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成体细胞外囊泡的分离与表征 日本血吸虫

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DOI：

10.3791/57514

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2018年5月22日

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1Shanghai Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Animal Parasitology, Ministry of Agriculture, 2Tianjin Agricultural University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

在此，我们介绍一种用于描述细胞外囊泡（EVs）分离的实验方案 体外 成人培养基 日本血吸虫.

摘要

细胞外囊泡（EVs）是由多种细胞释放到细胞外微环境中的膜性囊泡，代表一群大小在40至1,000 nm之间的异质性囊泡。大量证据表明，EVs在病原体与宿主相互作用中发挥重要的调控作用。深入理解血吸虫EVs有助于揭示血吸虫与宿主相互作用的分子机制，从而为开发抗血吸虫病的新策略提供依据。本文旨在通过提供一种从成虫中分离和表征EVs的实验方案，进一步研究EVs在血吸虫中的功能 日本血吸虫 (S. japonicum）。EVs 从 体外 采用离心法结合商用外泌体分离试剂盒从培养基中分离外泌体。所分离的 S. japonicum SjEVs 通常直径为 100 - 400 nm，可通过透射电子显微镜和蛋白质印迹法进行表征。使用 PKH67 荧光染料标记的 SjEVs 已证明其可被受体细胞内化。总体而言，本实验方案为从成虫血吸虫中分离细胞外囊泡提供了一种替代方法；所获得的 SjEVs 可适用于功能分析。

引言

细胞外囊泡（EVs）是一类由膜包裹的小型囊泡，内含多种蛋白质、脂质和核酸。近期研究表明，EVs在细胞间通讯中发挥关键作用，并参与调控多种生理过程，包括细胞发育、免疫调节、血管生成以及细胞迁移2,3,4,5。越来越多的证据表明，循环中的EVs、外泌体及其携带的miRNA可能作为某些疾病的潜在生物标志物6。

已有研究表明，多种原生动物（如Trichomonas vaginalis、Trypanosoma cruzi和Leishmania spp.）能够分泌细胞外囊泡（EVs）；此外，亦发现寄生性蠕虫可在活体宿主体内释放EVs7。寄生虫来源的EVs已被证实参与维持感染、致病性8以及免疫调节过程9。近期针对血吸虫属的研究，包括曼氏血吸虫（Schistosoma mansoni，S. mansoni）10,11 和日本血吸虫（S. japonicum）12，均表明成虫可分泌类外泌体囊泡，这些囊泡可能参与特定生物学过程的功能调控。

迄今为止，已有多种方法用于分离细胞外囊泡，例如超速离心法、超滤法13、基于聚合物的试剂法、尺寸排阻色谱法以及免疫亲和分离法。这些不同方法各自具有优势和局限性14。通常认为，超速离心法是囊泡分离的金标准方法。然而，该方法存在可能导致细胞外囊泡聚集的局限性14。

在血吸虫中，已有数种用于分离细胞外囊泡（EV）的方法被报道：包括超速离心法11,12,10以及使用商业化EV分离试剂盒16，适用于多个发育阶段（如虫卵16、童虫11、成虫10,12,17）。鉴于微囊泡的大小范围较广，可从数百纳米至数千纳米不等，我们开发了一种替代方法，结合使用台式离心机、超滤技术和商业化EV分离试剂盒，用于从日本血吸虫（Schistosoma japonicum）成虫中分离EV。所分离的EV直径通常为100–400 nm，并能成功被受体细胞内化。

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方案

所有动物实验均经中国农业科学院上海兽医研究所本地伦理委员会批准（许可证编号：SHVRIAU-14-0101）。

1. 体外 培养 血吸虫

注意： 血吸虫 具有生物危害性。操作蠕虫、血吸虫悬浮液或其他相关生物材料时，工作人员应始终佩戴乳胶手套。新西兰兔通过感染约2,000条尾蚴建立模型。 通过 腹部暴露。从感染的兔子体内采集肝脏阶段的血吸虫。 S. japonicum 感染后28天通过灌注肝门静脉和肠系膜静脉收集尾蚴。虫体采集步骤已在先前报道小鼠研究的相关文献中提及。18.

