基于蜕皮激素受体的单基因开关用于稳健、可逆且泄漏极低的外源基因精确表达

摘要

本文介绍了一种利用虫蜕激素类似物特普呋酯处理，通过pEUI(+)单基因开关调控外源基因表达的实验方案。

摘要

在生物学和临床研究中，精确控制外源基因表达具有重要意义。然而，由于目前使用的基因开关为二元系统，需要将两个治疗性表达单元同时导入单个细胞，限制了该系统在基因治疗中的实际应用。为了简化外源基因表达系统，我们构建了一种名为 pEUI(+) 的基因开关，其将完整的外源基因表达模块整合于单一载体中。该新型单组分基因开关包含 GAL4 DNA 结合域和修饰型 EcR（GvEcR），后者由最小 VP16 激活域与 GAL4 DNA 结合域融合而成，以及修饰型黑腹果蝇（Drosophila）蜕皮激素受体（EcR），能够以时间和剂量依赖的方式对化学诱导剂产生高度响应。pEUI(+) 载体有望成为提升生物学研究和临床前研究中外源基因表达调控能力的有力工具。本文提供了利用虫菊酯类化合物特苯唑啶（tebufenozide, Teb）调控 pEUI(+) 载体介导的瞬时和稳定外源基因表达的详细实验方案，并分享了将 Teb 作为化学诱导剂使用的重要操作指南。

引言

已有多种不同的基因开关被用于精确调控细胞培养和动物模型中的转基因表达，其效果各不相同^1,2,3。理想的基因开关系统应满足若干严格标准，包括：对转基因实现精确的定向表达；对诱导剂具有剂量和时间依赖性的响应能力；启动子的本底泄漏表达极低；通过去除诱导剂可逆转转基因的激活状态；以及诱导剂对细胞系和实验动物的毒性处于可耐受水平^1,2,3。目前已开发并应用了多种小分子诱导剂，包括四环素^4,5、雷帕霉素^6,7,8、米非司酮^9,10和蜕皮酮^11,12,13,14。通常，这些系统需要至少两个质粒，包含两个或三个独立的表达单元：其中一个或两个质粒构成调控元件（诱导质粒），其表达产物可结合小分子诱导剂并获得转录活性；另一个质粒（效应质粒）则携带由特定调控DNA区域控制的转基因，该区域允许诱导剂结合的调控元件与其结合并启动转录。此类双元系统的主要缺点在于必须同时将两种载体（诱导质粒和效应质粒）导入靶细胞。在瞬时转基因表达实验中，共转染两个质粒不可避免地导致细胞群体中出现仅转染了诱导质粒或效应质粒的单转染细胞，或两者转染比例不均的共转染细胞。此外，构建稳定表达细胞系时，双元系统至少需要进行两轮抗生素筛选，耗时且操作繁琐。因此，将转基因表达与调控所需的所有组分整合到单一载体中，是理想策略，可确保所有必需元件在单个细胞内同时表达，并通过添加小分子诱导剂实现对转基因表达的调控。

为了克服二元基因开关的局限性，我们近期开发了一种单一基因开关，该开关基于Drosophila melanogaster蜕皮激素受体（EcR）的基因可诱导系统¹⁵。当蜕皮激素与其受体EcR/超螺旋（ultraspiracle, USP）异源二聚体结合后，可介导基因表达，进而促使EcR结合到DNA调控元件上^3,11。脊椎动物视黄醇X受体（retinoid X receptor, RXR）是昆虫USP的同源蛋白，可与EcR结合形成具有活性的转录激活复合物¹⁶。因此，为了在脊椎动物细胞或组织中实现外源基因的靶向表达，必须同时共表达EcR和RXR，再通过蜕皮激素或其激动剂进行诱导。由于基于EcR的基因开关的异源二聚体特性可能受到内源性RXR水平的影响，Padidam 等. 将EcR的DNA结合域和激活域替换为异源的GAL4 DNA结合域，并融合单纯疱疹病毒蛋白vmw65（VP16）的激活域与EcR的配体结合域，从而使其不再响应内源性RXR，并形成同源二聚体以获得转录活性¹⁷。基于EcR的基因开关进一步通过构建一种嵌合蛋白得以优化，该蛋白由最小VP16激活域与GvEcR融合而成，在无蜕皮激素激动剂Teb存在时，该蛋白形成同源二聚体并定位于细胞质中^16,18。当Teb与GvEcR结合后，GvEcR的亚细胞定位由细胞质转移至细胞核，识别由斑马鱼E1b最小启动子与十段串联重复的上游激活序列（UASs）构成的杂合启动子，从而启动目的基因的转录¹⁶。

