西方玉米根虫（Diabrotica virgifera virgifera）胚胎的显微注射用于种系转化或CRISPR/Cas9基因组编辑

摘要

本文介绍了收集和显微注射前细胞期西方玉米根虫胚胎的实验方案，旨在进行功能性基因组学检测，如种系转化和CRISPR/Cas9基因组编辑。

摘要

西方玉米根虫（WCR）是玉米的重要害虫，以其能够快速适应害虫管理策略而著称。尽管RNA干扰（RNAi）已被证明是研究WCR生物学的有力工具，但它也存在局限性。具体而言，RNAi本身是瞬时的（即不会导致相关表型的长期孟德尔遗传），并且需要已知靶基因的DNA序列。如果感兴趣表型由保守性较差甚至全新的基因控制，则后一限制尤为突出，因为识别有效的靶点将极具挑战性，甚至不可能。因此，应通过开发可用于创建稳定突变品系并实现对WCR基因组进行序列无关性筛查的新方法，来扩充WCR基因组工具箱中的工具种类。本文详细描述了采集和显微注射核酸至WCR合子前胚胎的方法。尽管本文所述方案旨在创建转基因WCR，但使用相同的流程也可进行CRISPR/Cas9基因组编辑，唯一的区别在于注射入胚胎的溶液成分不同。

引言

西方玉米根虫（WCR），Diabrotica virgifera virgifera是玉米的重要害虫¹有趣的是，西部玉米根虫（WCR）似乎比大多数农业害虫更快地突破防控措施，因为它们不仅在生理上产生适应，还在行为上发生改变。^2,3,4,5,6近十年来，RNA干扰（RNAi）作为一种强大的功能基因组学工具，已被研究用于玉米根萤叶甲（WCR）的潜在防控方法。^7,8，并且还被用作研究基因功能的方法⁹然而，尽管在其他物种中RNAi通常通过显微注射双链RNA（dsRNA）来实现，但在西部玉米根虫（WCR）中基于注射的RNAi却较为罕见。事实上，关于WCR中RNAi的研究报道仅有少数几例 通过 将dsRNA显微注射到WCR中⁹原因是WCR能够实现高水平的基因敲低 通过 摄入dsRNA

方案

1. WCR 成虫的群体水平饲养

1. 从可靠的公司或研究实验室获取足够数量的WCR成虫（500–1,000只）（参见材料表中的示例），并放入30 cm³的笼子中。
   注意：强烈建议使用非滞育品系。
2. 按照制造商的说明制备WCR人工饲料，并将约1 cm厚的饲料层倒入38 oz容器中（参见材料表）。混合后，未使用的饲料可在4 °C下保存最多2个月。
3. 将含有成虫饲料（10 –15 g）的培养皿（100 × 15 mm）放入30 cm³的笼子中。当食物不足或变干时，及时补充饲料。
4. 将一个装有水的烧瓶（300 mL）放入笼中，瓶口用棉球封住，用于固定棉条（6" × 3/8"），作为水源。当水量减少时，及时更换水。
5. 将WCR饲养于昆虫培养恒温箱中，条件为26 °C、60%湿度和14:10的光暗周期。

2. 胚胎收集与排列

1. 使用无菌的100 × 15 mm培养皿，以1%琼脂水溶液制备卵收集装置² 培养皿。琼脂凝固后，于 4 °C 保存。
2. 为收集新产的卵，将一层滤纸和四层纱布（每层均裁剪至合适大小）依次放置在琼脂表面图1A

结果

在制定本实验方案时，一个重要的考虑因素是显微注射时胚胎发育的阶段。具体而言，种系转化要求在胚胎细胞化之前对DNA进行显微注射，因为DNA难以穿过细胞膜。尝试使用细胞核染料观察WCR胚胎发育各阶段时未能成功，原因是WCR胚胎的去卵壳过程会基本溶解所有维持胚胎完整性的保护膜。然而，这一研究方向又被另一困难所取代——及时获取足量的胚胎。在自然环境中，WCR雌虫将卵产于土壤中，因此在实验室条件下，雌虫仅在黑暗环境中产卵也就不足为奇了，这使得白天短时间内（2–4小时）收集卵变得困难。为克服这一问题，采用单次过夜产卵的方法，结果发现可获得大量胚胎。尽管收集（图1）和铺展（图2）胚胎以进行显微注射的过程较为繁琐，但若操作迅速，本方案可实现对注射时年龄介于2–19小时之间的胚胎进行显微注射；若在当天较晚时间进行注射，则胚胎年龄不得超过24小时。WCR与其他物种发育时间的比较表明，WCR胚胎在产卵后24小时仍应处于前细胞阶段（见讨论部分）。

讨论

尽管已有报道通过显微注射dsRNA对西部玉米根虫（WCR）进行RNA干扰⁹，但本方案是首个建立针对WCR合子前胚胎显微注射最佳操作规范的实验流程，该技术对于在此物种中开展生殖系转化和/或CRISPR/Cas9基因组编辑至关重要。WCR胚胎显微注射的成功以及转化效率的高低依赖于多种因素。下文将讨论影响本方案在该甲虫中用于生殖系转化效果的一些主要问题。

