趾印法旨在测量 体外 在多种条件下，转录的RNA与核糖体形成翻译起始复合物。本方案描述了一种用于趾印法分析哺乳动物RNA的方法，可用于研究帽依赖性翻译和IRES驱动的翻译。
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摘要
摘要
翻译起始是蛋白质合成的限速步骤，也是细胞调控其蛋白质产出的关键节点。蛋白质合成的调控对于细胞应激反应至关重要，而其失调则与多种疾病状态（如癌症）密切相关。例如，尽管细胞应激会通过抑制帽依赖性起始来降低全局翻译水平，但某些应激反应蛋白仍可通过非帽依赖的方式被选择性翻译。特定的RNA调控元件，如细胞内核糖体进入位点（internal ribosome entry sites, IRESes），能够介导这些特定mRNA的翻译。鉴定此类mRNA并表征其调控机制，一直是分子生物学研究的重要方向。趾印法（toeprinting）是一种用于研究RNA结构与功能（特别是与翻译起始相关）的方法。趾印法的目标是评估 体外 转录的RNA在多种条件下与核糖体形成稳定的复合物，以确定参与核糖体结合的序列、结构元件或辅助因子——这是高效翻译起始的前提。结合其他技术，如蛋白质印迹分析和多核糖体分析，引物延伸抑制实验（toeprinting）可对翻译起始调控机制进行系统而可靠的表征。
引言
由于翻译过程消耗了细胞的大部分能量，因此翻译受到严密调控是合理的1。相反，在应激反应和疾病状态（如癌症）中，常可观察到翻译的失调以及随之而来的蛋白质产出改变1,2。转录调控的一个主要优势在于细胞能够快速改变其蛋白质产出，以响应各种刺激3。因此，翻译调控代表了一种能够影响细胞存活与死亡的重要机制1,2,3。在翻译的各个步骤中，起始阶段是调控最严格且最复杂的环节3。简而言之，大多数真核生物mRNA含有一个5' m7G帽结构，该结构几乎总是其翻译所必需的。帽依赖性起始需要真核起始因子eIF4E、eIF4A和eIF4G（即帽识别复合物）与mRNA的5'端结合。包含eIF2结合的起始tRNA和eIF3的43S前起始核糖体复合物，通过eIF4G与eIF3的相互作用被招募至mRNA的5'端。据认为，前起始复合物在eIF4A（一种RNA解旋酶）的协助下沿mRNA扫描，直至定位到起始密码子（AUG）。随后形成48S起始复合物，并将tRNA送入核糖体的P位点。最终，60S和40S核糖体亚基结合形成80S起始复合物，继而进入翻译延伸阶段1,3,4。相比之下，内部核糖体进入位点（IRESes）可通过直接将40S核糖体亚基招募至起始密码子，从而绕过对5'帽结构的需求3。生理应激条件下，由于关键的通用真核起始因子（eIFs）发生修饰，导致整体mRNA翻译受到抑制。然而，非经典翻译起始机制使得某些mRNA的选择性翻译得以进行，这些mRNA通常编码应激反应蛋白，而非经典翻译起始的失调与癌症等疾病状态相关1,2。特定的RNA调控元件（如细胞内的IRESes）可介导此类mRNA的翻译2,3。
转录调控中一个特别有趣的研究方向是理解特定mRNA的规范翻译与非规范翻译的机制。趾印法（Toeprinting）是一种能够对特定RNA的翻译起始机制进行深入研究的技术。 体外趾印分析的总体目标是评估目标RNA在不同条件下与核糖体形成翻译起始复合物的能力，以确定哪些序列、结构元件或辅助因子对于高效的翻译起始是必需的。例如，在缺乏5'帽子结构时，核糖体的招募可能受到阻碍，而内部核糖体进入位点（IRES）的存在则可能促进核糖体的招募。
该技术的原理是 体外 转录目标RNA，在含有翻译组分（或纯化组分）的细胞提取物中孵育，以形成起始复合物，随后用特异性引物对RNA进行逆转录。稳定的RNA-核糖体复合物将导致逆转录在核糖体的3'边缘停滞，即所谓的“趾印”（toeprint）5,6,7.
