巨噬细胞内生长的定量分析是一种快速可靠的毒力评估方法 利什曼原虫 寄生虫

摘要

所有致病性利什曼原虫（Leishmania）物种均在其脊椎动物宿主的巨噬细胞内寄居并增殖。本文介绍一种在体外培养的小鼠骨髓来源巨噬细胞中感染利什曼原虫（Leishmania）并精确量化其胞内生长动力学的实验方案。该方法适用于研究影响宿主-病原体相互作用及利什曼原虫（Leishmania）毒力的各个独立因素。

摘要

生命周期 利什曼原虫，利什曼病的致病原，在昆虫和脊椎动物宿主内分别交替存在于前鞭毛体和无鞭毛体阶段。尽管利什曼病的临床症状因感染物种不同而差异显著，可表现为良性的皮肤病变，也可发展为致命性的内脏疾病形式，所有 利什曼原虫 在生命周期的脊椎动物阶段，该物种存在于宿主巨噬细胞内。 利什曼原虫 因此，感染性直接与其侵入、在巨噬细胞内寄生泡（PVs）中存活和复制的能力相关。因此，评估寄生虫在细胞内复制的能力是测定其毒力的可靠方法。利用动物模型研究利什曼病的发展过程耗时长、繁琐且常具挑战性，尤其是针对具有重要致病意义的内脏型利什曼病。本文介绍一种用于追踪细胞内寄生虫发育过程的方法 利什曼原虫 在骨髓来源的巨噬细胞（BMMs）中。感染后72至96小时内，每隔24小时测定细胞内寄生虫数量。该方法可可靠地确定多种遗传因素对 利什曼原虫 毒力。例如，我们展示了如何通过单等位基因缺失的 利什曼原虫 线粒体铁转运蛋白基因（LMIT1) 损害了 Leishmania amazonensis 突变菌株 LMIT1/ΔLmit1 在BMMs内生长，表现出与野生型相比毒力显著降低。该实验方法还可精确控制实验条件，能够单独调控各个因素，以分析不同因素（营养物质、活性氧等）的影响。 等等因此，适当地实施和量化BMM感染研究为传统的动物模型研究提供了一种无创、快速、经济、安全且可靠的替代方法。

引言

利什曼病是一类由利什曼原虫属（Leishmania）原生动物寄生虫物种引起的人类疾病，其临床表现具有广泛的谱系 利什曼原虫约有1200万人目前感染了 利什曼原虫 全球范围内，超过3.5亿人面临风险。该疾病的病理特征取决于 利什曼原虫 物种和宿主因素，并且症状从无害的自愈性皮肤病变到致命的内脏利什曼病不等。若不加以治疗，内脏利什曼病具有致死性，其致死率在原虫寄生虫感染所致的人类疾病中仅次于疟疾¹尽管疾病病理和症状存在广泛差异，所有 利什曼原虫 物种具有双宿主生活周期，分别在昆虫和脊椎动物宿主体内交替进行前鞭毛体和无鞭毛体阶段。在脊椎动物体内， 利什曼原虫 靶向宿主巨噬细胞进行侵袭，并诱导寄生泡（PVs）的形成。寄生泡是一种具有吞噬溶酶体特性的酸性区室，其中高毒力的无鞭毛体形式进行复制。在慢性感染期间，无鞭毛体可在宿主组织中长期存在，并可传递给未感染的白蛉，从而完成传播循环。因此，在人类疾病发展的背景下，无鞭毛体是最关键的 利什曼原虫 生命周期形态²研究无鞭毛体在巨噬细胞吞噬泡内复制的机制对于理解 利什曼原虫 毒力^3,4,5

方案

所有实验操作均按照美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理和使用指南》中的建议进行，并已获得马里兰大学动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。第1至第4节中所述的所有步骤均须在生物安全柜内的层流环境中无菌操作。在整个实验过程中操作活体Leishmania寄生虫时，应使用个人防护装备并格外小心。

1. 骨髓来源巨噬细胞（BMMs）的分离与分化^8,30,31

1. 第0天： 处死4至6周龄雌性小鼠 C57BL/6 或 BALB/c 小鼠置于一氧化碳中₂ 将动物处死并通过颈椎脱位确认死亡。将剪刀和镊子浸泡于70%乙醇中以确保其无菌。用70%乙醇喷洒手套，以保证在骨髓细胞分离过程中全程无菌操作。
2. 将安乐死的小鼠固定在解剖板上，用大头针固定其前肢，并用70%乙醇充分喷洒消毒。
3. 在髋关节附近用剪刀做一个约1厘米的小切口。将剪刀小心插入皮下，分离下方肌肉，并环绕髋关节一周剪开皮肤。
   注意：可旋转解剖板以更好地接触髋关节。
4. 小心地将腿部皮肤向脚踝方向剥离并取下。在踝关节处或低于踝关节的位置切断足部，注意务....

