制备、检测和使用成年脑组织切片中的钾离子选择性微电极

J. Christopher Octeau; Guido Faas; Istvan Mody; Baljit S. Khakh

doi:10.3791/57511

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方法文章

制备、检测和使用成年脑组织切片中的钾离子选择性微电极

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DOI：

10.3791/57511

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2018年5月7日

J. Christopher Octeau¹ , Guido Faas² , Istvan Mody¹^,² , Baljit S. Khakh¹^,³

¹Department of Physiology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles, ²Department of Neurology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles, ³Department of Neurobiology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles

本文内容

摘要

钾离子参与细胞静息膜电位和细胞外K⁺ 浓度是细胞兴奋性的关键调节因素。我们介绍了如何制备、校准和使用单极K⁺⁺选择性微电极。使用此类电极可测量电刺激诱发的K⁺⁺ 成年海马脑片中的浓度动态

摘要

钾离子对细胞静息膜电位具有显著贡献，因此细胞外 K⁺ 浓度是细胞兴奋性的关键调节因素。细胞外K⁺浓度的改变⁺ 通过改变介导动作电位起始和传导的电压门控离子通道在关闭态、开放态和失活态之间的平衡，影响静息膜电位和细胞兴奋性。因此，直接测量细胞外K⁺浓度具有重要意义⁺ 健康与疾病状态下的动力学。在此，我们描述了如何制备、校准和使用单极性K⁺选择性微电极。我们将它们应用于成年海马脑片，以测量电刺激诱发的K⁺ 浓度动态。合理使用此类电极是评估调控细胞外K⁺的细胞与生物物理机制所需工具包中的重要组成部分。⁺ 神经系统中的浓度。

引言

脑内的钾离子浓度受到严格调控，其浓度波动会显著影响所有细胞的静息膜电位。鉴于其关键作用，生物学的一个重要目标是明确在机体不同器官中用于精确调控细胞外空间K⁺浓度的细胞与生物物理机制¹^,²。在这些研究中，一个重要的前提是能够准确测量K⁺浓度。尽管在健康和疾病状态下参与脑内钾离子稳态的多种组分已被识别³^,⁴^,⁵，但由于制备用于钾离子检测的离子选择性微电极技术具有较高的专业性，相关研究进展受到限制。微电极传感器是体外（in vitro）、脑片以及活体（in vivo）条件下测量K⁺浓度的金标准。

目前，利用光学传感器监测 K⁺ 的新方法正在研发中，但这些方法尚不能检测生物学相关的 K⁺ 浓度范围，或尚未在生物系统中得到充分验证，尽管初步结果显示出一定前景⁶^,⁷^,⁸。与光学传感器相比，微电极本质上仅能对离子进行点源测量，尽管使用电极阵列可提高空间分辨率⁹。本文重点介绍用于监测 K⁺ 动态变化的单通道微电极传感器。

在本研究中，我们报告了使用缬氨霉素类钾离子载体制造钾离子（K⁺）选择性微电极的详细逐步操作流程。该离子载体可实现对钾离子的高度选择性（K⁺ 对 Na⁺ 的选择性达 10⁴ 倍），允许 K⁺ 跨膜高效传输¹⁰。缬氨霉素是一种天然存在的多肽，可作为允许 K⁺ 透过的孔道，促进 K⁺ 沿其电化学梯度流动。我们还描述了如何校准这些电极、如何储存和使用它们，以及最终如何将其应用于测量成年小鼠急性海马脑片中 K⁺ 浓度的动态变化。结合使用缺乏特定离子通道的基因修饰小鼠（这些通道被认为可调控细胞外 K⁺ 的动态），此类电极将有助于揭示神经系统用于调控细胞外环境中 K⁺ 基线浓度的细胞机制。

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方案

所有动物实验均按照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》进行，并经加州大学洛杉矶分校校长动物研究委员会批准。所有小鼠均饲养在12小时光照-黑暗循环环境中，自由获取食物和饮水。ad libitum。所有动物健康状况良好，无明显行为学改变，未参与过先前的实验研究，并在光照周期期间被处死。实验数据均来自成年小鼠（所有实验使用6-8周龄小鼠）。

