本文所述方案利用小鼠levator auris longus（LAL）肌肉，在神经肌肉接头处记录自发性和神经诱发的突触后电位（电流钳）和电流（电压钳）。该技术的使用可为正常和疾病状态下突触传递机制提供关键见解。
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本文内容
摘要
摘要
本方案描述了一种在电流钳和电压钳条件下记录神经肌肉接头突触传递的技术。ex vivo 实验采用耳长提肌（levator auris longus，LAL），因其为薄层肌肉，便于在运动终板处进行微电极穿刺，并可清晰观察神经肌肉接头。该方法可用于记录自发性微小终板电位和电流（mEPPs 和 mEPCs）、神经诱发的终板电位和电流（EPPs 和 EPCs），以及运动终板的膜特性。通过该方法可获得的结果包括量子含量（QC）、囊泡释放位点数量（n）、囊泡释放概率（prel）、突触易化与抑制，以及肌膜时间常数（τm）和输入电阻。将该技术应用于人类疾病的小鼠模型，有助于揭示疾病状态下的关键病理特征，并助力发现新的治疗策略。通过对单个突触进行完全的电压钳制，该方法提供了目前可实现的最详尽的突触传递分析之一。
引言
研究神经肌肉接头处的突触传递有助于揭示神经系统与骨骼肌系统之间的动态关系，是研究突触生理学的理想模型。levator auris longus（LAL）是一种薄层肌肉，便于清晰观察其神经肌肉接头。已有文献报道指出，利用LAL研究突触药物和毒素具有显著便利性，并已对其骨骼肌纤维类型特征进行了表征1,2。大量研究已采用LAL来探讨神经肌肉生理学特性3,4,5,6,7,8。在电生理学研究中，能够方便地观察LAL的神经肌肉接头，有助于将微电极精确放置于运动终板区域，显著减少记录突触传递时的空间钳制问题。肌肉膜特性（如膜时间常数（τm）和输入电阻（Rin））的电流钳记录可轻松获得。此外，这些特性可在记录神经肌肉传递所用的同一肌纤维上进行测量，从而实现突触功能与肌膜特性之间的直接比较。对这些数据的分析可为多种神经肌肉疾病及活动状态改变的物理机制提供关键见解。
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方案
所有动物实验均按照莱特州立大学动物护理与使用委员会的规定进行。
1. 小鼠安乐死
- 在通风橱中，将小鼠放入一个密闭的玻璃麻醉室。
- 通过吸入给予小鼠致死剂量的异氟烷（饱和浓度，约 25%）。将小鼠留在麻醉室中，直至观察不到呼吸。
- 将小鼠从麻醉室中取出，并采用颈椎脱位作为辅助安乐死方法。
2. 去除头部、颈部和背部背面的毛发
- 使用电动剃须刀剃除小鼠头部、颈部和背部背侧表面的大部分毛发。同时，剃除左耳周围及耳部的毛发。
注意：剃除耳周皮肤毛发时需小心操作，皮肤可能被剃须刀刀片夹住，从而损伤下方的肌肉组织。 - 用棉签将脱毛膏涂抹于已剃毛的区域，以去除残留的毛发。等待约1分钟，然后使用挤压洗瓶中的水冲洗脱毛膏，再用棉签清除残留的脱毛膏或毛发，并轻拍皮肤使其干燥。
3. 去除皮肤以暴露耳长提肌（Levator Auris Longus）
- 在体视解剖显微镜下，于小鼠肩胛骨水平的背部做一小切口（深度仅需穿透皮肤即可）。使用显微解剖剪刀沿 图1A-B 所示路径剪开皮肤。
- 使用精细镊子（如....
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结果
图8展示了来自一只12周龄野生型R6/2小鼠的一条LAL肌纤维在电流钳模式下记录的电流脉冲（图8A）和电压反应（图8B）的示例。微小终板电位（mEPPs）的存在表明这些记录来自运动终板。记录是在正常的生理盐溶液中获得的。这些电流钳记录可用于分析该肌纤维的输入电阻（Rin）和膜时间常数（τm）16,19,20。
在电压钳制条件下记录到的一个EPC和两个mEPC的代表性结果如图9A所示。EPC.......