结果

利什曼原虫 具有两种感染形式——在培养物的稳定期由前循环型前鞭毛体分化而来的前鞭毛体，以及作为细胞内阶段的无鞭毛体（图1）。在某些情况下 利什曼原虫 物种如 L. amazonensis无血清培养条件下，通过将前鞭毛体细胞置于较低pH（4.5）和较高温度（32 °C）环境中，也可诱导其分化为无鞭毛体，该条件类似于骨髓来源巨噬细胞吞噬泡（BMM PVs）内的微环境。^8,34仅利什曼原虫的前鞭毛体或无鞭毛体形式 利什曼原虫 能够诱导PVs的形成，并在被宿主巨噬细胞吞噬后在细胞内进行复制³⁵未分化的对数期前鞭毛体无致病性，且无法促进寄生泡的形成 (图2).

讨论

上述BMM感染实验所产生的定量数据，可使研究人员在相对较短的时间内（最长2周，而传统方法需2个月）获得感染率，并可靠地确定毒力特性的变化。 体内 实验）。该方法依赖于DNA特异性染料DAPI，可特异性地染色巨噬细胞和寄生虫的细胞核，从而实现对感染细胞的快速鉴定与定量。相比之下，其他染料（如吉姆萨染液）会以不同的强度结合多种不同的细胞组分，使显微观察分析变得复杂³⁷使用DAPI可识别细胞内寄生虫，并将其与细胞结构清晰区分开（仅宿主细胞的细胞核会被染色，且其大小比寄生虫细胞核大数个数量级），从而更简便、快速地对感染进行定量分析。

与任何实验方法一样，本方法存在一些局限性，并包含若干需要谨慎操作的关键步骤。In vivo 条件下，Leishmania 感染在吞噬作用发生前会引发复杂的先天免疫应答，从而决定感染的最终进程³⁸。因此，实验设计中模型小鼠品系的选择至关重要。本方案中使用的 C57BL/6 和 BALB/c.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6孔细胞培养板	Cellstar	657160
腺嘌呤	Acros Organics	AC147440250
气溶胶屏障移液器吸头（100–1000 μL）	Fisherbrand	02-707-404
气溶胶屏障移液器吸头（20–200 μL）	Fisherbrand	02-707-430
气溶胶屏障移液器吸头（2–20 μL）	Fisherbrand	02-707-432
Bard-Parker肋纹碳钢手术刀片 #10	Aspen Surgical	371110
BD鲁尔锁头10 mL注射器	Becton Dickinson (BD)	309604
BD PrecisionGlide针头，25G	Becton Dickinson (BD)	305124
细胞培养皿 35 mm × 10 mm	Cellstar	627 160
细胞培养瓶	Cellstar	660175
盖玻片：12 mm圆形	Fisherbrand	12-545-80
DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐）	Invitrogen	D1306
D-生物素	J.T. Baker	C272-00
EDTA	Sigma Aldrich	EDS
200度乙醇	Pharmco-AAPER	111000200
Falcon 100 mm × 15 mm 非组织培养处理聚苯乙烯培养皿	Corning	351029
胎牛血清	Seradigm	1500-500
Ficoll400	Sigma Aldrich	F8016
荧光显微镜	Nikon	E200
山羊抗小鼠IgG Texas Red	Invitrogen	T-862
山羊抗兔IgG AlexaFluor488	Invitrogen	A-11034
血红素	Tokyo Chemical Industry Co. LTD	H0008
HEPES（1 M）	Gibco	15630-080
Isoton II稀释液	Beckman Coulter	8546719
L-谷氨酰胺	Gemini	400-106
Medium 199（10倍浓缩）	Gibco	11825-015
丙酮酸钠（100 mM）	Gibco	11360-070
多聚甲醛	Alfa Aesar	43368
青霉素/链霉素	Gemini	400-109
磷酸盐缓冲液（不含钙镁）	ThermoFisher	14200166
聚丙烯圆锥形离心管 15 mL	Cellstar	188 271
聚丙烯圆锥形离心管 50 mL	Cellstar	227 261
ProLong Gold抗荧光淬灭封片剂	ThermoFisher	P36930
大鼠抗小鼠Lamp-1抗体	发育研究杂交瘤库	1D4B
重组人M-CSF	PeproTech	300-25
Reichert Bright-Line  血细胞计数板	Hausser Scientific	1492
RPMI 1640培养基（1倍浓度）	Gibco	11875-093
表面活性剂Triton X-100	Millipore Sigma	TX1568-1
台盼蓝	Sigma Aldrich	T8154
精细剪刀，4 1/2"	VWR	82027-582
解剖镊，细尖头	VWR	82027-386
显微镜载玻片	VWR	16004-368
Z1库尔特颗粒计数器，双阈值	Beckman Coulter	6605699