为了简化先前报道的基于EcR的基因开关^16,18，我们将该系统的二元元件整合到一个单一载体中，使其包含激活转基因表达所需的全部元件，并将新构建的载体命名为pEUI(+)（GenBank登录号：KP123436，图1A）¹⁵。响应GvEcR驱动元件（以下简称驱动元件）的效应元件包含十个串联的UAS重复序列，其后接一个E1b最小启动子，再连接一个含EcoRI、PmlI、NheI、BmtI、AfeI和AflII识别序列的多克隆位点（MCS）（图1B）。此外，为了便于转染细胞的筛选，在驱动元件和效应元件之间插入了由SV40启动子驱动的嘌呤霉素N-乙酰转移酶（PAC）基因，以维持稳定细胞系的建立（图1）。

我们描述了一种使用pEUI(+)进行转基因表达瞬时和稳定调控的详细方案。此外，我们还提供了成功使用Teb作为蜕皮素激动剂的详细操作说明。

方案

1. 转基因亚克隆

1. 选择 pEUI(+) 载体多克隆位点（MCS）中合适的限制性内切酶识别位点（或多个位点），并将目的基因以正确方向亚克隆至该载体中（图1).
   注意： EGFP 或带 FLAG 表位标签的锚蛋白重复序列结构域 13A（ANKRD13A) 转基因通过T4 DNA聚合酶，采用序列与连接无关克隆法插入pEUI(+)载体的EcoRI位点¹⁹.
2. 用EcoRI在37 °C下将pEUI(+)线性化1小时。将50 ng/µL线性化的pEUI(+)与40 ng/µL PCR扩增产物混合 EGFP 或 ANKRD13A 在室温（RT）下与T4 DNA聚合酶（1 U）反应1分钟，随后冰上孵育10分钟。将10 µL反应混合物直接加入100 µL DH10B感受态细胞中，进行后续转化实验。
   注意：尽管已在 pEUI(+) 的多克隆位点（MCS）中添加了多个限制性酶切位点（图1B），我们建议使用无缝克隆技术将目的基因亚克隆至EcoRI位点^19,20.
3. 通过测序验证插入片段，然后使用适用于转染的DNA纯化试剂盒纯化DNA。

2. 瞬时转染与Teb处理

1. 准备四个细胞培养皿（直径 60 mm），每个培养皿中加入 5 mL 含 5 - 10% 胎牛血清（FBS）和抗生素（100 U/mL 青霉素，100 µg/mL 链霉素）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），并接种刚传代的 HEK293 细胞。此后，"细胞培养基"或简称为"培养基"均指添加了 FBS 和抗生素的 DMEM。将 HEK293 细胞在 37 °C 条件下培养。
2. 使用 3 µL 转染试剂，将 1 µg 纯化的 DNA 转染至密度为 50 - 60% 的 HEK293 细胞中。将转染试剂加入含有 DNA 的 200 µL 稀释液（不含 FBS 和抗生素的 DMEM）中。反应混合物在室温下孵育 30 分钟后，将其加入培养皿中的 HEK-293 细胞中。使用两个培养皿进行转染，另两个不作处理作为对照。
3. 转染后 12 - 24 小时，向其中一个转染样本和一个未转染对照样本中加入 Teb（终浓度为 0.2 - 10 µmol）。其余两个样本不作处理，作为实验对照。
   注意：Teb 储存液（50 mM 溶于二甲基亚砜）可根据实验参数，在加入细胞前用细胞培养基、DMEM 或磷酸盐缓冲液（PBS）稀释至适当浓度。然而，由于 Teb 在水溶液中溶解度较低，应避免在培养基中配制高浓度的主混合液；建议将原有完全培养基完全更换为含所需浓度 Teb 的新鲜培养基。
4. 将经 Teb 处理和未处理的细胞在 37 °C 下继续培养 12 - 48 小时。
5. 若使用 EGFP 插入片段，则在荧光显微镜下分析 EGFP 表达（图 2）。否则，收集细胞进行免疫印迹分析。
   1. 进行免疫印迹分析时，用预冷的 PBS 洗涤细胞两次，然后用细胞刮刀刮下细胞。
   2. 为收集细胞，将样品在 15 mL 圆锥形离心管中以 21,000 x g 离心 2 分钟，温度为 18–25 °C（室温）。
   3. 完全弃去 PBS 后，向沉淀中加入 0.5 mL 预冷的哺乳动物蛋白提取试剂（M-PER）以及蛋白酶抑制剂（5 µL 100x 蛋白酶抑制剂混合液），适用于在 60 mm 培养皿中培养的细胞。
   4. 通过多次移液重悬细胞，然后在 18 - 25 °C（室温）下孵育 15 分钟。
   5. 在 4 °C 下以 21,000 x g 离心 10 分钟，收集细胞裂解物。
   6. 将上清液转移至新的 1.5 mL 微量离心管中。
   7. 使用适当的抗体，按照标准操作流程对上清液进行免疫印迹分析。