  1. 在500 mL烧杯中收集寄生虫。用200 mL预热（37 °C）的PBS（pH 7.4）彻底且轻柔地清洗3次。
  2. 每个90 mm培养皿中分离约200对虫体。然后用50 mL预热（37 °C）的RPMI-1640培养基（含100 U青霉素和100 mg/mL链霉素）彻底且轻柔地清洗2次。
  3. 将寄生虫置于40 mL预热的不含抗生素的RPMI-1640培养基中 ，在37 °C、5% CO2条件下，以约5对虫/mL的密度在90 mm培养皿中培养2小时。
    注意事项： RPMI 1640培养基不应含有血清，否则会引入外源性细胞外囊泡。

2. 预处理条件培养基

  1. 收集培养基，于 4 °C 下以 2,000 × g 离心 30 分钟，以去除虫卵和虫体皮层碎片。
  2. 将上清液转移至新的离心管中，使用 0.22 µm 注射器滤器过滤溶液。
  3. 将滤过的溶液收集至透析袋中（分子量截留值：3.5 kD），并在 4 °C 下用 8% PEG8000 溶液透析过夜。
    注意事项： 此步骤对于富集 SjEVs 以提高 SjEVs 分离产量至关重要。

3. SjEVs 的分离

  1. 将透析后的溶液转移至新离心管中，然后加入总体积0.5倍的外泌体提取试剂。
  2. 通过涡旋振荡或反复吹打充分混匀溶液，确保其均匀一致。
  3. 在2 °C至8 °C条件下孵育过夜。
  4. 在2 °C至8 °C条件下，以15,000 × g离心1小时。
  5. 吸除并弃去上清液。
    注意事项：囊泡（EVs）存在于管底的沉淀中（大多数情况下不可见）。
  6. 用2 mL PBS重悬EVs沉淀，随后将EVs溶液保存于-80 °C，待后续分析使用。

4. 通过蛋白质印迹法对细胞外囊泡进行表征

  1. 测定SjEVs样品的蛋白浓度， 例如， 通过BCA法测定。
  2. 在22.5 µL RIPA裂解缓冲液中制备10–20 µg的EVs，加入7.5 µL 4×上样缓冲液，于95 °C加热5分钟。
  3. 通过12% SDS-PAGE凝胶分离SjEVs蛋白。
  4. 将蛋白质转移至PVDF膜，用抗CD63抗体（1:1,000稀释）孵育，随后用抗兔IgG-HRP（1:5,000稀释）孵育。
  5. 使用ECL检测试剂进行膜显影，并通过化学发光成像系统检测信号。

5. 通过透射电子显微镜对细胞外囊泡进行表征

  1. 将2 µL分离的SjEVs加入200目铜网（镀有formvar膜）上，室温下晾干。
  2. 用2%磷钨酸染色1分钟，然后室温下晾干。
  3. 将铜网装载到透射电子显微镜的样品台上，暴露于80 kV电子束下进行成像。

6. SjEVs 用 PKH67 标记及细胞摄取实验

注意事项：除非另有说明，所有后续步骤均在室温（20 - 25 °C）下进行。

  1. 将5 µg SjEVs溶液转移至锥底聚丙烯管中，并加入RPMI 1640培养基调整体积至12 mL。
  2. 在4 °C条件下，以110,000 × g离心90分钟，使SjEVs沉淀。
  3. 离心后，小心吸除上清液。
    注意：不应将PKH67乙醇染料直接加入SjEV沉淀中，否则会导致染色不均并降低细胞活力。
  4. 通过向SjEV沉淀中加入1 mL稀释液C，制备2x EV悬浮液；为确保完全分散，用移液器轻轻吹打重悬。
  5. 在使用稀释液C进行染色前，立即在聚丙烯离心管中将2 µL PKH67乙醇染料溶液加入1 mL稀释液C中，充分混合，制备新鲜的2x 染料溶液。
  6. 迅速将1 mL 2x EV悬浮液（步骤6.4）加入1 mL 2x 染料溶液（步骤6.5）中，并立即通过移液操作充分混匀样品。
  7. 在室温下孵育混合物4分钟。
  8. 加入4 mL FBS终止染色，随后孵育1分钟。
  9. 加入RPMI1640培养基调整体积至12 mL，然后在4 °C条件下以110,000 × g离心90分钟。
  10. 弃去上清液，并加入RPMI1640培养基重悬PKH67标记的SjEV沉淀。
  11. 在4 °C条件下以110,000 × g离心90分钟进行一次洗涤，然后加入PBS重悬SjEVs沉淀。

