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方法文章

西方玉米根虫（Diabrotica virgifera virgifera）胚胎的显微注射用于种系转化或CRISPR/Cas9基因组编辑

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DOI：

10.3791/57497

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2018年4月27日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology and Plant Pathology, North Carolina State University

本文内容

摘要

本文介绍了收集和显微注射前细胞期西方玉米根虫胚胎的实验方案，旨在进行功能性基因组学检测，如种系转化和CRISPR/Cas9基因组编辑。

摘要

西方玉米根虫（WCR）是玉米的重要害虫，以其能够快速适应害虫管理策略而著称。尽管RNA干扰（RNAi）已被证明是研究WCR生物学的有力工具，但它也存在局限性。具体而言，RNAi本身是瞬时的（即不会导致相关表型的长期孟德尔遗传），并且需要已知靶基因的DNA序列。如果感兴趣表型由保守性较差甚至全新的基因控制，则后一限制尤为突出，因为识别有效的靶点将极具挑战性，甚至不可能。因此，应通过开发可用于创建稳定突变品系并实现对WCR基因组进行序列无关性筛查的新方法，来扩充WCR基因组工具箱中的工具种类。本文详细描述了采集和显微注射核酸至WCR合子前胚胎的方法。尽管本文所述方案旨在创建转基因WCR，但使用相同的流程也可进行CRISPR/Cas9基因组编辑，唯一的区别在于注射入胚胎的溶液成分不同。

引言

西方玉米根虫（WCR），Diabrotica virgifera virgifera是玉米的重要害虫1有趣的是，西部玉米根虫（WCR）似乎比大多数农业害虫更快地突破防控措施，因为它们不仅在生理上产生适应，还在行为上发生改变。2,3,4,5,6近十年来，RNA干扰（RNAi）作为一种强大的功能基因组学工具，已被研究用于玉米根萤叶甲（WCR）的潜在防控方法。7,8，并且还被用作研究基因功能的方法9然而，尽管在其他物种中RNAi通常通过显微注射双链RNA（dsRNA）来实现，但在西部玉米根虫（WCR）中基于注射的RNAi却较为罕见。事实上，关于WCR中RNAi的研究报道仅有少数几例 通过 将dsRNA显微注射到WCR中9原因是WCR能够实现高水平的基因敲低 通过 摄入dsRNA7,10甚至可通过向母体喂食dsRNA来研究胚胎效应11. 尽管该方法使西部玉米根虫成为功能基因组学分析的理想对象 通过 RNAi 技术的应用已减缓了该物种胚胎显微注射方法开发的进展。

尽管RNAi技术具有强大功能，但也存在一些局限性。例如，并非所有基因对RNAi的响应程度相同。这种变异性可能使功能基因组学实验结果的解读变得更加困难。此外，RNAi效应是短暂的，无法产生可遗传的突变。相比之下，生殖系转化作为一种功能基因组学工具，可通过将带有标记的转座元件插入基因组，从而产生可遗传的突变via插入标记的转座元件到基因组中12,13。这使得生殖系转化成为构建突变品系以用于长期遗传学研究的理想工具。此外，通过向突变基因组中导入基因的功能性拷贝，转化技术还可用于突变的挽救14。更重要的是，生殖系转化是多种分子遗传学技术的基础。除了用于基因功能的敲除和/或挽救外，生殖系转化还可应用于增强子捕获15、基因捕获16、基于Gal4的异位表达17以及全基因组范围的诱变18。

最近，人们开发出能够实现复杂基因组编辑的工具 。这些工具包括转录激活样效应因子核酸酶（TALEN）以及CRISPR/Cas9核酸酶系统19,20。这些新工具的优势在于，研究人员几乎可以在任意基因组中的几乎任何位置诱导产生双链DNA断裂。一旦发生断裂，细胞可通过非同源末端连接方式进行修复，从而在靶向基因中引入缺失或插入；或者通过同源定向修复方式进行修复，在提供工程化修复模板的情况下，可实现整个基因或基因区域的替换21,22。然而，这些方法需要将DNA、RNA和/或蛋白质显微注射到早期胚胎中。

重要的是，与用于RNAi的dsRNA不同，用于种系转化和基因组编辑的核酸和蛋白质难以穿过细胞膜。因此，质粒DNA、mRNA和/或蛋白质的显微注射必须在合胞体胚盘阶段进行即 在昆虫胚胎细胞化之前）。这使得注射时机成为一个关键因素。例如，在 黑腹果蝇，胚胎需要在产卵后两小时内进行注射12因此，建立高效的西部玉米根虫胚胎显微注射方案时，必须综合考虑雌虫产卵的最佳条件以及收集足量合子期前胚胎的有效方法。

