检测的终点指标通常与2D培养中所使用的相同，用于评估细胞增殖的变化；但在更具生理相关性的环境中进行时，这些检测可能揭示出被研究靶基因或信号通路真实的功能依赖程度。

如上所述，已有多种模型系统被开发用于研究药物在三维培养系统中的反应，但大多数系统采用的是96孔或384孔微孔板，难以适应药物发现筛选项目中常用的高通量筛选（HTS）格式。这些系统包括悬滴技术、类球体培养、利用磁性颗粒使细胞脉动以诱导悬浮，以及使用天然或合成凝胶（如胶原蛋白、Matrigel 或聚乙二醇（PEG））的培养方法2。本文详细介绍了此前开发的一种技术方法，可在1536孔板体系中利用已建立的癌细胞系生成三维类球体培养物。本方案采用一种成分高度明确的培养基，可阻止通常具有贴壁特性的细胞系附着9。该系统存在局限性（i.e.，无法完全模拟复杂的癌症模型体系），但这些检测方法仍可实现对大量小分子化合物进行高通量筛选，并可在多种细胞系和化合物中开展二维与三维培养之间药物反应的横向比较。

本文所选用的细胞系均携带与MAPK信号通路相关的基因突变，该通路在癌症中高度失调，且已有多种治疗药物可供使用。许多细胞系在Kirsten大鼠肉瘤病毒（KRAS）、神经母细胞瘤RAS（NRAS）、Harvey大鼠肉瘤病毒癌基因（HRAS）以及相关的快速加速纤维肉瘤激酶（RAFs）中存在激活型致癌突变。近期文献表明，当这些细胞系在三维（3D）条件下培养时，针对该通路不同节点的抑制剂在部分细胞系中表现出独特且更强的疗效9,10。一项研究发现，具有活性RAS的癌细胞在3D培养时，对MAPK抑制剂的敏感性增强，并且该方法能够识别出在传统二维（2D）培养条件下可能被忽略的信号通路及靶向抑制剂。本研究旨在介绍这些细胞系的培养方法，并进一步展示仅在3D细胞培养系统中才能观察到的对这些抑制剂的差异性反应。

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方案

1. 1536孔3D肿瘤类球体的培养

  1. 通过向500 mL的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM/F12）中添加以下试剂，配制新鲜的3D肿瘤球体培养基母液（细胞培养基 + 去除血清替代物 + 胰岛素-转铁蛋白-硒）：1x 青霉素/链霉素、10 ng/mL人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、20 ng/mL人表皮生长因子（EGF）、0.4% 牛血清白蛋白（BSA，第五组分）、1x 胰岛素-转铁蛋白-硒和1% 去除血清（KO）替代物（避免冻融）。
  2. 使用0.4 µm瓶顶过滤系统对含补充剂的全部培养基进行过滤除菌。
  3. 将按照推荐常规培养条件生长的癌细胞系从传统细胞培养瓶中消化下来：用1x磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次，加入适量0.25%胰蛋白酶（每5 cm2加1 mL），作用5分钟，使液体形成一层薄层覆盖细胞。用含血清的培养基以胰蛋白酶体积5倍的量中和消化反应，并进行细胞计数。例如，5 mL胰蛋白酶使用25 mL培养基中和。
  4. 将细胞悬液浓度调整为62.5 × 104 个细胞/mL，以便在1536孔组织培养处理板中每孔接种8 µL类球体培养基，使每孔最终含有500个细胞。
  5. 在生物安全柜中，使用带有蠕动泵系统的灭菌不锈钢喷嘴盒进行细胞接种。在不同细胞系之间，用1x PBS和70%乙醇冲洗喷嘴盒管路各10秒。
  6. 或者，在配备高效颗粒空气（HEPA）过滤系统的洁净室内，使用液体处理仪进行细胞接种，根据所需每种细胞系的板数，选择配备灭菌不锈钢喷嘴盒的蠕动泵或连接的注射泵系统。
  7. 使用透气性自粘板封膜，手动或使用板封仪对培养板进行密封。
  8. 将培养板置于旋转培养箱中，设置转速为10 rpm，温度为37 °C，含5%二氧化碳（CO2）和95%相对湿度，培养3天以促进类球体形成。

