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方法文章

Levator Auris Longus 标本制备用于电压钳条件下哺乳动物神经肌肉传递的检测

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DOI：

10.3791/57482

⸱

2018年5月5日

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Wright State University

本文内容

摘要

本文所述方案利用小鼠levator auris longus（LAL）肌肉，在神经肌肉接头处记录自发性和神经诱发的突触后电位（电流钳）和电流（电压钳）。该技术的使用可为正常和疾病状态下突触传递机制提供关键见解。

摘要

本方案描述了一种在电流钳和电压钳条件下记录神经肌肉接头突触传递的技术。ex vivo 实验采用耳长提肌（levator auris longus，LAL），因其为薄层肌肉，便于在运动终板处进行微电极穿刺，并可清晰观察神经肌肉接头。该方法可用于记录自发性微小终板电位和电流（mEPPs 和 mEPCs）、神经诱发的终板电位和电流（EPPs 和 EPCs），以及运动终板的膜特性。通过该方法可获得的结果包括量子含量（QC）、囊泡释放位点数量（n）、囊泡释放概率（prel）、突触易化与抑制，以及肌膜时间常数（τm）和输入电阻。将该技术应用于人类疾病的小鼠模型，有助于揭示疾病状态下的关键病理特征，并助力发现新的治疗策略。通过对单个突触进行完全的电压钳制，该方法提供了目前可实现的最详尽的突触传递分析之一。

引言

研究神经肌肉接头处的突触传递有助于揭示神经系统与骨骼肌系统之间的动态关系，是研究突触生理学的理想模型。levator auris longus（LAL）是一种薄层肌肉，便于清晰观察其神经肌肉接头。已有文献报道指出，利用LAL研究突触药物和毒素具有显著便利性，并已对其骨骼肌纤维类型特征进行了表征1,2。大量研究已采用LAL来探讨神经肌肉生理学特性3,4,5,6,7,8。在电生理学研究中，能够方便地观察LAL的神经肌肉接头，有助于将微电极精确放置于运动终板区域，显著减少记录突触传递时的空间钳制问题。肌肉膜特性（如膜时间常数（τm）和输入电阻（Rin））的电流钳记录可轻松获得。此外，这些特性可在记录神经肌肉传递所用的同一肌纤维上进行测量，从而实现突触功能与肌膜特性之间的直接比较。对这些数据的分析可为多种神经肌肉疾病及活动状态改变的物理机制提供关键见解。

此处所述技术的一个关键方面是使用电压钳 进行突触记录，这种方法不受电流钳 中遇到的非线性效应的影响，且独立于肌膜特性。早在20世纪50年代，研究人员就已通过开创性工作确立了使用电压钳而非电流钳来研究神经肌肉传递的优势9。在电流钳模式下，幅度超过10–15 mV的终板电位（EPP）并非微型终板电位（mEPP）幅度的线性叠加结果9。例如，若平均mEPP为1 mV，则5 mV的EPP可视为由5个mEPP叠加而成（量子含量QC为5）；然而，40 mV的EPP则实际上由超过40个mEPP叠加产生。这种在较大EPP中出现的非线性现象，是由于EPP的驱动力（即膜电位与乙酰胆碱受体平衡电位之间的差值，约为-10 mV）在大EPP期间显著下降所致。电压钳实验可避免这一问题，因为在电压钳条件下，肌膜电位保持恒定不变。其缺点在于，电压钳实验在技术上比电流钳记录更难实现。鉴于此，McLachlan与Martin开发了一种简便的数学校正方法，用于校正电流钳记录中EPP的非线性效应10。该方法校正效果良好11,12,13，但重要前提是假设肌膜特性未受到破坏。