为了将多种分子遗传学工具应用于西部玉米根虫（WCR）的生物学研究，需要建立收集和显微注射WCR合子前胚胎的方法。本文提供了详细的实验步骤以及实用技巧，以帮助其他研究者在WCR研究中应用基于转化的技术。这些技术不仅可将转基因技术拓展至WCR，用于功能基因组学研究，还可在此类具有重要经济意义的害虫中测试诸如基因驱动23,24等强大的新型害虫防控策略。

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方案

1. WCR 成虫的群体水平饲养

  1. 从可靠的公司或研究实验室获取足够数量的WCR成虫（500–1,000只）（参见材料表中的示例），并放入30 cm3的笼子中。
    注意：强烈建议使用非滞育品系。
  2. 按照制造商的说明制备WCR人工饲料，并将约1 cm厚的饲料层倒入38 oz容器中（参见材料表）。混合后，未使用的饲料可在4 °C下保存最多2个月。
  3. 将含有成虫饲料（10 –15 g）的培养皿（100 × 15 mm）放入30 cm3的笼子中。当食物不足或变干时，及时补充饲料。
  4. 将一个装有水的烧瓶（300 mL）放入笼中，瓶口用棉球封住，用于固定棉条（6" × 3/8"），作为水源。当水量减少时，及时更换水。
  5. 将WCR饲养于昆虫培养恒温箱中，条件为26 °C、60%湿度和14:10的光暗周期。

2. 胚胎收集与排列

  1. 使用无菌的100 × 15 mm培养皿，以1%琼脂水溶液制备卵收集装置2 培养皿。琼脂凝固后，于 4 °C 保存。
  2. 为收集新产的卵，将一层滤纸和四层纱布（每层均裁剪至合适大小）依次放置在琼脂表面图1A).
    注意：纱布在使用漂白剂清洗并经高压灭菌后可重复使用，但首次使用时无需进行此处理。滤纸不应重复使用，且无需灭菌。
  3. 将卵收集板尽可能在当天晚些时候（工作日结束时）放入WCR笼中，并用锡箔帐篷覆盖。过夜放置。
    注意：将光照时间设置为上午10点至午夜12点（共14小时）可延迟产卵，从而便于收集更年轻的卵用于显微注射，且无需实验人员在深夜将收集装置放入饲养笼中。
  4. 在上午8点或9点左右取下卵收集室。
  5. 使用镊子一次夹取一层纱布，放入盛有水的烧杯（500 mL）中，通过轻轻搅拌将卵从纱布上洗下图1B 和1C).
  6. 使用移液管将卵转移至另一个装有水的烧杯（500 mL）中。重复2–3次以清洗卵。
  7. 使用移液管将卵转移到滤纸上图1D）同时尽量减少水分的带入量。
  8. 将黑色滤纸裁成与载玻片等宽的纸条，用胶带将其牢固地固定在载玻片上，确保滤纸平整贴合（图2A).
    注意：黑色滤纸可通过减少反射光量来提高显微镜下的可见度。
  9. 使用无毒胶水（参见 材料表 （例如）以细线形式滴加到滤纸上的图2B胶线宽度应小于卵的直径，以避免卵被胶水包裹。
  10. 使用细毛刷将西部玉米根虫卵从滤纸上逐一轻轻移至胶线上。尽量在胶水未干前将虫卵放置于胶线上，并保持 每个卵之间至少保持一个卵的距离。
  11. 通过在一张滤纸载片上放置多排卵，以最大化注射效率（图3).
  12. 将所有卵放置在滤纸后，需等待胶水完全干燥后再进行显微注射。
    注意：对于生殖系转化和CRISPR/Cas9介导的基因组编辑，需在中午12点前完成所有胚胎的注射，以确保最老的胚胎不超过19小时。然而，对于RNA干扰（RNAi），并无时间限制，因为在西部玉米根虫（WCR）中，双链RNA（dsRNA）可在细胞间移动。事实上，对于RNAi而言，使用较老的胚胎可能获得更高的存活率。

3. 质粒DNA和注射针的制备

  1. 使用无内毒素的商用试剂盒制备高质量的超螺旋质粒DNA（示例参见材料表）。
  2. 配制注射溶液时，先测定每种质粒的浓度，然后将辅助质粒（终浓度250 ng/µL）、供体质粒（终浓度750 ng/µL）和酚红缓冲液（终浓度20%）混合。短暂涡旋混匀后，以最大速度离心3分钟，以沉淀可能堵塞针头的颗粒。
  3. 使用Flaming/Brown型微电极拉制仪拉制硼硅酸盐玻璃针（外径1 mm，内径0.58 mm，长度10 cm）。储存时，将拉好的针固定在培养皿或其他透明容器内的双面胶带上。
    注：微电极拉制仪的设置参数为：Heat = 335，FIL = 4，VEL = 40，DEL = 200，PUL = 100。
  4. 使用微加样吸头（见材料表）将0.5–1.0 µL溶液沿针管内壁注入靠近锥形末端处，完成注射针的后向填充。如有气泡，需从针尖处去除。
  5. 将注射针插入针头夹持器中。
  6. 用精细镊子轻轻折断针尖，或轻轻触碰/拖动针尖于盖玻片或载玻片表面，以打开针尖开口。
    注：目标是获得能够使注射混合物顺利流出的最小开口（较小的开口通常需要更高的注射压力）。斜面针头无需此步骤，因其已预先开口。