获取前细胞胚胎
如上所述，DNA 无法像双链 RNA（dsRNA）那样穿过细胞膜。这意味着在细胞化发生之前注射 DNA、mRNA 和/或蛋白质至关重要。由于注射时机极为关键，因此有必要根据非滞育西部玉米根虫（WCR）品系完成发育所需的时间，确定一个可能成功的显微注射时间窗口。³⁰ 完成胚胎发生。这是基于对另一种甲虫合胞体囊胚阶段时间的详细研究计算得出的。 赤拟谷盗。在 赤拟谷盗约在30 °C条件下产卵后8小时发生细胞化³¹

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
定性滤纸（黑色）	Ahlstrom	8613-0900	用于卵子显微注射
1 oz 容器	安妮的塑料餐具	ASET101	鸡蛋容器
果蝇琼脂类型 II	顶点	66-103	WCR产卵盘用基质
轻量镊子	Bioquip	4748	处理幼虫和蛹
Clorox 漂白剂1	Clorox	44600-30770	清洗玉米和餐具
卡车司机最爱的黄色	库尔农场供应公司	502	用于饲喂西部玉米根虫的玉米
显微注射系统（自制）	NA	部件 &及详细说明可根据要求提供	控制注射压力（0-20 psi）
Elmer's 无毒胶水	Elmer's Products, Inc.	E304	将卵粘附于滤纸上
epTIPS 微量上样吸头	Eppendorf	C2554691	回填针头装填技巧
Falcon 细胞培养皿	Falcon	25383-103	萌发的玉米 /150 x 25 mm
Fisherbrand 定量级滤纸圆片	Fisher Scientific	S47576C	制备用于产卵的琼脂培养皿（9 cm）
Sparkleen	Fisher Scientific	04-320-4	清洗器皿
普通载玻片	Fisher Scientific	12-549-3	手持滤纸和卵进行显微注射
西方玉米根虫（无花粉替代物）	前沿农业科学	F9766B	WCR成虫人工饲料
大号棉球	Genesee Scientific	51-101	关闭烧瓶
Globe Scientific 3.0 mL 小型球状吸头移液管	Globe Scientific	137035	收集并转移卵子
Leica M165 FC 荧光体视显微镜	Leica	M165 FC	WCR 筛选
用于荧光体视显微镜的 DsRed 滤光片组	Leica	DSR	激发滤光片：510-560 nm，发射滤光片：590-650 nm
EGFP滤光片	Leica	GFP2	激发滤光片：440–520 nm，发射滤光片：510 nm
BugDorm	MegaView Science	DP1000_5P	成年种群饲养笼
微型画笔	MyArtscape	MAS-102-MINI	Liner 2/0
操纵杆显微操作器	Narishige	MN-151	显微操作仪和持针器
显微镜XY载物台	Olympus	265515	显微镜载物台（适用于体视显微镜）
90 号纱布	在线布料商店	CHEE90	用于产卵
塑料石蜡膜	佩基尼塑料包装	PM-996	显微注射后密封琼脂培养皿/卷尺寸 4 英寸 × 125 英尺
Percival 培养箱	Percival	I41VLH3C8	WCR饲养室（昆虫养殖培养箱）
窄口锥形瓶	VWR	4980-300-PK	成虫种群用水容器
Griffin 低型烧杯	VWR	1000-600-PK	用于蛋液涂抹
编织棉卷	里士满牙科棉业公司	605-3599	用于成年种群的供水
培养皿（35×10 mm）	SIGMA	CLS430588-500EA	用于饮食平板
酚红	Sigma	143-78-8	显微注射缓冲液
基于激光的微毛细管拉制仪	Sutter Instrument	P-2000/G	针头拉制仪/加热温度 = 335，填充度（FIL）= 4，拉制速度（VEL）= 40，延迟时间（DEL）= 200，拉制力度（PUL）= 100
优质表层土	The Scotts Company	71130758	用于种植大麻的土壤
Reloc Zippit 2 Mil 自封袋	美国塑料公司	48342	显微注射后将培养皿装袋/5x7
培养皿（100×15 mm）	VWR	89038-968	制备用于产卵的琼脂平板 / 100 x 15 mm
6 盎司容器	Webstaurantstore	128E506	WCR 单对交配室
38 盎司容器	Webstaurantstore	128NC888	幼虫饲养盒/38盎司
ChoiceHD 16 盎司可微波透明塑料熟食容器	Webstaurantstore	128HRD16	幼虫饲养盒/16盎司
显微注射显微镜	Wild Heerbrugg	WILD-M8	配备XY载物台的显微注射镜
标准玻璃毛细管	World Precision Instruments	1B100F-4	显微注射针
成年西方玉米根虫	北中部农业研究中心实验室	非二酯酶菌株	来自 Bryan Wade French 博士实验室的申请
质粒DNA中量提取试剂盒	Qiagen	12143	纯化可用于注射的质粒DNA