在本实验方案中，核糖体亚基、eIFs、tRNAs 以及 IRES 反式作用因子（ITAFs）均由兔网织红细胞裂解液（RRL）提供，操作便捷。该方案的另一优势在于使用荧光标记的引物和基于荧光的凝胶成像系统，而非放射性标记引物。这省去了额外步骤，包括引物的放射性标记、凝胶干燥以及曝光至增感屏的过程。荧光条带可在电泳运行过程中实时记录，从而获得更高的分辨率。本文以无帽结构的X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）IRES RNA 为例进行说明，尽管该技术也可用于分析带帽结构的mRNA8。
与在细胞裂解物中检测翻译过程最终产物的西方印迹分析不同，趾印分析（toeprinting）是一种 体外 研究RNA上翻译起始复合物形成的简化方法。该简化方法可对调控翻译起始的底物或因子进行高精度的详细研究（例如，加帽或未加帽的mRNA，IRES结构，poly-A尾的有无，特定蛋白因子的提供 等等因此，趾印法可用于研究不同的翻译模式8 或mRNA结构（如IRES）对蛋白质合成的影响9,10.
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方案
注意：RNA 极易被核糖核酸酶（RNases）降解。需采取标准预防措施以保持 RNA 的完整性。频繁更换手套。在本实验方案的所有步骤中，使用带滤芯的吸头、无核酸酶的塑料耗材和无核酸酶的试剂。所有溶液均使用无核酸酶水或焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的水配制。
1. 溶液的配制
- 配制趾印法缓冲液：20 mM Tris-HCl (pH 7.6)、100 mM KOAc、2.5 mM Mg(OAc)2、5% (w/v) 蔗糖、2 mM 二硫苏糖醇 (DTT) 和 0.5 mM 精脒。
- 将 DTT 和精脒分装成单次使用量，于 -20 °C 保存，以避免反复冻融。
注意：DTT 和精脒应在使用前立即加入趾印法缓冲液中。不含 DTT 和精脒的缓冲液溶液可于 -20 °C 保存。
- 将 DTT 和精脒分装成单次使用量，于 -20 °C 保存，以避免反复冻融。
- 将 85 mM 5'-鸟苷亚氨基二磷酸 (GMP-PNP) 和 91 mM 三磷酸腺苷 (ATP) 分装成小份，于 -20 °C 保存。
- 配制 450 mL 的 6% 聚丙烯酰胺-7 M 尿素凝胶混合液：67.5 mL 40% 丙烯酰胺:双丙烯酰胺 (19:1)、189 g 尿素、112.5 mL 5× TBE (Tris/硼酸/乙二胺四乙酸 (EDTA)) 和 120 mL 水。通过在 37 °C 水浴或加热板上搅拌加热溶解尿素。过滤溶液（例如，使用 0.2 μm 硝酸纤维素真空滤膜）。
注意：该溶液可在 4 °C 保存至少一个月。
警告：单体丙烯酰胺为可通过皮肤吸收的神经毒素。操作时务必避免皮肤接触（即，佩戴手套、实验服和护目镜）。聚丙烯酰胺也应小心处理，因为聚合反应可能无法完全进行。 - 配制甲酰胺上样染料：95% 甲酰胺、18 mM EDTA、0.025% (w/v) 十二烷基硫酸钠 (SDS)、0.025% (w/v) 溴酚蓝、0.025% (w/v) 二甲苯青。于 -20 °C 保存。
- 将 1 nmol 引物（5' CTCGATATGTGCATCTGTA；5' 端标记 IRDye 800）溶解于 100 μL 水中，得到 10 pmol/μL 的工作浓度。分装成单次使用量（约 10 µL），避光保存于 -20 °C。
2. mRNA的制备
- 通过聚合酶链式反应（PCR）从合适的模板扩增用于合成 mRNA 的 DNA 模板（即，根据具体情况使用基因组DNA或质粒DNA。按照制造商说明书使用高保真DNA聚合酶，反应条件如下（35个循环）：变性，98 °C，10 s；退火，53 °C，20 s；延伸，72 °C，30 s。
注意：上游引物（5' AAGCTTAATACGACTCACTATAG）包含T7启动子序列，可用于RNA转录；下游引物（5' T51GAATTCGGATCCGACCGTGG）包含51个胸腺嘧啶残基，以提供转录RNA的poly-A尾。请注意，RNA也可以 体外 从质粒DNA转录而来。 - 使用合适的转录试剂盒 体外 从DNA模板转录含有IRES的RNA或加帽RNA。按照制造商说明书操作。在标准的20 μL反应体系中制备RNA样本。用2单位无RNase的DNase在37 °C处理新合成的RNA 30分钟。
- 用无核酸酶水将经DNase处理的RNA稀释至110 µL，加入110 µL酸性酚， 涡旋5秒，室温下以20,000 × g离心3分钟。取100 µL水相转移至新的1.5 mL离心管中，加入10 µL 3 M醋酸钠，涡旋2秒。 加入3倍体积的100%乙醇，涡旋5秒，于-20 °C过夜沉淀RNA。
