成体细胞外囊泡的分离与表征 日本血吸虫

摘要

在此，我们介绍一种用于描述细胞外囊泡（EVs）分离的实验方案 体外 成人培养基 日本血吸虫.

摘要

细胞外囊泡（EVs）是由多种细胞释放到细胞外微环境中的膜性囊泡，代表一群大小在40至1,000 nm之间的异质性囊泡。大量证据表明，EVs在病原体与宿主相互作用中发挥重要的调控作用。深入理解血吸虫EVs有助于揭示血吸虫与宿主相互作用的分子机制，从而为开发抗血吸虫病的新策略提供依据。本文旨在通过提供一种从成虫中分离和表征EVs的实验方案，进一步研究EVs在血吸虫中的功能 日本血吸虫 (S. japonicum）。EVs 从 体外 采用离心法结合商用外泌体分离试剂盒从培养基中分离外泌体。所分离的 S. japonicum SjEVs 通常直径为 100 - 400 nm，可通过透射电子显微镜和蛋白质印迹法进行表征。使用 PKH67 荧光染料标记的 SjEVs 已证明其可被受体细胞内化。总体而言，本实验方案为从成虫血吸虫中分离细胞外囊泡提供了一种替代方法；所获得的 SjEVs 可适用于功能分析。

引言

细胞外囊泡（EVs）是一类由膜包裹的小型囊泡，内含多种蛋白质、脂质和核酸。近期研究表明，EVs在细胞间通讯中发挥关键作用，并参与调控多种生理过程，包括细胞发育、免疫调节、血管生成以及细胞迁移^2,3,4,5。越来越多的证据表明，循环中的EVs、外泌体及其携带的miRNA可能作为某些疾病的潜在生物标志物⁶。

已有研究表明，多种原生动物（如Trichomonas vaginalis、Trypanosoma cruzi和Leishmania spp.）能够分泌细胞外囊泡（EVs）；此外，亦发现寄生性蠕虫可在活体宿主体内释放EVs⁷。寄生虫来源的EVs已被证实参与维持感染、致病性⁸以及免疫调节过程⁹。近期针对血吸虫属的研究，包括曼氏血吸虫（Schistosoma mansoni，S. mansoni）¹⁰

方案

所有动物实验均经中国农业科学院上海兽医研究所本地伦理委员会批准（许可证编号：SHVRIAU-14-0101）。

1. 体外 培养 血吸虫

注意： 血吸虫 具有生物危害性。操作蠕虫、血吸虫悬浮液或其他相关生物材料时，工作人员应始终佩戴乳胶手套。新西兰兔通过感染约2,000条尾蚴建立模型。 通过 腹部暴露。从感染的兔子体内采集肝脏阶段的血吸虫。 S. japonicum 感染后28天通过灌注肝门静脉和肠系膜静脉收集尾蚴。虫体采集步骤已在先前报道小鼠研究的相关文献中提及。¹⁸.

1. 在500 mL烧杯中收集寄生虫。用200 mL预热（37 °C）的PBS（pH 7.4）彻底且轻柔地清洗3次。
2. 每个90 mm培养皿中分离约200对虫体。然后用50 mL预热（37 °C）的RPMI-1640培养基（含100 U青霉素和100 mg/mL链霉素）彻底且轻柔地清洗2次。
3. 将寄生虫置于40 mL预热的不含抗生素的RPMI-1640培养基中 ，在37 °C、5% CO₂条件下，以约5对虫/mL的密度在90 mm培养皿中培养2小时。
   注意事项....

结果

为了定量评估采用所述方案分离的日本血吸虫细胞外囊泡（SjEVs）的产量，我们使用BCA蛋白检测试剂盒测定从28天成虫获得的SjEVs的蛋白浓度。如表1所示，每100 mL培养基中分离得到的SjEVs蛋白浓度介于208 µg至250 µg之间（表1）。通过Malvern纳米颗粒分析仪测定的粒径显示，分离的SjEVs粒径范围为100 nm至400 nm，其中数量最多的群体粒径约为220 nm（图1）。进一步通过透射电子显微镜对SjEVs进行表征，结果显示EVs呈圆形囊泡状结构，直径约为100–200 nm（图2）。Western blot分析表明，所分离的SjEVs可被CD63抗体识别，而CD63是典型的EV标志蛋白（图3）。荧光显微镜观察显示，PKH67标记的SjEVs被NCTC克隆1,469细胞摄取，并主要分布于受体细胞的细胞质.......

讨论

近期关于细胞外囊泡（EVs）的研究表明，血吸虫来源的EVs在宿主-病原体相互作用中发挥着重要作用^3,9,12,16。为了进一步阐明其调控功能，从血吸虫中分离EVs至关重要。本文介绍了一种日本血吸虫（S. japonicum）EVs（SjEVs）的替代性分离方法。该方法可从成虫中获得粒径范围较广的SjEVs，大小介于100 nm至400 nm之间。后续的细胞摄取实验表明，按照本方案分离的EVs能够被受体细胞有效内化，且其携带的miRNA可能具有调控功能¹⁷。

不同类型的细胞均可分泌细胞外囊泡（EVs），这些囊泡也存在于多种体液中。¹⁹因此，在分离日本血吸虫EVs（SjEVs）的过程中，应避免人为引入外源性EVs。例如，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料
总外泌体分离试剂（来自细胞培养基）	ThermoFisher SCIENTIFIC	4478359	用于分离日本血吸虫细胞外囊泡
PKH67	Sigma-aldrich	MINI67	用于标记细胞外囊泡（Evs）
RPMI 1640 培养基	ThermoFisher SCIENTIFIC	11875119	用于寄生虫培养
青霉素-链霉素	ThermoFisher SCIENTIFIC	15140122
0.22μm 注射器滤器	Merck	SLGP033RB
SnakeSkin 透析管	Thermo SCIENTIFIC	68035
PEG8000	Sangon Biotech	A100159
RIPA 裂解液	Beyotime	P0013B
EMD Millipore™ Immobilon™ 西部印迹化学发光 HRP 底物（ECL）	Fisher scientific	WBKLS0100
DAPI	Cell Signaling Technology	4083
BCA 蛋白定量试剂盒	Beyotime	P0010
CD63 抗体	Sangon Biotech	D160973-0025
PVDF 膜	Bio-Rad	1704273
Formvar/碳支持膜 400 目	Ted Pella	01754-F
磷钨酸	Ted Pella	19402
抗小鼠 IgG-HRP	CWBIO	CW0102
NCTC 克隆 1469 细胞	ATCC	ATCC® CCL-9.1™
FBS	HyClone	SV30087.02
设备
GE 化学发光成像系统	GE	ImageQuant LAS4000mini
透射电子显微镜	Hitachi	H-7600
Milli-Q 超纯水系统	Milli-Q	Milli-Q Elix
Eppendorf 离心机	Eppendorf	Centrifuge 5804R
Zetasizer Nano 粒径分析仪	Malvern	Zetasizer Nano ZS
超速离心机	Beckman	Optima L-100 XP Ultracentrifuge
培养箱	ESCO	CCL-107B
显微镜	Zeiss	Zeiss Axin Observer Z1