1. K的制备⁺ 选择性微电极

硼硅酸盐玻璃的硅烷化
1. 从包装中取出足够数量的玻璃毛细管，放入50 mL锥形管中。用1 M HCl将锥形管加满，将电极在HCl中轻轻振荡清洗过夜，或至少6小时。
2. 用70%乙醇短暂冲洗毛细管，然后在100–120 °C下彻底干燥6–8小时。将清洗后的毛细管储存于装有无水硫酸钙干燥剂的容器中，最多可保存4周，以备后续使用。
3. 在进行硅烷化前，使用微电极拉制仪将毛细管拉制成细尖端。我们所用的微电极尖端直径约为2–5微米。处理清洗后的毛细管时务必佩戴手套，因为皮肤上的油脂会干扰硅烷化过程。
4. 将微电极放入玻璃容器中，使其尖端悬空，避免接触底部造成破损。使用可高压灭菌胶带或类似粘性胶带将微电极固定在容器上。
5. 使用氮气置换法从容器中取出约0.5 mL的5%二氯二甲基硅烷（DDS）硅烷化溶液（参见图2）。将气球充满氮气，并在气球上连接带有针头的注射器或导管。将针头插入DDS容器的同时，通过另一根较长的针头将DDS吸入另一个注射器中。
6. 将硅烷化溶液逐滴加至移液管尖端，立即盖好容器。将装有微电极和硅烷化溶液的容器放入预热至170–180 °C的实验室烘箱中，孵育10–12小时；或在200–220 °C下处理30分钟。
7. 孵育结束后，关闭烘箱，然后将容器从烘箱中取出。取出时需格外小心，因为容器极热。将容器置于室温实验台面上静置10–15分钟，使玻璃器皿冷却。
8. 用刀片或手术刀片切断胶带，将微电极从容器中取出，并放入装有干燥剂的密封容器中。经硅烷化处理的微电极若保持干燥，可在处理后一周内使用。
电极的预处理
1. 配制K⁺离子载体混合液储备液：5% w/v 缬氨霉素，93% v/v 1,2-二甲基-3-硝基苯，2% w/v 四(4-氯苯基)硼酸钾¹¹。该溶液呈淡黄色。应保存于密封、避光的容器中，室温存放。若储存得当，该溶液可稳定保存数月。
2. 配制10 mM HEPES缓冲的300 mM NaCl溶液（pH 7.4）。将电极固定在夹具上，使用连接注射器的28G微填充尖端从后端填充缓冲NaCl溶液。观察确认盐溶液已到达微电极尖端。检查微电极内部无大气泡，以免影响电流流动。
3. 使用刀片或手术刀的钝边，将电极尖端折断至直径约10–20 µm。
4. 使用微量移液器，在微电极尖端附近施加一小滴（约0.1 µL）K⁺离子载体溶液。若电极硅烷化处理成功，液滴将被破裂的尖端吸收。用K⁺离子载体填充电极尖端1–2 mm，并用滤纸吸除多余液体。

2. K的校准⁺ 选择性微电极

校准溶液的配制
1. 通过用 KCl 替代 NaCl，在等渗人工脑脊液（ACSF）中配制不同浓度的 KCl 溶液。我们使用 0.1、1、4.5、10 和 100 mM K⁺ ACSF 溶液对电极进行校准。这些校准溶液的配方列于表 1中。

化学物质	MW	终浓度 mM	0.1 mM [K+]	1 mM [K+]	4.5 mM [K+]	10 mM [K+]	100 mM [K+]
化学物质	(g / mol)	终浓度 mM	0.1 mM [K+]	1 mM [K+]	4.5 mM [K+]	10 mM [K+]	100 mM [K+]
NaCl	58.44	变化	1.51 g	1.50 g	1.44 g	1.4 g	0.345 g
KCl	1 M 储液	变化	20 µl	200 µl	900 µl	2 ml	20 ml
CaCl₂	1 M 储液	2	400 µl
MgCl₂	1 M 储液	1	200 µl
NaH₂PO₄	119.98	1.2	0.29 g
NaHCO₃	84.01	26	0.437 g
D-葡萄糖	180.16	10	0.360 g
水	加水定容至 200 ml