肌肉膜特性在研究影响肌肉的病理条件或疾病状态时尤为重要。例如，亨廷顿病R6/2转基因模型中的骨骼肌由于静息氯离子和钾离子电流进行性降低而表现出兴奋性增高14,15。因此，R6/2骨骼肌中的微终板电位（mEPPs）和终板电位（EPPs）被放大。当然，其他因素也可能改变mEPPs和EPPs。在另一种亨廷顿病小鼠模型（R6/1）中的研究发现，EPPs的变化似乎与SNARE蛋白相关8。为了评估导致神经肌肉传递异常的机制，使用电压钳技术消除肌肉膜特性改变所带来的影响将是有益的。在最近的一项研究中，采用本文所述技术，在电流钳和电压钳两种条件下对R6/2模型的神经肌肉传递进行了研究。通过将两个微电极置于终板长度常数范围内，实现了对整个运动终板的电压钳制，误差小于1%16。研究显示，在R6/2肌肉中，电压钳记录和经校正的电流钳记录所得出的神经肌肉传递测量结果存在差异。这表明，当肌肉膜特性发生改变时，对EPPs的非线性进行校正可能较为困难，同时也凸显了获取独立于肌肉膜特性的电压钳记录的优势。本文所介绍的实验方案非常适合用于研究影响突触传递及突触后膜特性的各种条件或疾病状态。

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方案

所有动物实验均按照莱特州立大学动物护理与使用委员会的规定进行。

1. 小鼠安乐死

  1. 在通风橱中，将小鼠放入一个密闭的玻璃麻醉室。
  2. 通过吸入给予小鼠致死剂量的异氟烷（饱和浓度，约 25%）。将小鼠留在麻醉室中，直至观察不到呼吸。
  3. 将小鼠从麻醉室中取出，并采用颈椎脱位作为辅助安乐死方法。

2. 去除头部、颈部和背部背面的毛发

  1. 使用电动剃须刀剃除小鼠头部、颈部和背部背侧表面的大部分毛发。同时，剃除左耳周围及耳部的毛发。
    注意：剃除耳周皮肤毛发时需小心操作，皮肤可能被剃须刀刀片夹住，从而损伤下方的肌肉组织。
  2. 用棉签将脱毛膏涂抹于已剃毛的区域，以去除残留的毛发。等待约1分钟，然后使用挤压洗瓶中的水冲洗脱毛膏，再用棉签清除残留的脱毛膏或毛发，并轻拍皮肤使其干燥。

3. 去除皮肤以暴露耳长提肌（Levator Auris Longus）

  1. 在体视解剖显微镜下，于小鼠肩胛骨水平的背部做一小切口（深度仅需穿透皮肤即可）。使用显微解剖剪刀沿 图1A-B 所示路径剪开皮肤。
  2. 使用精细镊子（如5号镊子）将肩胛骨附近切口处的皮肤轻轻提起。使用弹簧剪刀剪断结缔组织，以分离皮肤与下方的肌肉组织，并向耳部方向推进。重要的是，剪断结缔组织时应使剪刀刀尖朝向皮肤侧，以避免意外损伤暴露的肌肉组织。
  3. 定期用生理盐水溶液灌注暴露的肌肉组织，例如以下含Na+的外部缓冲液（单位：mM）：144 NaCl、4 KCl、1.2 CaCl2、0.6 MgCl2、5 葡萄糖、1 NaH2PO4，用NaOH调节pH至7.4，渗透压为300 ± 5 mmol/kg。当结缔组织已剪至左耳处时，环绕耳部剪开皮肤，将皮肤完全从小鼠身上移除并丢弃。
    注意：外耳肌（LAL）附着于耳基部，在去除皮肤过程中容易受损。建议在耳基部周围保留约1 mm的皮肤，以避免切断外耳肌。

4. 去除 耳上提长肌 肌肉及周围组织

  1. 使用弹簧剪刀，首先剪断位于耳后外侧头肌（LAL）下方、连接肩胛骨之间脊柱的肌肉。从右侧肩胛骨开始，位置在中线右侧，沿中线向小鼠头侧方向剪开，始终保持在中线右侧。持续剪切直至颅骨末端的肌肉组织完全切断。
    注意：LAL 是连接耳部内侧与中线的最表层肌肉，如图2所示。如需更多图像，E.C. Greene 所著书籍17中提供了精美的手绘 LAL 解剖图。
  2. 用镊子夹住中线右侧刚被剪开的组织，轻轻提起，并将剪刀刀面紧贴颅骨，向左耳方向剪开组织，以去除位于左侧 LAL 下方的多层肌肉。在去除过程中，暂时保留所有肌层的连接，以避免意外剪断 LAL。
  3. 剪切时应使剪刀刀面与颅骨平行并紧贴颅骨，以避免损伤支配 LAL 的神经——该神经环绕耳道，并从耳部内侧进入肌肉。继续沿耳道剪开，尽可能保留神经的完整性。
    注意：支配 LAL 的神经为面神经的分支，应予以保留，因其将在后续操作中使用。
  4. 沿图1B所示路径，剪除耳道外侧稍远端的脂肪组织，位置位于耳部腹外侧区域。同时，参照右侧操作，沿左侧肩胛骨剪开，以将肌肉完全从小鼠身上去除。

