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方法文章

使用 CRISPR/Cas9 核糖核蛋白在 C. elegans 中快速简便地生成基因组点突变的流程

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DOI：

10.3791/57518

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2018年4月30日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, University of Michigan

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用CRISPR-Cas9核糖核蛋白和同源依赖性修复模板对秀丽隐杆线虫（C. elegans）基因组进行编辑的方法。

摘要

成簇规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）-CRISPR相关蛋白9（Cas9）原核生物适应性免疫防御系统已被改造为一种强大的真核生物基因组精确编辑工具。本文介绍一种利用嵌合单链向导RNA（sgRNA）和CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合物（RNPs）在C. elegans中高效、精确地产生基因组点突变的快速简便方法。我们描述了一套完整的操作流程，包括sgRNA靶点选择、同源定向修复（HDR）模板设计、CRISPR-Cas9-RNP复合物的组装与递送，以及一种可高效快速鉴定正确编辑个体的基因分型策略。该方法不仅能够便捷地生成并鉴定目标基因组点突变个体，还能在约4至5天内以高效率检测其他复杂的插入缺失（indel）等位基因，显著降低筛选工作量。

引言

近年来，技术的进步极大地改变并加速了基因组精确编辑的能力。特别是CRISPR-Cas9系统，该系统依赖RNA引导的Cas9核酸酶在目标序列附近诱导产生双链断裂（DSB），已被广泛用于准确编辑大多数生物医学研究中常用模式生物的基因组1,2,3,4。值得注意的是，CRISPR-Cas9的使用甚至使在线虫（C. elegans）等难以操作的物种中进行基因组编辑成为可能5。无论物种如何，利用基于CRISPR-Cas9的基因组编辑系统产生点突变均依赖于三个核心组分：1）Cas9核酸酶，2）一条单链向导RNA（sgRNA），用于引导Cas9核酸酶靶向特定序列，以及3）由用户设计的同源定向修复（HDR）模板，其中包含所期望的编辑内容2。

有多种方法可用于将靶向sgRNA和Cas9核酸酶导入细胞，包括质粒、RNA以及基于病毒的递送方法6。近年来，直接递送预先组装的sgRNA-Cas9核糖核蛋白复合物（RNPs）已成为CRISPR-Cas9基因组编辑中一种强大且高效的工具7。直接递送预先组装的CRISPR-Cas9 RNPs具有若干显著优势，即：1）RNPs无需依赖细胞内的转录和翻译过程；2）RNPs可被迅速清除，从而通过缩短脱靶切割的时间窗口提高编辑特异性；3）RNPs不含外源DNA/RNA成分，可避免非天然序列通过随机整合插入宿主基因组。综上，这些特性可能在实现短暂而高效的靶向CRISPR编辑的同时，最大限度地减少脱靶效应。

我们描述了一种在 C. elegans 中引入位点特异性基因组修饰的简单且高效的实验方案。该方案包括靶向 sgRNA 和单链寡核苷酸（ssODN）HDR 模板的设计、sgRNA-Cas9 核糖核蛋白（RNP）复合物的制备与递送，以及用于明确鉴定正确编辑个体的基因分型策略。采用此策略，不仅可获得目标位点特异性修饰，还可能同时获得其他非特异性插入缺失（indel）突变。因此，该方法能够在 F1 代中利用单一策略生成等位基因系列，包括单等位基因突变、双等位基因突变以及插入缺失突变体。

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方案

所有动物护理和实验程序均遵循美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）以及密歇根大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指南。在整个实验方案中使用无RNase的溶液和移液器吸头。根据制造商的说明，使用RNase去污染溶液清洁工作区域、移液器、试管和离心机（参见材料表）。

1. sgRNA 靶点选择

  1. 使用网络浏览器，打开网页： http://crispor.tefor.net8
    1. 输入目标编辑位点两侧约 60 个碱基对（bp）的序列即 期望编辑位点上下游各 30 bp。
    2. 选择 秀丽隐杆线虫 从下拉菜单中选择基因组。
    3. 从下拉菜单中选择前间隔序列邻近基序（20 bp-NGG - SpCas9, SpCas9-HF1, eSPCas9 1.1）。
    4. 点击提交。在结果页面中，选择排名最高的、最接近目标编辑位点的靶序列。如果在输入的侧翼60 bp序列内没有合适的靶位点，可将查询序列扩展至最多100 bp即 所需编辑位置两侧各50 bp。
  2. 从可获取的来源 例如 synthego，获取一条20碱基的靶向sgRNA，具体参数如下：3 nmol；无修饰。
  3. 收到后，将含有冻干 sgRNA 的管子离心 >12,000 × g，室温离心1分钟。向管中加入60 µL无核酸酶的TE缓冲液，使用P200移液器轻轻吹打15–20次，充分重悬。最终浓度为50 µM。