表1. 钾标准校准溶液

微电极校准
1. 实验开始前，所有溶液均需用 95% O₂/5% CO₂ 气体至少鼓泡 20 分钟。以每分钟 3 mL 的流速开始向浴槽灌注含 4.5 mM [K⁺] 的人工脑脊液（ACSF）。将 K⁺ 选择性电极插入固定在操纵器电极头端的电极夹持器中。该头端连接至适当的放大器。将电极尖端插入灌流液中。
2. 确保 Ag/AgCl 接地电极浸没于相同溶液中，且灌流稳定。逐步施加校准液，并记录电极尖端间的电位变化（单位：mV）。每次更换校准液前，需等待电极尖端电位达到稳定值。
3. 测量施加校准液后电极尖端响应的稳态电压变化。确认电极响应斜率每单位 [K⁺] 对数变化至少为 52 mV，且不超过 58 mV。

3. 急性海马脑片的制备

切片溶液的制备
1. 配制500 mL蔗糖切割液，成分为：194 mM 蔗糖、30 mM NaCl、4.5 mM KCl、10 mM D-葡萄糖、1 mM MgCl₂、1.2 mM NaH₂PO₄ 和 26 mM NaHCO₃，渗透压为290–300 mOsm，用95% O₂ 和5% CO₂ 饱和。
2. 配制1–2升记录液（人工脑脊液，ACSF），成分为：124 mM NaCl、4.5 mM KCl、1 mM MgCl₂、10 mM D-葡萄糖、2 mM CaCl₂、1.2 mM NaH₂PO₄ 和 26 mM NaHCO₃；pH值为7.3–7.4（通气后），渗透压为290–300 mOsm，用95% O₂ 和5% CO₂ 饱和。将装有脑片孵育室的烧杯中加入记录液，并维持在32–34 °C。将振动切片机腔室中加入冰水混合物。
急性脑片制备
1. 将小鼠置于预先充有2–3 mL异氟烷的密闭容器中，进行深度麻醉。检查趾夹反射，若无反应，则根据动物实验方案要求，使用锋利的剪刀或断头器迅速断头处死。
2. 使用剪刀从颅骨尾侧开始，沿中线剪开头皮，形成2–3 cm的切口。手动牵拉头皮的同时，从枕骨大孔处沿颅骨两侧各做一条长约1 cm的横向切口。然后使用精细剪刀，沿颅骨中线从后部至鼻部剪开一条与颅骨长度相当的切口。
3. 将精细镊子插入中线附近，将切开的颅骨向两侧分开。取出小鼠脑组织，使用刀片切除位于脑尾侧和头侧的小脑和嗅球。这些结构可通过其与大脑皮层之间明显的裂隙进行识别。
4. 使用速干胶将脑组织块固定在振动切片机的载物盘上。向振动切片机的托盘中加入冰冻的切割液。
5. 在冠状面上切割厚度为300 µm的组织切片。通常可获得6个冠状位海马脑片。
6. 每切完一片后，立即将脑片转移至预热至32–34 °C的孵育烧杯中。在该温度下孵育20分钟后，将烧杯移出并置于室温下至少20–30分钟，再进行电生理记录。

4. 电刺激诱发的K⁺动态变化的测量

切片制备的设置
1. 使用巴斯德移液管轻轻将脑切片放入浴槽中，并用带有尼龙丝的铂金弓形固定器轻轻固定切片位置。
2. 确保双极刺激电极的尖端相互平行，并与切片平面齐平。在约6-7秒的时间内缓慢将电极插入CA3区辐射层，深度约为40-50 µm，以刺激Schaffer侧支。在冠状切面中，CA3区大致可识别为海马体主体部分中位于海马膝部颗粒细胞层外侧的区域，而辐射层则位于锥体细胞层的内侧和腹侧。
3. 通过在约3-4秒内缓慢降低电极，将K⁺-选择性电极小心插入CA1区辐射层，深度约为50 µm。在对切片施加刺激前，需等待电极电位稳定：通常需要5至10分钟。如果切片表现出细胞外K⁺的自发性变化，则应弃用该切片，并使用新的切片重复此过程。
测量诱发的K⁺释放
1. 通过手动按压刺激器上的触发装置施加电刺激串（8个脉冲），同时进行反应的数字记录。刺激参数为10 Hz频率、1 ms脉宽，起始刺激强度为10 µA。
2. 以2倍递增的方式逐步提高刺激强度，直至检测到最大K⁺反应幅度。若未观察到任何反应，可将K⁺电极位置向刺激位点方向每次移动100 µm，逐步调整。
3. 确定产生半最大反应的刺激强度。根据我们的经验，该值通常在40-160 µA之间，具体取决于切片质量、动物年龄以及刺激电极与K⁺-选择性电极之间的距离。
4. 在同一脑切片上，使用比产生半最大反应低一个递增步长的刺激强度（例如，若80 µA产生半最大反应，则使用40 µA），施加脉冲数逐步增加的刺激串。初始实验中，我们采用的刺激串脉冲数依次为1、2、4、8、16、32、64和128 个脉冲。
5. 为确认K⁺信号是由电刺激Schaffer侧支引发的动作电位所介导的，可在人工脑脊液（ACSF）中加入0.5 µM河豚毒素（TTX）孵育10分钟，然后重复刺激方案。此时不应观察到任何诱发反应。
6. 完成切片实验后，通过将电极重新在标定溶液中校准，确认电极的响应性是否保持稳定，确保其响应值与初始校准值的偏差不超过10%。