5. Levator Auris Longus 肌肉的分离

  1. 将LAL及周围组织放入容器中。使用可将解剖组织固定于底部的容器，例如底部为硅胶弹性体的培养皿。用生理盐水浸泡组织，并频繁冲洗。
  2. 沿耳基部切除耳廓，保留耳软骨部分与LAL相连。翻转肌肉，使下侧朝上（LAL位于培养皿底部）。
  3. 用一根针（如昆虫针）穿过耳道以固定标本。然后使用较短的针，将外侧嗅脑前部（LAL）中线对侧的其余组织固定。用镊子轻轻牵拉耳部外侧的皮肤以拉伸肌肉，并用一根小针穿过皮肤固定。重复此步骤，直至组织被牢固地固定在培养皿中，如图所示。 图3.
    注意：可通过将针灸针剪至所需长度来制作小型解剖针。这些小型解剖针可最大限度减少对组织的损伤，并可用于长工作距离的水浸物镜。
  4. 开始去除肌肉（如图所示） 图4），覆盖LAL的耳上肌，耳长动肌 以及 耳后肌），并使用5号镊子和弹簧剪分离通过结缔组织与前纵韧带（LAL）相连、尤其在中线附近较紧密的组织。
  5. 用镊子提起上方的肌肉层，将剪刀刃朝向被提起的肌肉层，剪开结缔组织，注意避免切割或损伤腹外斜肌腱膜（LAL）。沿朝向正中线的方向剪开，剪至距正中线约四分之三处时停止。随后沿平行于正中线的方向剪切，以去除每层肌肉组织。持续去除肌肉层，直至仅剩腹外斜肌腱膜（LAL）。
  6. 去除覆盖在LAL上残留的部分结缔组织，以利于电极的穿刺。使用5号镊子轻轻将结缔组织从LAL上拉开，并用弹簧剪将其剪除。仅去除能够轻松分离且不会损伤LAL的组织。清除仍附着在LAL下表面、可能妨碍神经肌肉接头观察的支配下层肌肉的较大神经。

6. 神经的分离

  1. 使用神经刺激器（例如，连接到脉冲发生器的两根铂丝）识别支配LAL的神经；将有数条神经从耳道通向肌肉。用神经刺激器接触神经并施加一定电流（电流值大约为5 V）。当肌肉发生收缩时，即表明已找到正确的神经。
  2. 小心夹住神经附近的组织，并使用弹簧剪刀将神经从耳部周围的组织中分离出来。为尽量减少损伤，应使大部分神经仍嵌在部分周围组织中，这些组织将在后续步骤中用于将神经固定在记录皿内。
    注意：支配LAL的运动神经位于耳道开口的内侧。
  3. 若使用双极刺激电极，则仅需去除远离肌肉端神经某一段区域周围的组织。若使用吸吮电极，则需去除神经切断端周围的组织。
    注意：此处可作为合适的暂停点。若需中断操作，可将已解剖的LAL制备物保存在生理溶液中或持续灌流条件下数小时，以确保有害代谢产物不会积累。应使用大量溶液或持续灌流以防止有害代谢产物积聚。
  4. 接下来，解除固定并将肌肉转移至直立复式显微镜下的灌流 chamber 中，用于电生理实验。
    注意：应使用底部柔软的灌流 chamber，以便牢固地固定组织（图5A）。
  5. 在肌肉的两端（耳部和中线处）及其边缘进行固定。将神经垂直于肌纤维方向放置，并通过神经末端保留的多余组织将其固定在记录皿底部。始终确保组织浸泡在生理盐溶液中。
    注意：在LAL肌纤维正下方放置圆润且略抬高的支撑材料也有助于实验操作。这种额外支撑有助于电极穿刺，可通过将一小段硅胶弹性体浇铸在侧放的50 mL锥形管中制成。可使用少量新鲜硅胶将弹性体的圆弧部分固定在灌流 chamber 底部。灌流 chamber 的示意图见 图5B-C。肌肉纤维会非常牢固地黏附于新浇铸的硅胶弹性体（具有高度疏水性），可能导致组织损伤。建议用蛋白质包被或封闭新制的硅胶表面，类似于免疫印迹中的封闭步骤。我们通常将新制的硅胶置于高浓度牛血清白蛋白溶液中孵育过夜以完成封闭处理。