2. 同源定向修复模板设计

  1. 设计一个ssODN HDR模板，包含：1）目标突变，2）一个独特的同框限制性内切酶位点，3）在NGG PAM序列中的一个或两个G的同义突变，以及4）分别位于第一个和最后一个突变两侧、长度为50 bp的5'和3'同源臂。图1C)9,10.
    1. 如果无法突变NGG PAM序列，可在sgRNA靶标识别序列内引入5至6个同义突变，以防止sgRNA介导的对ssODN HDR模板的切割。
  2. 从现有来源 例如 idtdna，获取 "超长DNA寡核苷酸" 参数如下：合成规模：4 nmol；修饰：无；纯化方式：标准脱盐。
  3. 收到后，将含有冻干 ssODN 的管子离心 >12,000 × g，室温离心1分钟。用无核酸酶的ddH₂O将ssODN轻轻重悬至终浓度为100 µM。2用P200移液器上下吹打15至20次。

3. 设计基因分型引物

  1. 设计一对引物，扩增覆盖基因组修饰区域的片段，以获得约 400 - 700 bp 的 PCR 扩增产物11。
  2. 优化 PCR 扩增循环条件，以产生单一且特异的扩增产物11。

4. 准备注射混合液

  1. 将 表1 中的试剂在 4 °C 条件下以最大转速离心 2 分钟。
  2. 按照 表1 列出的顺序，将试剂加入无核酸酶的 PCR 管中。
  3. 使用 P20 移液器轻轻吹打 10 次，充分混匀。
  4. 将注射混合物在室温下孵育 10 分钟。

5. 注射方案

  1. 用约一半的注射混合液填充注射毛细管12。剩余的注射混合液请保存，以防注射针头堵塞或断裂。
  2. 折断毛细管尖端，使在约20 - 30 p.s.i.压力下溶液能缓慢流出12。
    注意：过大的尖端直径会对线虫健康产生不利影响，并降低F1子代产量。
  3. 尽可能向每条性腺臂均注射10 - 15条年轻成虫线虫12。若无法实现，仅注射一条性腺臂亦可。
  4. 将注射后的线虫（P0）置于接种有OP50的大肠杆菌的35 mm线虫生长培养基（NGM）平板上，在室温下恢复1 - 2小时。随后使用铂金丝挑虫针将每条注射后的P0线虫单独转移至不同的接种有OP50的35 mm NGM平板上12。

6. 筛选 P0 平板和单个 mCherry(+) F1 个体

  1. 注射后两天，使用荧光体视显微镜鉴定含有在咽部表达 mCherry 的 F1 后代的 P0 平板（图 1D，第 2 - 3 天）。选择三个含有最多 mCherry(+) F1 个体的 P0 平板。
  2. 从选定的三个 P0 平板中，分别挑取 8 - 12 个 mCherry(+) F1 个体，共计 24 - 36 个 mCherry(+) F1 个体，使用线虫挑针操作（图 1D，第 2 - 3 天）。
    注意：也可从这些 P0 平板中挑取 mCherry(-) 个体，但正确编辑个体的检出概率显著较低（图 2A）。
  3. 让单个 F1 个体在室温下自体受精并产卵 1 - 2 天。

7. 单条线虫 PCR 与基因分型

  1. 在产卵后1 - 2天，使用线虫挑取工具将F1代个体转移至各含有7 µL线虫裂解缓冲液的PCR条形管管盖中（表2，图1D，第4 - 5天）。
  2. 将PCR管在室温下以最大转速离心1分钟，使线虫沉降至管底，随后将管子置于-80 °C冷冻1小时。
    注意：线虫可在-80 °C长期保存。
  3. 使用PCR仪对冷冻的线虫进行裂解，程序如下：60 °C孵育60分钟，95 °C孵育15分钟，4 °C保温。
  4. 按表3所示配制PCR主混合液。
  5. 将21 µL PCR主混合液加入洁净的PCR管中，然后加入4 µL第3步所得的线虫裂解液。用移液器充分混匀，并按照试剂制造商的说明运行PCR程序（见材料表）。
  6. 使用DNA纯化与浓缩试剂盒对PCR反应产物进行纯化，操作步骤依照制造商说明书（见材料表）。通过向离心柱中加入10 µL水洗脱DNA。
  7. 按表4所示配制限制性内切酶主混合液。
  8. 将10 µL限制性内切酶主混合液加入每份纯化后的PCR反应产物中，37 °C孵育1 - 2小时13。
  9. 在120 V电压下，使用1x Tris-乙酸-EDTA（TAE）缓冲液对经酶切的PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分离14。