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结果

为了选择性测量细胞外 K⁺，我们通过将洁净的硼硅酸盐玻璃移液管进行硅烷化处理，制备了带有疏水层的离子选择性微电极（图 1A）。该涂层可使含有缬氨霉素的 K⁺ 离子载体停留在电极尖端，并仅允许 K⁺ 通过电极尖端的微小开口进行通透（图 1B）。在用填充的生理盐水溶液和 K⁺ 离子载体对电极进行预处理后，可在生理盐水或人工脑脊液（ACSF）中，根据能斯特方程²的预测，检测电极对浴液中 K⁺ 浓度逐步变化的快速且线性响应（图 3A），以及在标定范围内对浴液 K⁺ 浓度变化的响应情况（图 3B）。可通过将稳态电位的变化值对浴液 K⁺ 浓度作图，以...

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讨论

本文所述方法使我们能够评估成年小鼠急性海马脑片中，施加谢弗侧支电刺激后 K⁺ 的动态变化。我们制备 K⁺ 选择性微电极的方法与先前报道的方案¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵ 相似。然而，该方法相较于其他电极构型具有优势，即制备 K⁺ 选择性微电极的过程快速且简便。经过适当校准后，这些电极可在电刺激期间稳定地测量脑片中的 K⁺ 动态变化，且此类反应可被 TTX 阻断。在这些实验中，采用 80–160 µA、10 Hz 的刺激参数；然而，针对特定实验及目标脑区，需对刺激条件进行优化。所列数值仅作为参考。

电极响应的斜率应为每对数单位[K⁺] 58.2 mV。该数值可根据Nernst方程和Nicolsky-Eisenman方...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

Khakh 实验室由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 MH104069 支持。Mody 实验室由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 NS030549 支持。J.C.O. 感谢美国国立卫生研究院 T32 神经微环路培训项目（NS058280）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号
振动切片机	DSK	Microslicer Zero 1
小鼠：C57BL/6NTac 近交系小鼠	Taconic	Stock#B6
显微镜	Olympus	BX51
电极拉制仪	Sutter	P-97
Ag/AgCl 接地电极颗粒	WPI	EP2
pCLAMP10.3	Molecular Devices	n/a
定制微管 28G 尖端	World precision instruments	CMF28G
钨棒	A-M Systems	716000
双极刺激电极	FHC	MX21XEW(T01)
刺激隔离器	World precision instruments	A365
Grass S88 刺激器	Grass Instruments Company	S88
硼硅酸盐玻璃移液管	World precision instruments	1B150-4
A/D 转换板	Digidata 1322A	Axon Instruments
信号放大器	Multiclamp 700A 或 700B	Axon Instruments
前置放大器头级	CV-7B Cat 1	Axon Instruments
膜片钳计算机	Dell	n/a
氯化钠	Sigma	S5886
氯化钾	Sigma	P3911
HEPES	Sigma	H3375
碳酸氢钠	Sigma	S5761
磷酸二氢钠	Sigma	S0751
D-葡萄糖	Sigma	G7528
氯化钙	Sigma	21108
氯化镁	Sigma	M8266
缬氨霉素	Sigma	V0627-10mg
1,2-二甲基-3-硝基苯	Sigma	40870-25ml
四(4-氯苯基)硼酸钾	Sigma	60591-100mg
5% 二甲基二氯硅烷庚烷溶液	Sigma	85126-5ml
TTX	Cayman Chemical Company	14964
盐酸	Sigma	H1758-500mL
蔗糖	Sigma	S9378-5kg
移液管显微操作器	Sutter	MP-285 / ROE-200 / MPC-200
物镜	Olympus	PlanAPO 10xW

参考文献

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