7. SjEVs 细胞摄取实验

  1. 在6孔板中接种哺乳动物细胞，如NCTC克隆1469细胞或HEK293T细胞（每孔2×105个细胞），并在培养箱中过夜培养。
  2. 加入5 µg PKH67标记的SjEVs，于37 °C继续培养2–4小时。
  3. 孵育结束后，吸除培养基，用PBS洗涤细胞两次。
  4. 用4%甲醛溶液固定细胞15分钟，再用PBS洗涤两次。
  5. 使用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对细胞核进行染色。
  6. 使用荧光显微镜观察细胞。

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结果

为了定量评估采用所述方案分离的日本血吸虫细胞外囊泡（SjEVs）的产量，我们使用BCA蛋白检测试剂盒测定从28天成虫获得的SjEVs的蛋白浓度。如表1所示，每100 mL培养基中分离得到的SjEVs蛋白浓度介于208 µg至250 µg之间（表1）。通过Malvern纳米颗粒分析仪测定的粒径结果显示，分离的SjEVs粒径范围为100 nm至400 nm，其中数量最多的群体粒径约为220 nm（图1）。进一步通过透射电子显微镜对SjEVs进行表征，结果显示EVs呈圆形囊泡状结构，直径约为100–200 nm（图2）。Western blot分析表明，所分离的SjEVs可被CD63抗体识别，CD63是典型的细胞外囊泡标志物（图3）。荧光显微镜观察显示，PKH67标记的SjEVs可被NCTC克隆1,469细胞摄取，并主要分布于受体细胞...

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讨论

近期关于细胞外囊泡（EVs）的研究表明，血吸虫来源的EVs在宿主-病原体相互作用中发挥着重要作用3,9,12,16。为了进一步阐明其调控功能，从血吸虫中分离EVs至关重要。本文介绍了一种日本血吸虫（S. japonicum）EVs（SjEVs）的替代性分离方法。该方法可从成虫中获得粒径范围较广的SjEVs，大小介于100 nm至400 nm之间。后续的细胞摄取实验表明，按照本方案分离的EVs能够被受体细胞有效内化，且其携带的miRNA可能具有调控功能17。

不同类型的细胞均可分泌细胞外囊泡（EVs），这些囊泡也存在于多种体液中。19因此，在分离日本血吸虫EVs（SjEVs）的过程中，应避免人为引入外源性EVs。例如，...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究部分或全部得到了国家自然科学基金（31472187 和 31672550）以及中国农业科学院农业科技创新计划的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
材料
总外泌体分离试剂（来自细胞培养基）ThermoFisher SCIENTIFIC4478359用于分离日本血吸虫细胞外囊泡
PKH67Sigma-aldrichMINI67用于标记细胞外囊泡（Evs）
RPMI 1640 培养基ThermoFisher SCIENTIFIC11875119用于寄生虫培养
青霉素-链霉素ThermoFisher SCIENTIFIC15140122
0.22μm 注射器滤器MerckSLGP033RB
SnakeSkin 透析管Thermo SCIENTIFIC68035
PEG8000Sangon BiotechA100159 
RIPA 裂解液BeyotimeP0013B
EMD Millipore™ Immobilon™ 西部印迹化学发光 HRP 底物（ECL）Fisher scientificWBKLS0100 
DAPICell Signaling Technology4083
BCA 蛋白定量试剂盒BeyotimeP0010
CD63 抗体Sangon BiotechD160973-0025
PVDF 膜Bio-Rad1704273
Formvar/碳支持膜 400 目Ted Pella01754-F
磷钨酸Ted Pella19402
抗小鼠 IgG-HRPCWBIOCW0102
NCTC 克隆 1469 细胞ATCCATCC® CCL-9.1™
FBSHyCloneSV30087.02
设备
GE 化学发光成像系统GEImageQuant LAS4000mini
透射电子显微镜HitachiH-7600
Milli-Q 超纯水系统Milli-QMilli-Q Elix
Eppendorf 离心机 EppendorfCentrifuge 5804R
Zetasizer Nano 粒径分析仪MalvernZetasizer Nano ZS 
超速离心机BeckmanOptima L-100 XP Ultracentrifuge
培养箱ESCOCCL-107B
显微镜ZeissZeiss Axin Observer Z1

参考文献

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