8. 编辑动物的鉴定与序列验证

  1. 检查经酶消化的样品中是否存在指示潜在编辑动物的条带14（图1D，第4-5天）。
    注意：加载N2对照以识别潜在的插入缺失突变，这些突变可表现为条带大小的偏移和/或意外且复杂的限制性内切酶消化条带模式。
  2. 在鉴定出潜在编辑动物后，使用剩余的3 µL虫体裂解液重复PCR反应。PCR程序完成后无需纯化或进行限制性内切酶消化。将PCR产物上样至1%琼脂糖凝胶，电泳分离后使用凝胶回收试剂盒15（见材料表）回收目标条带。
  3. 使用F1引物对凝胶回收的DNA进行Sanger测序16，以鉴定正确编辑的动物（图1A）。
    注意：由于同时存在野生型和工程化等位基因，杂合子测序结果将显示重叠的峰图。
  4. 为从经验证的杂合编辑动物中获得纯合子动物，挑取8–12只F2代单个动物，并重复步骤7–8。

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结果

人类超氧化物歧化酶1（SOD1）的突变约占家族性肌萎缩侧索硬化症的10%至20%，这是一种破坏性的神经退行性疾病，最终不可避免地导致瘫痪和死亡17。人类SOD-1是一种进化上保守的蛋白质，与秀丽隐杆线虫（C. elegans）SOD-1蛋白具有55%的序列一致性以及70%的相似性（图1B）。为了展示基于CRISPR-Cas9核糖核蛋白（RNP）方法的简便性、可行性和高效性，我们靶向了线虫的sod-1基因，旨在其基因组中引入与疾病相关的人源G93A变异（图1A）。

为了在 C. elegans 基因组中构建 G93A 突变，选择了一条其 PAM 识别位点位于 G93 密码子上游 3 个碱基处的 sgRNA（

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讨论

CRISPR-Cas9 系统是一种强大且高效的工具，可用于精确修饰模式生物的基因组。在此，我们证明了嵌合式 sgRNA20 与 ssODN HDR 模板联用，能够在 C. elegans 中高效地产生基因组点突变。重要的是，我们证明了当使用荧光作为共筛选标记时，RNP 递送可实现高效的编辑，突显了该技术的简便性与可靠性。

目前大多数用于秀丽隐杆线虫（C. elegans）基因组编辑的CRISPR-Cas9方法依赖于特定的遗传背景或共CRISPR（co-CRISPR）策略1。共CRISPR方法已被证明是一种极为有用的工具，可提高获得成功基因组编辑的几率。然而，该方法需要在标记位点引入一个可基于表型筛选的编辑，以富集目标基因组编辑。尽管该策略功能强大，但如果待编辑的品系本身或目标点突变具有可能被标记表型加剧或抑制的表型，则引入携带可筛选表型的突变可能是不理想的。此外，共CRISPR策略需要在标记位点产生额外的双链断裂，这可能增加脱靶效应的风险。本文介绍了一...

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披露

我们感谢Beg实验室成员对本文稿的审阅。菌株由 秀丽隐杆线虫 遗传学中心由美国国立卫生研究院研究基础设施项目（P40 OD010440）资助。A.A.B. 的实验室研究工作获得了美国国立卫生研究院（R01 NS094678）和肌肉萎缩症协会（MDA382300）的资助。

致谢

本报告无任何利益冲突。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
CRISPRevolution sgRNA  EZ试剂盒Synthego 公司嵌合sgRNA
无核酸酶 TE 缓冲液Synthego 公司随 sgRNA EZ 试剂盒提供
无核酸酶水Synthego 公司随 sgRNA EZ 试剂盒提供
4 nmol Ultramer DNA 寡核苷酸Integrated DNA TechnologiesssODN HDR 模板
Alt-R S.p. HiFi Cas9 核酸酶 3NLSIntegrated DNA Technologies1078728Cas9蛋白
pCFJ90 Addgene19327Pmyo-2::mCherry 标记质粒
KClSigmaP5405
HEPESSigmaH4034
DNA 纯化 &和浓缩器Zymo ResearchD4004
Zymoclean Gel DNA Recovery KitZymo ResearchD4002
Q5热启动高保真2X预混液New England BiolabsM0494L
蛋白酶KSigmaP2308
玻璃 硼硅酸盐玻璃 微量移液管Sutter InstrumentsBF100-78-10外径：1.0 mm。内径：0.78 mm
Trizma 盐酸盐SigmaT5941
MgCl₂2SigmaM2393
NP-40Sigma74385
Tween-20Fisher ScientificBP337-100
RNaseZap 去污染溶液Fisher ScientificAM9780

参考文献

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