7. 电生理设备设置

  1. 准备或解冻一份有助于可视化神经肌肉接头的染料，例如线粒体染料 4-(4-二乙氨基苯乙烯基)-1-甲基吡啶inium18，具有光敏感性，应避光保存。同时，将电极溶液解冻。涡旋混匀所有分装溶液，确保所有溶质充分溶解。配制含有1 µM µ-芋螺毒素GIIIB（µ-CTX）和80 µM BTS（可选）的生理盐溶液。
  2. 将带有LAL的灌流室固定在显微镜载物台上。将参比电极插入盛有3 M KCl溶液的杯子中，该杯子通过琼脂桥与记录室相连。根据制造商说明，将参比电极连接至放大器。
  3. 此时，将神经刺激电极放置在神经上。可使用吸吮电极或小型双极电极，这两种电极均适用于神经刺激。
    1. 将刺激电极放置在尽可能远离肌肉的位置，以尽量减少记录中的刺激伪迹数量。
      注意：刺激电极应通过刺激隔离单元进行控制，该单元可根据需要调节电压幅度。
  4. 缓慢旋转刺激隔离单元上的电压旋钮以逐渐升高电压，直至观察到肌肉收缩。首次观察到收缩时的电压值即为阈值。确定阈值后，将刺激隔离单元的电压设定为1.5倍阈值（或根据实验要求设定）。
    注意： 图6 图示在直立显微镜下肌肉标本的准备情况，以及使用球关节操纵器将小型双极电极放置在神经上的位置。刺激电压应尽可能低，但仍需明显高于阈值。较低的刺激电压可减少记录过程中的刺激伪迹。此外，将刺激电极远离肌肉放置可减小刺激伪迹的幅度。有时神经末端可能在解剖过程中受损，因此可能需要尝试在神经的不同位置放置刺激电极，以确定最佳刺激点。
  5. 移除灌流生理盐水，更换为 5 µM 4-Di-2-Asp。将 LAL 制备物暴露于 4-Di-2-Asp 中 10 分钟，以获得足够的荧光强度用于神经肌肉接头的可视化图7).
  6. 配制两种电极溶液：3 M KCl 和 K+ 内液成分如下（单位：mM）：75 天冬氨酸，5 MgCl₂2，15 Ca(OH)25 摩尔二钠 ATP，5 摩尔二钠磷酸肌酸，5 摩尔谷胱甘肽，20 摩尔 MOPS，30 摩尔 EGTA，用 KOH 调节 pH 至 7.2。
    注意：溶液应预先配制；K+ 内液可分装后于 -20 °C 保存。
  7. 用3 M KCl填充用于电压感应电极的拉制玻璃毛细管。使用K+ 内灌液（步骤7.6中配制）用于电流传递电极；使用连接1 mL注射器的细非金属针头（约34号）以方便填充玻璃微电极。轻敲微电极以排除气泡；确保每个填充后的电极电阻为10–15 MΩ。
    注意：使用数据采集软件检查并记录两个电极的电阻。
  8. 10 分钟后，将 4-Di-Asp 溶液更换为正常 Ca2+ 溶液

8. 利用荧光鉴定神经肌肉接头

  1. 使用配备标准明场和荧光照明的直立显微镜，沿制备样本寻找一条垂直于肌纤维、呈明亮绿色荧光的神经肌肉接头带，如图7A所示。使用低倍水浸物镜（约10X）识别神经肌肉接头。
    注意：显微镜应配备FITC滤光盒（激发：480/40，二向色镜：505LP，发射：535/50），以及用于荧光的LED、激光、卤素灯或汞灯。为减少光漂白，应在明场和荧光照明之间交替使用。
    注意：该荧光带通常更靠近耳基部而非中线。此区域是神经肌肉接头最密集的部位。
  2. 切换至高倍水浸物镜（约40X），在肌肉表层上选择一个神经肌肉接头用于电生理学检测（图7B）。
  3. 根据制造商说明，将填充好的移液管固定到相应头部支架的移液管夹持器中。使用显微操作器将电极定位在肌肉膜上方，距离已识别的神经肌肉接头100 µm范围内（图7C）。主要通过明场显微镜进行电极定位；使用荧光确认电极相对于神经肌肉接头的位置。
  4. 首先使用低倍物镜（约10X）定位电极，然后切换至高倍物镜（约40X）进行电极的最终定位。此时不要将电极刺入肌肉，应先对电极进行调谐。