4. 显微注射及注射后护理

  1. 使用细小的画笔，用无菌水小心润湿1-3枚卵的表面，插入针头，然后注入溶液。注射 在卵表面干燥前完成每个卵的注射。注射时观察卵内是否出现少量红色，以确认显微注射成功。对于外观受损、空卵或无法注射的卵，应予以压碎或移除。
    注意：尽管注射压力因针头孔径大小而异，但10 - 13 psi是一个合适的起始范围。
  2. 所有卵注射完毕后，从载玻片上移除滤纸。
  3. 将滤纸置于1%琼脂平板（如上所述）的表面。
  4. 用塑料封口膜密封培养皿，置于26 °C昆虫培养用培养箱中培养12天。
    注意：石蜡膜有助于防止培养皿间霉菌的交叉污染。然而，任何其他抑制霉菌和细菌生长的处理措施可能会降低注射胚胎的存活率。

5. 胚胎的培养与孵化

  1. 从注射后第12天开始检查胚胎，观察新孵化的幼虫，并在接下来的2周内每天持续检查。
  2. 使用细刷将幼虫转移到含有发芽玉米和土壤的饲养盒中。
    注意：琼脂培养皿中可能会生长霉菌，但在大多数情况下幼虫仍能正常孵化。需仔细在霉菌中寻找幼虫，以确保全部捕获。部分幼虫可能会移动到培养皿盖上，并可能被困在冷凝水滴中。
  3. 按照标准的西部玉米根虫（WCR）饲养方法，在26 °C条件下饲养幼虫25。

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结果

在制定本实验方案时，一个重要的考虑因素是显微注射时胚胎发育的阶段。具体而言，种系转化要求在胚胎细胞化之前对DNA进行显微注射，因为DNA难以穿过细胞膜。尝试使用细胞核染料观察WCR胚胎发育各阶段时未能成功，原因是WCR胚胎的去卵壳过程会基本溶解所有维持胚胎完整性的保护膜。然而，这一研究方向又被另一困难所取代——及时获取足量的胚胎。在自然环境中，WCR雌虫将卵产于土壤中，因此在实验室条件下，雌虫仅在黑暗环境中产卵也就不足为奇了，这使得白天短时间内（2–4小时）收集卵变得困难。为克服这一问题，采用单次过夜产卵的方法，结果发现可获得大量胚胎。尽管收集（图1）和铺展（图2）胚胎以进行显微注射的过程较为繁琐，但若操作迅速，本方案可实现对注射时年龄介于2–19小时之间的胚胎进行显微注射；若在当天较晚时间进行注射，则胚胎年龄不得超过24小时。WCR与其他物种发育时间的比较表明，WCR胚胎在产卵后24小时仍应处于前细胞阶段（见讨论部分）。

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讨论

尽管已有报道通过显微注射dsRNA对西部玉米根虫（WCR）进行RNA干扰9，但本方案是首个建立针对WCR合子前胚胎显微注射最佳操作规范的实验流程，该技术对于在此物种中开展生殖系转化和/或CRISPR/Cas9基因组编辑至关重要。WCR胚胎显微注射的成功以及转化效率的高低依赖于多种因素。下文将讨论影响本方案在该甲虫中用于生殖系转化效果的一些主要问题。

获取前细胞胚胎
如上所述，DNA 无法像双链 RNA（dsRNA）那样穿过细胞膜。这意味着在细胞化发生之前注射 DNA、mRNA 和/或蛋白质至关重要。由于注射时机极为关键，因此有必要根据非滞育西部玉米根虫（WCR）品系完成发育所需的时间，确定一个可能成功的显微注射时间窗口。30 完成胚胎发生。这是基于对另一种甲虫合胞体囊胚阶段时间的详细研究计算得出的。 赤拟谷盗。在 赤拟谷盗约在30 °C条件下产卵后8小时发生细胞化31