3. 通过pEUI(+)基因开关的基因组整合构建稳定的HEK293细胞系

1. 使用15 - 30 µL转染试剂，将5 - 10 µg纯化的含目的基因的pEUI(+)质粒转染至直径为90 mm、融合度为50 - 60%的HEK293细胞培养皿中。将转染试剂加入含有DNA的500 µL稀释液（不含FBS和抗生素的DMEM）中。室温孵育反应混合物30分钟后，将其加入培养皿中的HEK-293细胞中。
2. 转染后，在非选择性培养基（不含嘌呤霉素）中于37 °C继续培养转染细胞24 - 48小时，使其生长并表达嘌呤霉素抗性基因产物。
3. 通过胰蛋白酶消化法将细胞从培养皿中解离。弃去培养基后，用预热的PBS（37 °C）冲洗转染细胞，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA），于37 °C孵育1分钟。加入预热的培养基（10 mL，37 °C）以终止胰蛋白酶/EDTA反应，随后用细胞刮刀收集细胞，并在15 mL锥形管中以21,000 × g离心2分钟（温度18-25°C）。
4. 将转染细胞重悬于50 mL预热的培养基（37 °C）中，取10 mL细胞悬液接种至新的90 mm细胞培养皿中。于37 °C培养至细胞融合度达50 - 60%，再进行嘌呤霉素处理（通常需要约24 - 48小时）。
5. 在添加了3 µg/mL嘌呤霉素的细胞培养基中，于37 °C培养转染细胞3 - 4周。筛选期间，每2 - 3天更换一次含嘌呤霉素（3 µg/mL）的培养基，以维持筛选压力。当细胞完全融合时，按照步骤3.3 - 3.4的操作进行传代，使用含嘌呤霉素的培养基。如无需保留，弃去培养基中剩余的细胞。
   注意：嘌呤霉素筛选条件需根据不同细胞类型通过实验确定。本实验中使用3 µg/mL嘌呤霉素，足以诱导未转染的HEK293细胞死亡。
6. 使用克隆环挑取单个克隆的细胞，并按照制造商说明书操作。
   1. 弃去细胞培养基。用预热（37 °C）的PBS冲洗培养板两次，以去除漂浮细胞。
   2. 用无菌镊子将克隆环置于单个克隆上方。
   3. 向每个克隆环内加入0.2 mL 0.35%胰蛋白酶/EDTA。
   4. 将培养皿于37 °C孵育1分钟，直至细胞脱落，然后向各克隆环中加入数滴预热（37 °C）的培养基。
   5. 将每个克隆环中的细胞转移至6孔板的独立孔中，每孔加入2 mL培养基和1 µg/mL嘌呤霉素。
      注意：当细胞融合后，可扩大培养规模。此时可建立单克隆细胞系。
7. 在添加1 µg/mL嘌呤霉素的细胞培养基中维持单个克隆的培养。
8. 通过检测各克隆对Teb处理（终浓度10 µM）24小时的敏感性来验证其特性。通过免疫印迹法分析目的基因的表达水平，评估克隆对Teb的响应性。选择理想的克隆（或多个克隆）。在分析目的基因诱导水平前，将经Teb处理和未处理的样品在培养基中于37 °C培养12 - 48小时。目的基因的表达水平可通过免疫印迹法测定，具体操作参照步骤2.5.1 - 2.5.7。

