用于药物筛选的高通量三维肿瘤球体的生成

摘要

在多种疾病适应症中，越来越多具有更高生理相关性的模型正被开发并应用于药物发现项目。本文所述的新型模型系统展示了如何在高通量的1536孔板系统中培养和筛选三维肿瘤球体，以寻找新的肿瘤学药物。

摘要

癌细胞通常在塑料表面进行二维（2D）培养。然而，这种技术缺乏肿瘤组织在体内所处的真实环境 体内实体瘤并非以附着于塑料表面的单层形式生长，而是以克隆性细胞群体的形式在三维（3D）空间中生长，与邻近细胞相互作用，并表现出特定的空间特性，例如正常细胞极性的破坏。这些相互作用使得在三维培养条件下的细胞获得更接近体内肿瘤的形态学和细胞学特征 体内 肿瘤。此外，肿瘤组织直接与其他细胞类型（如基质细胞和免疫细胞）以及来自所有其他细胞类型的细胞外基质相接触。所沉积的基质由胶原蛋白和纤连蛋白等大分子组成。

为了促进肿瘤学研究发现从实验室向临床应用的转化，许多研究团队已开始在其药物开发策略中探索使用三维模型系统。这些系统被认为更具生理相关性，因为它们试图重现肿瘤复杂且异质的微环境。然而，这些系统可能相当复杂，尽管可在96孔板中培养，甚至部分已实现384孔板培养，但在大规模培养与高通量筛选方面仍缺乏可行的选择。这一局限性促使了本文详细描述的方法的开发，即在1536孔板中以高通量方式培养肿瘤类球体。这些方法在高度复杂的基于基质的系统（难以进行筛选）与传统的二维检测之间实现了折中。本研究成功筛选了携带不同基因突变的多种癌细胞系，并利用一个经过精心筛选的化合物文库检测化合物的药效，该文库中的化合物靶向丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase, MAPK）通路。随后将类球体培养的反应结果与二维培养细胞的反应进行比较，并报告其活性差异。这些方法提供了一种独特的实验方案，可用于在高通量三维环境下检测化合物的生物活性。

引言

在过去十年中，越来越多的研究采用3D细胞培养模型来探索那些在塑料表面进行2D培养时无法完全重现的生物学现象。这些现象包括正常上皮细胞极性的改变¹，其中细胞顶面与基底面的空间取向丧失，以及细胞外基质在调控细胞存活和命运决定中的作用。肿瘤学研究尤其利用3D模型来理解癌细胞的基本生物学特性，以及2D与3D细胞培养系统之间的差异^3,4。随着更先进的细胞培养技术的发展及其在多孔板格式中的进一步应用，人们得以在3D环境中开展新药筛选。与在2D条件下培养的细胞相比，肿瘤的3D模型在复杂性上各不相同，从分层的细胞体系⁵，到不同大小的单细胞类型球体，再到复杂的多细胞类型球体^6,7,8。因此，在药物研发项目中，发现能够有效诱导这些3D模型系统中细胞死亡的新型化合物或生物制剂具有高度研究价值。这些检测的终点指标通常与2D培养中所使用的相同，用于评估细胞增殖的变化；但在更具生理相关性的环境中进行时，这些检测可能揭示出被研究靶基因或信号通路真实的功能依赖程度。

如上所述，已有多种模型系统被开发用于研究药物在....

方案

1. 1536孔3D肿瘤类球体的培养

1. 通过向500 mL的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM/F12）中添加以下试剂，配制新鲜的3D肿瘤球体培养基母液（细胞培养基 + 去除血清替代物 + 胰岛素-转铁蛋白-硒）：1x 青霉素/链霉素、10 ng/mL人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、20 ng/mL人表皮生长因子（EGF）、0.4% 牛血清白蛋白（BSA，第五组分）、1x 胰岛素-转铁蛋白-硒和1% 去除血清（KO）替代物（避免冻融）。
2. 使用0.4 µm瓶顶过滤系统对含补充剂的全部培养基进行过滤除菌。
3. 将按照推荐常规培养条件生长的癌细胞系从传统细胞培养瓶中消化下来：用1x磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次，加入适量0.25%胰蛋白酶（每5 cm²加1 mL），作用5分钟，使液体形成一层薄层覆盖细胞。用含血清的培养基以胰蛋白酶体积5倍的量中和消化反应，并进行细胞计数。例如，5 mL胰蛋白酶使用25 mL培养基中和。
4. 将细胞悬液浓度调整为62.5 × 10⁴ 个细胞/mL，以便在1536孔组织培养处理板中每孔接种8 µL类球体培养基，使每孔最终含有500个细胞。
5. 在生物安全柜中，使用带有蠕动泵系统的灭菌不锈钢喷嘴盒进行细胞接种。在不同细胞系之间，用1x PBS和70%乙醇冲洗喷嘴盒管路各10秒。
6. 或者，在配备高效颗粒空气（HEPA）过滤系统的洁净室内，使用液体处理仪进行细胞....