- 离心 >20,000 × g，4 °C 离心 30 分钟，弃上清液。用 500 µL 冰冷的 70%（v/v）乙醇洗涤沉淀，再次离心。尽可能吸尽上清液，将沉淀在空气中干燥 5–10 分钟。注意勿使沉淀脱落。
- 将RNA重悬于适量无核酸酶的水中，使其工作浓度为0.5 μg/μL。可立即使用或于-80 °C保存。
3. 脚趾印迹反应
- 在1.5 mL微量离心管中混合15 μL兔网织红细胞裂解液（RRL，未经核酸酶处理）、1 μL（40单位）RNase抑制剂、1 µL 91 mM ATP（终浓度1.82 mM）和1 µL 85 mM GMP-PNP（终浓度1.7 mM）。30 °C孵育5分钟。
注意：RRL应分装为单次使用量，以避免反复冻融。一个关键对照是不加RRL的反应，用于阐明由于RNA二级结构导致的逆转录自然暂停现象。 此对照中用趾印缓冲液替代RRL。 - 加入0.5 µg（1 µL）RNA，并在30 °C孵育5分钟。
- 加入22 µL趾印缓冲液，并在30 °C孵育3分钟。
- 加入0.5 µL（5 pmol）IRDye标记的引物，在冰上孵育10分钟。
- 加入2 µL 25 mM dNTPs（终浓度：每种1 mM）、2 µL 100 mM Mg(OAc)2、1 µL禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶（AMV-RT）和3.5 µL趾印缓冲液。最终体积为50 μL。
- 在30 °C下孵育反应体系45分钟。
- 加入200 µL无核酸酶水，立即用250 µL 25:24:1苯酚:氯仿:异戊醇（pH约8.0）抽提。涡旋5秒，室温下以20,000 × g离心3分钟。将水相转移至新的1.5 mL微量离心管中，加入3倍体积的100%乙醇，涡旋5秒，于-20 °C沉淀过夜。
- 在 >20,000 × g 条件下于4 °C离心30分钟，弃上清。用500 µL预冷的70%（v/v）乙醇洗涤DNA沉淀。在 >20,000 × g 条件下于4 °C再离心15分钟。尽可能吸除上清，空气干燥沉淀5–10分钟。注意不要使沉淀脱落。
- 将沉淀溶解于6 μL无核酸酶水中，加入3 μL甲酰胺加样染料。
4. 测序反应
- 使用2.1步骤中的DNA模板和3.4步骤中IRDye标记的引物进行标准测序反应，以双脱氧核苷酸（ddNTPs）作为链终止子。采用合适的DNA测序试剂盒，并遵循制造商的说明。
- 将每种测序反应产物6 μL与3 μL甲酰胺上样染料混合。
5. 测序凝胶的制备与电泳
注意：本实验方案使用荧光凝胶成像仪和尺寸为 21 cm x 23 cm x 0.2 mm 的凝胶，但可根据需要适配于其他测序仪或凝胶尺寸。
- 用100%乙醇彻底清洗0.2 mm垫片以及短玻璃板（23 × 25 cm）和长玻璃板（30 × 25 cm），然后自然晾干。
- 将30 mL 6%聚丙烯酰胺-7M尿素凝胶混合液与200 μL 10%（w/v）过硫酸铵（APS）和20 μL四甲基乙二胺（TEMED）混合。小心倾注凝胶，避免产生气泡，并插入“锯齿状”凝胶梳。室温下静置1小时，使凝胶充分聚合。
- 组装测序装置，并向储液槽中加入1× TBE缓冲液。
- 在1500 V条件下预电泳15分钟，直至达到55 °C的最佳运行温度。
- 将样品与上样染料混合液（来自步骤3.9或4.2）在85 °C加热5分钟，取1 μL上样至测序凝胶中。
- 在1500 V条件下电泳8小时。仪器将实时读取条带信号。
- 拆卸装置，并妥善处理丙烯酰胺凝胶和电泳缓冲液。
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结果
我们此前已描述过XIAP IRES支持帽非依赖性翻译起始的能力 体外8,10趾印法是探究XIAP IRES起始复合物作用机制细节的关键技术。编码含有XIAP IRES的mRNA的DNA构建体（图1A）是 体外 转录后进行趾印分析。此处使用的XIAP IRES mRNA突变体变体如图所示 图1B. XIAP mRNA-核糖体复合物的逆转录产生了典型的阻滞信号，位于AUG下游+17至+19 nt处（图1C，泳道 1这表明核糖体被招募到起始密码子，并形成了稳定的核糖体-RNA复合物5,
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讨论