4. Teb 的耗竭

1. 通过将含Teb的细胞培养基替换为不含Teb的培养基，终止Teb刺激。
   注意：建议在不先将细胞重新接种至新培养皿的情况下更换培养基。残留的Teb似乎会附着在塑料培养皿上，从而引起转基因的强背景表达。在将细胞重新接种到新的培养板之前，需用培养基或PBS对收获的细胞冲洗数次。
   1. 通过胰酶消化法使细胞从培养皿中解离。弃去含Teb的培养基后，用预热的PBS（37 °C）冲洗Teb刺激后的细胞两次，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶/EDTA，于37 °C孵育1分钟。加入预热的不含Teb的培养基（10 mL，37 °C）终止胰酶/EDTA反应，然后使用细胞刮刀收集细胞，并在15 mL锥形管中以21,000 × g离心2分钟（18–25 °C）。
   2. 将细胞重悬于50 mL预热的不含Teb的培养基（37 °C）中，取5 mL细胞悬液分别接种至三个新的60 mm细胞培养皿中。于37 °C培养，分别在24、48和72小时后进行后续操作。
   3. 在不同时间点收集细胞，并通过免疫印迹法检测转基因的表达水平。
      注意：在此实验条件下，当细胞在不含Teb的培养基中培养约3天后，转基因表达降至无法检测水平（图3）。转基因表达水平的测定可参照步骤2.5.1–2.5.7进行免疫印迹分析。

结果

基于 GvEcR 的单基因开关如图 1A所示。pEUI(+) 载体经优化，可通过 Teb 处理实现转基因的调控表达。pEUI(+) 的效应区域包含 10xUAS 和 E1b 最小启动子，其后为含有 EcoRI、PmlI、NheI、BmtI、AfeI 和 AflII 限制性内切酶识别位点的多克隆位点（MCS）。在 MCS 后方添加了 SV40 poly(A) 信号（图 1B）。在 pEUI(+) 的驱动区域和效应区域之间插入了一个PAC基因，以赋予嘌呤霉素抗性。

为了评估 pEUI(+) 的活性及其渗漏程度，我们进行了亚克隆 EGFP 将片段插入MCS的EcoRI位点（pEUI(+)-EGFP），将质粒构建体瞬时转染至HEK293细胞，并以不同浓度的Teb处理24小时 (

讨论

使用双元基因表达开关的主要缺点是需要同时将两个独立的质粒（驱动质粒和效应质粒）递送至靶细胞。这可能导致质粒分布不均，从而引起开关对诱导剂的反应不一致^1,2,3。双载体系统的另一个不足之处是，至少需要进行两轮抗生素筛选才能鉴定出有潜力的细胞系。因此，长期以来生物学研究一直期望获得由单一单元组成的可诱导基因表达盒。pEUI(+) 单一转基因表达开关包含于单个载体中，该载体配备了转基因激活所需的所有调控元件。因此，亚克隆至 pEUI(+) 中的转基因的诱导水平取决于瞬时转染实验中转染的DNA量以及化学诱导剂的剂量。此外，我们通过构建含有单拷贝 ANKRD13A 转基因的稳定细胞系进一步验证了 pEUI(+) 载体的可用性¹⁵。所建立的细胞系对 Teb 处理表现出高度敏感性（图3）。综上所述，pEUI(+) 具有高敏感性、可逆性、低泄漏...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
pEUI(+)	TransLab		专利许可已转让给 TransLab 公司。
Gene-Fect 转染试剂	TransLab	TLC-001
HEK293	ATCC	CRL-1573
虫酰肼	Fluka	31652
克隆环	Sigma	CLS31668
嘌呤霉素	Corning	58-58-2
抗生素	Gibco	15240-062
胰蛋白酶-EDTA	Welgene	LS015-01
DMEM 培养基	Welgene	LM001-05
胎牛血清	Welgene	S001-01
细胞培养皿	SPL life science	11090
小鼠 FLAG M2 抗体	Sigma	F3165
抗 α-微管蛋白抗体	Calbiochem	CP06
克隆环	Sigma	CLS31668
NucleoBond Xtra Midi 质粒中提试剂盒	Macherey-Nagel	740410.1
M-PER 哺乳动物蛋白 提取试剂	Thermo Fisher	78505
100X 蛋白酶抑制剂混合物 III	T&I	BPI-9200