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究得到了孟山都玉米根虫知识研究计划（项目编号 AG/1005，授予 MDL 和 YC）以及北卡罗来纳州立大学（NCSU）为 MDL 提供的启动资金支持。FC 的研究还得到了孟山都玉米根虫知识研究计划（AG/1005）和美国国家科学基金会（项目编号 MCB-1244772，授予 MDL）的资助。作者声明无利益冲突。FC 和 MDL 构思并设计了实验；FC、PW 和 SP 执行了实验；FC 和 MDL 分析了实验结果；FC、NG 和 MDL 撰写了论文。我们感谢 Teresa O'Leary、William Klobasa 和 Stephanie Gorski 在西部玉米根虫（WCR）筛选工作中提供的专业协助。我们还感谢美国农业部农业研究局北中部农业研究实验室（南达科他州布鲁金斯市）的 Wade French 博士提供用于建立实验室种群的虫卵以及饲养方案。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
定性滤纸（黑色）Ahlstrom8613-0900用于卵子显微注射
1 oz 容器 安妮的塑料餐具ASET101鸡蛋容器
果蝇琼脂类型 II顶点66-103WCR产卵盘用基质
轻量镊子 Bioquip4748处理幼虫和蛹 
Clorox 漂白剂1Clorox44600-30770清洗玉米和餐具
卡车司机最爱的黄色库尔农场供应公司502用于饲喂西部玉米根虫的玉米
显微注射系统（自制）NA部件 &及详细说明可根据要求提供控制注射压力（0-20 psi）
Elmer's 无毒胶水Elmer's Products, Inc.E304将卵粘附于滤纸上
epTIPS 微量上样吸头EppendorfC2554691回填针头装填技巧
Falcon 细胞培养皿Falcon25383-103萌发的玉米 /150 x 25 mm
Fisherbrand 定量级滤纸圆片Fisher ScientificS47576C制备用于产卵的琼脂培养皿（9 cm）
SparkleenFisher Scientific04-320-4清洗器皿
普通载玻片Fisher Scientific12-549-3手持滤纸和卵进行显微注射
西方玉米根虫（无花粉替代物）前沿农业科学 F9766BWCR成虫人工饲料
大号棉球Genesee Scientific51-101关闭烧瓶
Globe Scientific 3.0 mL 小型球状吸头移液管Globe Scientific137035收集并转移卵子
Leica M165 FC 荧光体视显微镜 LeicaM165 FC WCR 筛选
用于荧光体视显微镜的 DsRed 滤光片组LeicaDSR激发滤光片：510-560 nm，发射滤光片：590-650 nm
EGFP滤光片LeicaGFP2激发滤光片：440–520 nm，发射滤光片：510 nm
BugDormMegaView ScienceDP1000_5P成年种群饲养笼
微型画笔MyArtscapeMAS-102-MINILiner 2/0 
操纵杆显微操作器NarishigeMN-151显微操作仪和持针器
显微镜XY载物台Olympus265515显微镜载物台（适用于体视显微镜）
90 号纱布在线布料商店CHEE90用于产卵
塑料石蜡膜 佩基尼塑料包装PM-996显微注射后密封琼脂培养皿/卷尺寸 4 英寸 × 125 英尺
Percival 培养箱Percival I41VLH3C8WCR饲养室（昆虫养殖培养箱）
窄口锥形瓶VWR4980-300-PK成虫种群用水容器 
Griffin 低型烧杯VWR1000-600-PK用于蛋液涂抹
编织棉卷里士满牙科棉业公司605-3599用于成年种群的供水 
培养皿（35×10 mm）SIGMACLS430588-500EA用于饮食平板
酚红Sigma143-78-8显微注射缓冲液
基于激光的微毛细管拉制仪Sutter InstrumentP-2000/G针头拉制仪/加热温度 = 335，填充度（FIL）= 4，拉制速度（VEL）= 40，延迟时间（DEL）= 200，拉制力度（PUL）= 100
优质表层土The Scotts Company71130758用于种植大麻的土壤
Reloc Zippit 2 Mil 自封袋美国塑料公司48342显微注射后将培养皿装袋/5x7
培养皿（100×15 mm）VWR89038-968制备用于产卵的琼脂平板 / 100 x 15 mm
6 盎司容器Webstaurantstore128E506WCR 单对交配室 
38 盎司容器Webstaurantstore128NC888幼虫饲养盒/38盎司
ChoiceHD 16 盎司可微波透明塑料熟食容器Webstaurantstore128HRD16幼虫饲养盒/16盎司
显微注射显微镜 Wild HeerbruggWILD-M8配备XY载物台的显微注射镜
标准玻璃毛细管World Precision Instruments1B100F-4显微注射针
成年西方玉米根虫北中部农业研究中心实验室非二酯酶菌株来自 Bryan Wade French 博士实验室的申请
质粒DNA中量提取试剂盒Qiagen12143纯化可用于注射的质粒DNA

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