趾印法是一种强大的技术，可直接在高度受控条件下测定特定RNA支持翻译起始复合物形成的能力。本方案描述了一种简化的用于哺乳动物RNA的趾印法技术。采用兔网织红细胞裂解液（RRL）作为核糖体、真核起始因子（eIFs）、起始tRNA和IRES的便捷来源。 转-作用因子（ITAFs）。实验者可提供其选择的RNA，并可选择性地向趾印反应中添加特定的辅助因子。例如，48S 与 80S翻译起始复合物可根据趾印荧光强度的分布进行区分7起始复合物的形成取决于所使用的鸟嘌呤核苷酸类型。对于本文讨论的XIAP IRES而言，GMP-PNP与ATP共同作用可稳定48S前起始复合物，其特征表现为+17≥+18的趾印分布>+19. GMP-PNP 是一种不可水解的 GTP 类似物，可抑制核糖体亚基的结合，从而在 48S 阶段阻断翻译起始13相比之下，GTP、ATP 或 ATP 加 GTP 能够稳定 80S 起始复合物，其特征为 +17 位点的趾印分布<+18> +198
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披露
作者无利益冲突需要披露。
致谢
本研究由加拿大自然科学与工程研究理事会发现基金（RGPIN-2017-05463）、加拿大创新基金会约翰·R·埃文斯领袖基金（35017）、阿尔伯塔省创新计划以及阿尔伯塔省经济发展与贸易部资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DEPC（焦碳酸二乙酯） | Sigma | D5758-100ML | |
| TRIS 碱，超纯级 | JT Baker | 4109-01 | |
| KOAc（乙酸钾） | Bio Basic | PB0438 | |
| Mg(OAc)2（四水合乙酸镁） | Bio Basic | MB0326 | |
| 蔗糖，分子生物学级 | Calbiochem | 573113-1KG | |
| 亚精胺 | Sigma | 85558 | |
| GMP-PNP（5′-[β,γ-亚氨基]三磷酸鸟苷三钠盐水合物），0.1 M 溶液 | Sigma | G0635 | |
| ATP（5′-三磷酸腺苷）二钠盐，100 mM 溶液 | Sigma | A6559 | |
| 19:1 丙烯酰胺:双丙烯酰胺，40% | Bio Basic | A0006 | |
| 尿素 | Bio Basic | UB0148 | |
| 500 mL 瓶口过滤器，0.2 µm | Sarstedt | 83.1823.101 | |
| 甲酰胺 | Sigma | F9037-100ML | |
| EDTA（二钠盐，二水合物） | Bio Basic | EB0185 | |
| SDS | Bio Basic | SB0485 | |
| 溴酚蓝 | Bio Basic | BDB0001 | |
| 二甲苯青 FF | Bio Basic | XB0005 | |
| MEGAshortscript T7 体外转录试剂盒 | Ambion | AM1354 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 体外转录试剂盒 | Ambion | AM1344 | |
| 酸性酚:氯仿（5:1） | Ambion | AM9722 | |
| 25:24:1 酚:氯仿:异戊醇 | Invitrogen | 15593-049 | |
| 兔网织红细胞裂解液（RRL）。不得经过核酸酶处理。 | Green Hectares, USA | 联系 Green Hectares，索取 1:1 RRL:水混合液 | |
| RiboLock RNase 抑制剂（40 U/µL） | Thermo Fisher | E00382 | |
| 100 mM dNTPs | Invitrogen | 56172, 56173, 56174, 56175 | 等体积混合，得到每种 25 mM 的储存液。 |
| AMV-RT，10 U/µL | Promega | M5101 | |
| Sequenase Version 2.0 DNA 测序试剂盒 | Thermo Fisher | 707701KT | |
| Model 4200 IR2 DNA 分析仪 | LI-COR | 产品已停产 | |
| APS（过硫酸铵） | Bio Basic | AB0072 | |
| TEMED | Bio Basic | TB0508 | |
| Phusion 高保真 DNA 聚合酶 | New England Biolabs | M0530 | |
| Turbo Dnase | Thermo Fisher | AM2238 |
参考文献
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