2. 1536孔板二维癌细胞系的培养

注意：1536孔2D癌细胞系应在向3D板中添加化合物前培养24小时。

  1. 通过向500 mL适用于所选细胞系的适当生长培养基中添加以下试剂，制备2D癌细胞培养基：1×青霉素/链霉素和10%胎牛血清（FBS）。
  2. 使用0.4 µm瓶顶过滤系统对含添加剂的全部培养基进行过滤除菌。
  3. 将按照推荐的常规培养条件生长的癌细胞系从传统细胞培养瓶中消化下来：用1×PBS洗涤3次，加入适量0.25%胰蛋白酶（每5 cm2加1 mL），作用5分钟，使液体形成一层薄层覆盖细胞。用含血清的培养基以胰蛋白酶体积5倍的量进行中和，随后进行细胞计数。例如，5 mL胰蛋白酶使用25 mL培养基中和。
  4. 将细胞悬液浓度调整为62.5 × 104 个细胞/mL，以便在1536孔组织培养处理板中，每孔8 µL完全培养基接种500个细胞。
  5. 在生物安全柜内，使用经灭菌的、带小型不锈钢喷嘴的加样盒，并通过基于蠕动泵的系统进行细胞接种。在不同细胞系之间，用1×无菌PBS和70%乙醇冲洗加样盒管路各10秒。
  6. 或者，在配备高效微粒空气（HEPA）过滤系统的机器人操作室内，使用液体处理仪进行细胞接种，根据每种细胞系所需板数的体积，选择使用经灭菌的带小型不锈钢喷嘴的加样盒配合蠕动泵，或使用配套的注射泵。
  7. 使用透气性压敏封板膜，手动或使用封板机对培养板进行密封。
  8. 将培养板置于旋转培养箱中，在37 °C、5% CO2和95%相对湿度条件下以10 rpm转速孵育24小时，之后再加入化合物。

3. 化合物添加

  1. 在液体处理机器人上，用100%二甲基亚砜（DMSO）配制MAPK抑制剂的8个浓度点、3倍系列稀释液，最高浓度为10 mM。蛋白酶体抑制剂硼替佐米用作阳性对照，以实现完全细胞杀伤，从而确定该检测方法的动态范围。
  2. 将所有检测板和化合物板在100 × g下短暂离心，以收集可能存在的冷凝液。撕去每块板的粘性封膜，将板放置于声波移液系统上，向每孔加入总计8 nL的各化合物/稀释液，使每孔终浓度为0.1% DMSO，最高化合物剂量为10 µM。
  3. 加样完成后，将定制的不锈钢细胞培养盖盖在板上以防止蒸发，并将板放入37 °C旋转培养箱中孵育5天，培养条件为5% CO2和95%相对湿度。

4. 检测试剂添加与原始数据获取

  1. 将含有荧光素的细胞裂解试剂预热至足够体积，以检测三磷酸腺苷（ATP）的变化，从而反映细胞增殖的变化，试剂可在室温或37 °C水浴中预热。使用蠕动泵向每孔加入总共3 µL检测试剂，于室温孵育平板至少15分钟。
  2. 使用酶标仪检测各孔的发光信号。

5. 数据处理

  1. 从仪器中提取原始数据，并将包含测试化合物的所有孔的数值归一化为仅含DMSO的孔的平均值（作为中性对照）。基于此值，计算每种化合物的生长抑制百分比。该计算可通过Microsoft Excel中的公式函数完成，公式为：f(x) = (样品相对光单位（RLUs）/ DMSO平均值相对光单位（RLUs）) × 100。
  2. 通过将步骤5.1中归一化后的数据值对化合物浓度作图，生成剂量-反应曲线并计算抑制剂的IC50值。
    注：我们使用Helios（诺华内部NIBR软件工具）分析数据。为此功能，我们选择了非参数曲线分析工具。