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讨论
本文介绍了小鼠LAL肌的制备及其在电流钳或电压钳条件下用于神经肌肉传递测量的方法。分离LAL肌时需注意几个关键点。清除肌肉上多余的结缔组织有助于电极穿刺，因为在放置电极进行穿刺时，结缔组织可能钩住电极。然而，仅应去除容易剥离的结缔组织，以尽量减少损伤肌肉的风险。神经的分离操作需格外小心，因为神经非常脆弱。为避免损伤神经，建议保留部分周围组织附着在神经末端，以便插入固定针将神经固定于培养皿中。此外，在放置神经刺激器时应注意避免压伤神经。最后，电极穿刺肌纤维的顺序也很重要。钝电极较难穿刺，应首先插入。如果先插入锐利电极，随后插入钝电极时可能会将肌纤维推下，导致膜尚未被刺穿，甚至可能使锐利电极脱出肌纤维，从而需要再次用锐利电极穿刺，造成不必要的膜损伤。此外，所使用的放大器若能同时测量通过电极的电流和电压，则有助于观察到膜电位的负向偏转，从而确认电极已成功穿刺进入肌纤维。
LAL 的一个有益特征是能够同时移除双侧肌肉。这对于在同一动物体内进行电生理学和分子生物学实验非常有利。通过基本遵循本文所述的方案并稍作调整即可实现这一操作。在执行第1至第3节的所有步骤时，需同时对右侧和左侧进行所述操作.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 Mark M. Rich 博士和 Daniel Miranda 提供的编辑意见，感谢 Ahmad Khedraki 在建立本技术过程中给予的帮助，以及 Wright 州立大学提供的经费支持（A.A.V. 的启动资金）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 奥林巴斯复合显微镜 | Olympus | BX51WI | |
| 10倍物镜 | Olympus | UMPLFLN10XW | |
| 40倍物镜 | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 硼硅酸盐玻璃 | Sutter Instruments | BF150-86-7.5 | |
| CCD相机 | Santa Barbara Instruments Group | ST-7XMEI | |
| Mater-9脉冲发生器 | AMPI | ||
| Iso-flex刺激隔离器 | AMPI | ||
| pCLAMP 10数据采集与分析软件 | Molecular Devices | 1-2500-0180 | |
| 同心双极电极 | FHC | CBDSH75 | |
| 球关节操纵器 | Narishige | ||
| 非金属注射器，34号针头 | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| 尼康体视显微镜 | Nikon | SMZ800N | |
| 5号镊子 | Fine Science Tools | ||
| 弹簧剪刀 | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| 2号镊子 | Roboz | RS-5Q41 | |
| 显微解剖剪刀 | Roboz | RS-5912SC | |
| Sylgard 184硅酮弹性体试剂盒 | Dow Corning | 2404019862 | |
| 脱毛膏 | Nair | ||
| Grass SD9刺激器 | Grass Medical | ||
| P-1000型微电极拉制仪 | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Axon Digidata 1550低噪声数据采集系统 | Molecular Devices | ||
| 低通贝塞尔滤波器 | Warner Instrument Corp. | LPF-8 | |
| 左手型微操纵器 | Siskiyou Corp. | MX1641/45DL | |
| 右手型微操纵器 | Siskiyou Corp. | MX1641/45DR | |
| 单通道运动控制器 | Siskiyou Corp. | MC100e | |
| 交叉滚柱微操纵器 | Siskiyou Corp. | MX1641R | 该部件被加装至左、右手型微操纵器的Z轴，以实现Z轴的电机驱动。这种定制配置比购买四轴电机驱动微操纵器更经济且体积更小，同时允许我们使用一个控制器同时控制两个微操纵器 |
| 所有化学品均购自Fisher，但以下除外： | |||
| BTS | Toronto Research Chemicals | B315190 | |
| CTX | Alomone Labs | C-270 | |
| 4-Di-2-Asp | Molecular Probes | Molecular Probes已不再作为独立公司存在，现通过Fisher订购 |
参考文献
- Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82 (1), 83-88 (1987).
- Erzen, I., Cvetko, E., Obreza, S., Angaut-Petit, D.
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重印与许可