9. 电极的调谐与穿刺

  1. 将电极定位到目标肌纤维上方后，根据制造商的说明，通过桥式平衡（或类似方法）对电压感应电极进行调零和校准，并中和电极电容。同时，对电流传递电极进行调零。
  2. 将两个电极缓慢下移至肌纤维表面。在下移过程中，逐步微调电极位置，使其始终保持相对于神经肌肉接头的正确取向，具体操作如步骤8.3和8.4所述。
  3. 当两个电极均接触肌纤维表面后，首先插入较钝的电流传递电极。可采用“buzz”（短暂施加过量电容补偿）、短暂电流脉冲或轻敲实验台等技术，以促进电极穿刺。
    1. 使用示波器或数据采集软件中的示波器程序监测信号，直至观察到负的膜电位，表明电极已成功穿刺进入细胞。
  4. 将较尖锐的电压感应电极压向肌纤维，使其达到与已穿刺的电流传递电极相同的深度。当两个电极处于同一直线后，采用与电流传递电极相同的技术穿刺电压感应电极。
  5. 成功穿刺后，通过放大器控制器，利用电流传递电极施加恒定的负保持电流，以补偿电极穿刺造成的膜损伤。随着细胞逐渐充电接近 -80 mV，根据需要逐步增加保持电流，使细胞达到目标静息电位（i.e.，-80 至 -85 mV）。
    注意：为尽量避免记录到不健康肌纤维的信号，野生型肌肉中应避免使用绝对值大于 -25 nA 的保持电流进行记录。
  6. 当肌纤维在目标静息电位下稳定数分钟后，即可开始记录肌膜特性或神经肌肉传递功能。

10. 记录突触后膜特性与突触传递

  1. 首先进行电流钳记录，施加相同数量的正负电流阶跃，以测量相应的膜电位反应，这些反应将用于确定 运动终板的输入电阻 Rin 和膜时间常数 τm。为确保测量的是被动电学特性，应使用产生小幅度电压反应的电流刺激，且电压反应需达到稳态，并具有线性的电压-电流关系16,19,20。避免记录神经受损或状态不良的肌纤维，此类纤维的微终板电位（mEPP）频率通常超过>3 Hz。
  2. 接下来，按照仪器制造商的说明进入双电极电压钳模式 。将肌纤维 钳制在 -85 mV 的膜电位。电压钳设置应达到足够的信噪比，以便检测到微终板电流（mEPCs）。
    注意：维持良好的电压控制可能具有挑战性。我们采用两种方法来尽量减少此类问题。首先，如前所述，将电极插入距运动终板 100 µm 以内的区域，该距离处于此类肌纤维的空间常数范围内21。其次，我们使用放大器的直流恢复（DC restore）功能。该功能可设置极高的电压钳增益。我们之前的研究已详细描述了该方法，并提出了评估电压钳制下终板控制效果的具体方案16。
  3. 进入电压钳模式后，根据实验需求，采用不同的神经刺激方案记录突触电流（mEPCs 和 eEPCs）。
    1. 使用低频神经刺激方案（≤0.5 Hz）记录自发的微终板电流（mEPCs）和终板电流（EPCs），该方案可在无突触调制（如易化或抑制）的情况下记录 EPCs，从而用于评估量子含量。若需评估突触易化或抑制效应，则应采用高频神经刺激方案（50 Hz 频率下连续刺激 10 次）。
    2. 通过刺激隔离器以所需频率刺激神经，刺激信号可由脉冲发生器产生，并由数据采集软件进行控制和触发。
  4. 完成电压钳记录后，将放大器恢复至电流钳模式，关闭所有电流输出，并将电极从肌纤维中撤出。检查电极是否在记录过程中发生堵塞，或基线电压是否发生漂移。
    注意：关于电压漂移，电极在细胞外溶液中的电压应为 0 伏，与穿刺肌纤维前的设定一致。例如，若实验过程中电压发生漂移，则所记录的电位值将不可靠。

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结果

图8展示了来自一只12周龄野生型R6/2小鼠的一条LAL肌纤维在电流钳模式下记录的电流脉冲（图8A）和电压反应（图8B）的示例。微小终板电位（mEPPs）的存在表明这些记录来自运动终板。记录是在正常的生理盐溶液中获得的。这些电流钳记录可用于分析该肌纤维的输入电阻（Rin）和膜时间常数（τm）16,19,20。

在电压钳制条件下记录到的一个EPC和两个mEPC的代表性结果如图9A所示。EPC...

