本文介绍了一种利用CRISPR-Cas9核糖核蛋白和同源依赖性修复模板对秀丽隐杆线虫（C. elegans）基因组进行编辑的方法。
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本文介绍了一种利用CRISPR-Cas9核糖核蛋白和同源依赖性修复模板对秀丽隐杆线虫（C. elegans）基因组进行编辑的方法。
成簇规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）-CRISPR相关蛋白9（Cas9）原核生物适应性免疫防御系统已被改造为一种强大的真核生物基因组精确编辑工具。本文介绍一种利用嵌合单链向导RNA（sgRNA）和CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合物（RNPs）在C. elegans中高效、精确地产生基因组点突变的快速简便方法。我们描述了一套完整的操作流程，包括sgRNA靶点选择、同源定向修复（HDR）模板设计、CRISPR-Cas9-RNP复合物的组装与递送，以及一种可高效快速鉴定正确编辑个体的基因分型策略。该方法不仅能够便捷地生成并鉴定目标基因组点突变个体，还能在约4至5天内以高效率检测其他复杂的插入缺失（indel）等位基因，显著降低筛选工作量。
近年来，技术的进步极大地改变并加速了基因组精确编辑的能力。特别是CRISPR-Cas9系统，该系统依赖RNA引导的Cas9核酸酶在目标序列附近诱导产生双链断裂（DSB），已被广泛用于准确编辑大多数生物医学研究中常用模式生物的基因组1,2,3,4。值得注意的是，CRISPR-Cas9的使用甚至使在线虫（C. elegans）等难以操作的物种中进行基因组编辑成为可能5。无论物种如何，利用基于CRISPR-Cas9的基因组编辑系统产生点突变均依赖于三个核心组分：1）Cas9核酸酶，2）一条单链向导RNA（sgRNA），用于引导Cas9核酸酶靶向特定序列，以及3）由用户设计的同源定向修复（HDR）模板，其中包含所期望的编辑内容2。
有多种方法可用于将靶向sgRNA和Cas9核酸酶导入细胞，包括质粒、RNA以及基于病毒的递送方法6。近年来，直接递送预先组装的sgRNA-Cas9核糖核蛋白复合物（RNPs）已成为CRISPR-Cas9基因组编辑中一种强大且高效的工具
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所有动物护理和实验程序均遵循美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）以及密歇根大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指南。在整个实验方案中使用无RNase的溶液和移液器吸头。根据制造商的说明，使用RNase去污染溶液清洁工作区域、移液器、试管和离心机（参见材料表）。
1. sgRNA 靶点选择
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人类超氧化物歧化酶1（SOD1）的突变约占家族性肌萎缩侧索硬化症的10%至20%，这是一种破坏性的神经退行性疾病，最终不可避免地导致瘫痪和死亡17。人类SOD-1是一种进化上保守的蛋白质，与秀丽隐杆线虫（C. elegans）SOD-1蛋白具有55%的序列一致性以及70%的相似性（图1B）。为了展示基于CRISPR-Cas9核糖核蛋白（RNP）方法的简便性、可行性和高效性，我们靶向了线虫的sod-1基因，旨在其基因组中引入与疾病相关的人源G93A变异（图1A）。
为了在 C. elegans 基因组中构建 G93A 突变，选择了一条其 PAM 识别位点位于 G93 密码子上游 3 个碱基处的 sgRNA（
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CRISPR-Cas9 系统是一种强大且高效的工具，可用于精确修饰模式生物的基因组。在此，我们证明了嵌合式 sgRNA20 与 ssODN HDR 模板联用，能够在 C. elegans 中高效地产生基因组点突变。重要的是，我们证明了当使用荧光作为共筛选标记时，RNP 递送可实现高效的编辑，突显了该技术的简便性与可靠性。
目前大多数用于秀丽隐杆线虫（C. elegans）基因组编辑的CRISPR-Cas9方法依赖于特定的遗传背景或共CRISPR（co-CRISPR）策略1。共CRISPR方法已被证明是一种极为有用的工具，可提高获得成功基因组编辑的几率。然而，该方法需要在标记位点引入一个可基于表型筛选的编辑，以富集目标基因组编辑。尽管该策略功能强大，但如果待编辑的品系本身或目标点突变具有可能被标记表型加剧或抑制的表型，则引入携带可筛选表型的突变可能是不理想的。此外，共CRISPR策略需要在标记位点产生额外的双链断裂，这可能增加脱靶效应的风险。本文介绍了一.......
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我们感谢Beg实验室成员对本文稿的审阅。菌株由 秀丽隐杆线虫 遗传学中心由美国国立卫生研究院研究基础设施项目（P40 OD010440）资助。A.A.B. 的实验室研究工作获得了美国国立卫生研究院（R01 NS094678）和肌肉萎缩症协会（MDA382300）的资助。
本报告无任何利益冲突。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| CRISPRevolution sgRNA EZ试剂盒 | Synthego 公司 | 嵌合sgRNA | |
| 无核酸酶 TE 缓冲液 | Synthego 公司 | 随 sgRNA EZ 试剂盒提供 | |
| 无核酸酶水 | Synthego 公司 | 随 sgRNA EZ 试剂盒提供 | |
| 4 nmol Ultramer DNA 寡核苷酸 | Integrated DNA Technologies | ssODN HDR 模板 | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 核酸酶 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1078728 | Cas9蛋白 |
| pCFJ90 | Addgene | 19327 | Pmyo-2::mCherry 标记质粒 |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| DNA 纯化 &和浓缩器 | Zymo Research | D4004 | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | |
| Q5热启动高保真2X预混液 | New England Biolabs | M0494L | |
| 蛋白酶K | Sigma | P2308 | |
| 玻璃 硼硅酸盐玻璃 微量移液管 | Sutter Instruments | BF100-78-10 | 外径：1.0 mm。内径：0.78 mm |
| Trizma 盐酸盐 | Sigma | T5941 | |
| MgCl₂2 | Sigma | M2393 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| RNaseZap 去污染溶液 | Fisher Scientific | AM9780 |
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