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结果

多种已知在二维培养条件下生长良好的 established 癌细胞系均采用本文所述方法进行了测试。来自多种 MAPK 突变癌细胞系的代表性图像（Calu-6:KRAS、NCI-H1299:NRAS、SK-MEL-30:NRAS 和 KNS-62:HRAS）如图所示。 图1这些图像表明，尽管细胞系具有不同的形态，但在1536孔检测板中均形成了三维结构。 图2 表明，在用于大规模筛选时，二维培养条件下不同培养物对化合物的敏感性差异 与 可在3D条件下观察到。图中每个点代表一种化合物在两种条件下的抑制浓度，即细胞杀伤率达到50%时的化合物IC50值。为证明该效应并非 solely 由不同培养基引起，将Calu-6细胞在相同培养基中培养，分别使用2D组织培养板或3D Scivax生物膜板（后者可阻止细胞贴壁）。在3D生长条件下，敏感性增加或IC50降低的现象可见于 补充图1 在相同培养基中对两种化合物进行测试。...

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讨论

本文所示方法详细阐述了如何在1536孔板中生成肿瘤类球体，用于大规模化合物筛选。这些方法最初借鉴自美国国家癌症研究所的研究工作，该研究中肿瘤类球体在6孔板和96孔板中通过低通量检测进行培养，以探究基因依赖性与化合物敏感性问题13,14,15该方案的一个关键且独特的特点是，类球体由传统的二维培养细胞在1536孔板中形成，所用培养基为特定配方的SCM+KO+ITS。细胞接种后，使用透气性粘性板封膜密封，以防止在为期3天的类球体形成过程中发生任何蒸发。采用此方法也可将类球体进行更长时间的培养。16在成球培养3天后，加入化合物继续培养5天，随后使用基于裂解的增殖检测试剂检测细胞生长变化。经与对照孔归一化处理，并计算二维培养细胞的IC50值 与 3D中，将化合物处理细胞的变化与对照处理细胞进行比较。

由于1536孔板是常规的组织培养处理板，而...

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披露

作者为诺华公司的员工，部分员工同时持有该公司股票。

致谢

作者谨此感谢美国国立卫生研究院转化科学促进国家中心的 Marc Ferrer，感谢他在这些检测方法初期开发过程中提供的支持与指导。此外，作者还感谢项目团队成员 Alyson Freeman、Mariela Jaskelioff、Michael Acker、Jacob Haling 和 Vesselina Cooke 在科学方面的建议与讨论。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
DMEM 高糖培养基（DMEM）/F12ATCC30-2006以预配制溶液形式购买。与其他供应商相比，该配方更受青睐。
DMEM 高糖培养基（DMEM）/F12Lonza12-604F以预配制溶液形式购买。
罗斯威尔公园纪念研究所培养基（RPMI）Lonza12-115Q以预配制溶液形式购买。
胎牛血清（FBS）Seradigm1500-500以预配制溶液形式购买。
1× 0.25% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）HycloneSH30042.01以预配制溶液形式购买。
1× 青霉素/链霉素Gibco15140以预配制溶液形式购买。
10 ng/mL 人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）SigmaF0291用无菌水重悬。
20 ng/mL 人表皮生长因子（EGF）SigmaE9644用无菌水重悬。
0.4% 牛血清白蛋白（BSA）SigmaA9418用无菌 PBS 重悬并过滤。
1× 胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）Gibco51500056
1% KnockOut（KO）血清替代物Gibco10828-028使用前新鲜添加。
100% 二甲基亚砜（DMSO）Sigma276855-100ML
CellTiter-GloPromegaG7573以预配制溶液形式购买。
耗材
小型 Combi 进样盒ThermoFisher24073295
小型 Multiflow 进样盒BioTek294085
1536 孔无菌 TC 培养板（白色）Corning3727
1536 孔无菌 TC 培养板（黑色）Corning3893
Scivax 培养板MBL InternationalNCP-LH384-10
设备
粘性封膜ThermoFisherAB0718
旋转培养箱LiCONiC
不锈钢盖板The Genomics Institute of Novartis Research Foundation (GNF)
ATS 声波移液器EDS Biosystems
Echo 声波移液器Labcyte
发光检测仪Envision-Perkin Elmer
蠕动泵-Multidrop CombiThermoFisher
液体处理系统-Multiflow FXBioTek

参考文献

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标签

1536 MAPK ATP

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