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讨论

本文介绍了小鼠LAL肌的制备及其在电流钳或电压钳条件下用于神经肌肉传递测量的方法。分离LAL肌时需注意几个关键点。清除肌肉上多余的结缔组织有助于电极穿刺，因为在放置电极进行穿刺时，结缔组织可能钩住电极。然而，仅应去除容易剥离的结缔组织，以尽量减少损伤肌肉的风险。神经的分离操作需格外小心，因为神经非常脆弱。为避免损伤神经，建议保留部分周围组织附着在神经末端，以便插入固定针将神经固定于培养皿中。此外，在放置神经刺激器时应注意避免压伤神经。最后，电极穿刺肌纤维的顺序也很重要。钝电极较难穿刺，应首先插入。如果先插入锐利电极，随后插入钝电极时可能会将肌纤维推下，导致膜尚未被刺穿，甚至可能使锐利电极脱出肌纤维，从而需要再次用锐利电极穿刺，造成不必要的膜损伤。此外，所使用的放大器若能同时测量通过电极的电流和电压，则有助于观察到膜电位的负向偏转，从而确认电极已成功穿刺进入肌纤维。

LAL 的一个有益特征是能够同时移除双侧肌肉。这对于在同一动物体内进行电生理学和分子生物学实验非常有利。通过基本遵循本文所述的方案并稍作调整即可实现这一操作。在执行第1至第3节的所有步骤时，需同时对右侧和左侧进行所述操作...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 Mark M. Rich 博士和 Daniel Miranda 提供的编辑意见，感谢 Ahmad Khedraki 在建立本技术过程中给予的帮助，以及 Wright 州立大学提供的经费支持（A.A.V. 的启动资金）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
奥林巴斯复合显微镜OlympusBX51WI
10倍物镜OlympusUMPLFLN10XW
40倍物镜OlympusLUMPLFLN40XW
硼硅酸盐玻璃Sutter InstrumentsBF150-86-7.5
CCD相机Santa Barbara Instruments GroupST-7XMEI
Mater-9脉冲发生器AMPI
Iso-flex刺激隔离器AMPI
pCLAMP 10数据采集与分析软件Molecular Devices1-2500-0180
同心双极电极FHCCBDSH75
球关节操纵器Narishige 
非金属注射器，34号针头World Precision InstrumentsMF34G-5
尼康体视显微镜NikonSMZ800N
5号镊子Fine Science Tools
弹簧剪刀Fine Science Tools15006-09
2号镊子RobozRS-5Q41
显微解剖剪刀RobozRS-5912SC
Sylgard 184硅酮弹性体试剂盒Dow Corning2404019862
脱毛膏Nair
Grass SD9刺激器Grass Medical
P-1000型微电极拉制仪Sutter InstrumentsP-1000
Axon Digidata 1550低噪声数据采集系统Molecular Devices
低通贝塞尔滤波器Warner Instrument Corp.LPF-8
左手型微操纵器Siskiyou Corp.MX1641/45DL
右手型微操纵器Siskiyou Corp.MX1641/45DR
单通道运动控制器Siskiyou Corp.MC100e
交叉滚柱微操纵器Siskiyou Corp.MX1641R该部件被加装至左、右手型微操纵器的Z轴，以实现Z轴的电机驱动。这种定制配置比购买四轴电机驱动微操纵器更经济且体积更小，同时允许我们使用一个控制器同时控制两个微操纵器
所有化学品均购自Fisher，但以下除外：
BTSToronto Research ChemicalsB315190
CTXAlomone LabsC-270
4-Di-2-AspMolecular ProbesMolecular Probes已不再作为独立公司存在，现通过Fisher订购

参考文献

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