结果

已知在二维培养条件下生长良好的多种已建立的癌细胞系均可用本文所述方法进行测试。以下显示了多种MAPK突变型癌细胞系的代表性图像（Calu-6:KRAS、NCI-H1299:NRAS、SK-MEL-30:NRAS 和 KNS-62:HRAS）。 图1这些图像表明，尽管细胞系具有不同的形态，但在1536孔检测板中均形成了三维结构。 图2 表明，在用于大规模筛选时，二维培养的细胞系之间对化合物的敏感性差异 与 可在3D条件下观察到。图中每个点代表一种化合物在两种条件下的半数抑制浓度（IC50），即导致50%细胞死亡时的化合物浓度。为证明该效应并非 solely 由不同培养基引起，将 Calu-6 细胞在相同培养基中培养，分别使用2D组织培养板或3D Scivax生物膜板（后者可阻止细胞贴壁）。在3D生长条件下，细胞敏感性增加或IC50降低的现象可见于 补充图1 在相同培养基中对两种化合物进行测试。Calu-6.......

讨论

本文所示方法详细阐述了如何在1536孔板中生成肿瘤类球体，用于大规模化合物筛选。这些方法最初借鉴自美国国家癌症研究所的研究工作，该研究中肿瘤类球体在6孔板和96孔板中通过低通量检测进行培养，以探究基因依赖性与化合物敏感性问题^13,14,15该方案的一个关键且独特的特点是，类球体由传统的二维培养细胞在1536孔板中形成，所用培养基为特定配方的SCM+KO+ITS。细胞接种后，使用透气性粘性板封膜密封，以防止在为期3天的类球体形成过程中发生任何蒸发。采用此方法也可将类球体进行更长时间的培养。¹⁶在成球培养3天后，加入化合物继续培养5天，随后使用基于裂解的增殖检测试剂检测细胞生长变化。经与对照孔归一化处理，并计算二维培养细胞的IC50值 与 3D中，将化合物处理细胞的变化与对照处理细胞进行比较。

由于1536孔板是常规的组织培养处理板，而.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
DMEM 高糖培养基（DMEM）/F12	ATCC	30-2006	以预配制溶液形式购买。与其他供应商相比，该配方更受青睐。
DMEM 高糖培养基（DMEM）/F12	Lonza	12-604F	以预配制溶液形式购买。
罗斯威尔公园纪念研究所培养基（RPMI）	Lonza	12-115Q	以预配制溶液形式购买。
胎牛血清（FBS）	Seradigm	1500-500	以预配制溶液形式购买。
1× 0.25% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）	Hyclone	SH30042.01	以预配制溶液形式购买。
1× 青霉素/链霉素	Gibco	15140	以预配制溶液形式购买。
10 ng/mL 人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）	Sigma	F0291	用无菌水重悬。
20 ng/mL 人表皮生长因子（EGF）	Sigma	E9644	用无菌水重悬。
0.4% 牛血清白蛋白（BSA）	Sigma	A9418	用无菌 PBS 重悬并过滤。
1× 胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）	Gibco	51500056
1% KnockOut（KO）血清替代物	Gibco	10828-028	使用前新鲜添加。
100% 二甲基亚砜（DMSO）	Sigma	276855-100ML
CellTiter-Glo	Promega	G7573	以预配制溶液形式购买。
耗材
小型 Combi 进样盒	ThermoFisher	24073295
小型 Multiflow 进样盒	BioTek	294085
1536 孔无菌 TC 培养板（白色）	Corning	3727
1536 孔无菌 TC 培养板（黑色）	Corning	3893
Scivax 培养板	MBL International	NCP-LH384-10
设备
粘性封膜	ThermoFisher	AB0718
旋转培养箱	LiCONiC
不锈钢盖板	The Genomics Institute of Novartis Research Foundation (GNF)
ATS 声波移液器	EDS Biosystems
Echo 声波移液器	Labcyte
发光检测仪	Envision-Perkin Elmer
蠕动泵-Multidrop Combi	ThermoFisher
液体处理系统-Multiflow FX	BioTek