成人脑组织切片中钾离子选择性电极的制备、检测及应用

Summary

钾离子有助于细胞的静止膜电位, 胞外 K⁺浓度是细胞兴奋性的重要调节因子。我们描述如何制作, 校准和使用单 K⁺选择性电极。使用此类电极可以测量成年海马切片中电诱发的 K⁺浓度动态。

Abstract

钾离子对细胞的静止膜电位有显著的促进作用, 因此胞外 K⁺浓度是细胞兴奋性的重要调节因子。细胞外 K⁺的浓度改变会影响静止膜电位和细胞兴奋性, 方法是将闭合的、开放的和灭活状态之间的平衡转移到有作用电位的电压依赖离子通道上。启动和传导。因此, 直接测量健康和患病状态下的胞外 K⁺动态是很有价值的。在这里, 我们描述如何制作, 校准和使用单 K⁺选择性电极。我们将它们部署在成人海马脑切片中, 以测量电诱发 K⁺浓度动态。明智地使用此类电极是评估细胞和生物物理机制, 以控制神经系统细胞外 K⁺浓度所需的工具套件的重要组成部分。

Introduction

钾离子浓度在大脑中受到严格的调节, 它们的波动对所有细胞的静止膜电位有很大的影响。根据这些重要的贡献, 生物学的一个重要目标是确定细胞和生物物理机制, 用于在身体的不同器官的细胞外空间中严格调节 K⁺的浓度^1,2. 这些研究的一个重要要求是能够准确地测量 K⁺浓度。虽然在健康和患病状态下, 许多有助于大脑中钾稳态的成分已经被确认为^3,45, 由于专业性质的原因, 进一步的进展已经减慢。制备离子选择性电极钾的方法。微电极传感器表示用于测量 K⁺浓度体外、组织切片和体内中的金标准。

用于 k⁺监视的更新方法正在使用光学传感器进行开发, 但这些检测不到与生物学相关的 k⁺浓度范围, 也未在生物系统中进行全面审查, 尽管初步结果显示有希望的^6,7,8。与光....

Protocol

所有动物实验都是按照美国国家卫生研究院的实验室动物护理和使用指南进行的, 并得到了加州大学洛杉矶分校校长动物研究委员会的批准。所有的老鼠都是在12小时的昏暗环境中使用食物和水的ad 随意。所有动物都是健康的, 没有明显的行为变化, 没有参与以前的研究, 并在光周期中牺牲。实验数据从成年小鼠 (6-8 周大的所有实验) 中采集。

1. K⁺选择性电极的制备

1. 硼硅酸盐玻璃的硅烷化
   1. 从包装中取出足够的玻璃毛细血管, 放入50毫升锥形管。用1米 hcl 填充锥形管顶部. 在 hcl 中用温和的搅拌方法清洗电极一夜之间或至少6小时。
   2. 用70% 乙醇简单冲洗毛细血管, 然后在100-120 摄氏度内完全干燥6-8 小时。在使用无水硫酸钙干燥剂的容器中贮存清洗过的毛细血管长达4周。
   3. 在硅烷化之前, 用微电极拉拔毛细血管到细尖端。我们使用的电极直径约为2-5 微米。总是用手套处理冲洗过的毛细血管, 因为皮肤上的油脂会干扰硅烷化。
   4. 将电极放入玻璃容器中, 使电极从底部升高以防止尖端破损。使用耐高压胶带或类似胶带将电极固定在容器上。
   5. 使用氮气替换方法从容器中移除大约0.5 毫升 5% dichlorodimethylsilane (DDS) 硅烷化溶液 (请参见图 2)。用氮....

Results

对于细胞外 K⁺的选择性测量, 我们通过硅烷化清洁硼硅酸盐玻璃吸管(图 1A), 制备了具有疏水性层的离子选择性电极。此涂层使包含 valinomycin 的 k⁺载体在电极尖端上休息, 并且仅允许 k⁺通量通过在电极尖端的窄开口 (图 1B)。在用回填盐水溶液和 K⁺载体启动电极后, 可以对电极进行测试, 使其快速、线性地响应浴 K⁺浓度的逐步变化 (图 3A), 并响应浴 K⁺以斯特方程²预测的方式在生理盐水或 ACSF 中的校准范围 (图 3B) 上更改。在稳态电位的变化可以绘制对浴 K⁺浓度, 以确定直线的斜率, 这应该大约是 5.......

Discussion

我们在这里描述的方法使我们能够评估 K⁺动力学, 以响应电刺激的谢弗络在急性海马切片的成年小鼠。我们准备 K⁺离子选择性电极的方法类似于前面描述的过程^12,13,14,15。然而, 这种方法优于替代电极配置, 因为它是快速和复杂的准备 K⁺选择性电极。在适当的校准后, 发现这些电极在电刺激过程中能有力地测量 K⁺的动力学, 而这种反应被 TTX 阻止。在这些实验中, 使用了10赫兹的 80-160 uA 刺激;然而, 需要对特定实验和脑区感兴趣的刺激条件进行优化。这些值作为指南列出。

电极响应的斜率应为每日志 58.2 mV [K⁺]。此值由 K⁺选择性半透膜的斯特和 Nicolsky-埃森曼方程预.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
振动切片机	DSK	Microslicer Zero 1
小鼠：C57BL/6NTac 近交小鼠	Taconic	Stock#B6
显微镜	奥林巴斯	BX51
电极拉拔器	萨特	P-97
Ag/AgCl 研磨颗粒	WPI	EP2
pCLAMP10.3	分子器件	n/a
定制 microfil 28G 尖端	世界精密仪器	CMF28G
钨棒	AM Systems	716000
双极刺激电极	FHC	MX21XEW（T01）
刺激隔离器	世界精密仪器	A365
Grass S88 刺激器	Grass Instruments Company	S88
硼硅酸盐玻璃移液器	世界精密仪器	1B150-4
A 至 D 板	Digidata 1322A	Axon Instruments
信号放大器	Multiclamp 700A 或 700B	Axon Instruments
Headstage	CV-7B Cat 1	Axon Instruments
贴片计算机	Dell	n/a
氯化钠	Sigma	S5886
氯化钾	Sigma	P3911
HEPES	Sigma	H3375
碳酸氢钠	Sigma	S5761
磷酸钠二元	Sigma	S0751
D-葡萄糖		Sigma G7528
氯化钙	Sigma	21108
氯化镁	Sigma	M8266
缬氨霉素	Sigma	V0627-10mg
1,2-二甲基-3-硝基苯	Sigma	40870-25ml
四氯钾（4-氯苯基）硼酸钾	Sigma	60591-100mg
5% 二甲基二氯硅烷庚烷	Sigma	85126-5ml
TTX	开曼群岛Chemical Company	14964
酸	Sigma	H1758-500mL
蔗糖	Sigma	S9378-5kg
移液器显微作器	Sutter	MP-285 / ROE-200 / MPC-200
镜	Olympus	PlanAPO 10xW