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方法文章

前庭和听觉感觉器官的三维类器官培养

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DOI：

10.3791/57527

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2018年6月1日

 ,  , 
1Department of Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Keck School of Medicine of the University of Southern California, 2Caruso Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Keck School of Medicine of the University of Southern California, 3Howard Hughes Medical Institute and Laboratory of Sensory Neuroscience, The Rockefeller University

本文内容

摘要

小鼠椭圆囊和耳蜗的三维类器官培养在光学透明的I型胶原凝胶中，可保持组织固有的形态结构，通过调节基质硬度实现机械刺激，并允许病毒介导的基因递送。

摘要

由于哺乳动物内耳感觉器官难以进行实验操作和光学观察，对其研究具有挑战性。此外，尽管现有的培养技术允许生化干扰，但这些方法无法用于研究机械力和组织硬度在内耳感觉器官发育过程中的影响。本文介绍了一种完整的三维类器官培养小鼠椭圆囊和耳蜗的方法，可克服上述局限性。本文所述的三维基质硬度调节技术，能够调控对抗组织生长的弹性力，因此可用于研究机械力在内耳发育过程中的作用。此外，该培养体系支持病毒介导的基因递送，可用于基因功能获得和功能缺失实验。该培养方法可维持固有的毛细胞和支持细胞，有望成为前庭和听觉感觉器官传统二维培养的一种更优替代方案。

引言

哺乳动物器官发育的大多数方面的研究已得到促进 体外 系统。目前用于前庭感觉器官培养的两种主要方法为：游离式1 和贴壁的2 制备。两种方法均可用于研究毛细胞的易损性3 和再生1,4 体外此外，Notch 的发育作用5,6，Wnt7,8以及表皮生长因子受体（EGFR）9,10 内耳中的信号级联通路部分通过以下方法建立 体外 感觉上皮细胞培养。然而，细胞的生长与分化不仅受到形态发生素信号传导的调控，还受到细胞间接触、细胞外基质刚度以及机械拉伸或收缩等物理和力学信号的调控。在内耳发育过程中，此类力学刺激的作用难以进行研究 体内此外，现有的悬浮培养和贴壁培养方法均不适用于此类研究 体外. 本文介绍一种在不同硬度的I型胶原凝胶中进行三维类器官培养的方法。该方法在很大程度上保留了 体内 前庭和耳蜗感觉器官的结构，并可研究机械力对生长和分化的影响11.

由于机械刺激已知可激活下游分子事件，例如Hippo信号通路12,13,14,15，因此将机械刺激与生化和遗传操作相结合显得尤为重要。本文所述的培养方法允许通过病毒介导的基因递送，因而可用于研究内耳发育过程中的机械信号和分子信号11。

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方案

本文所述所有方法均已获得洛克菲勒大学和南加州大学动物护理与使用委员会的批准。

1. （可选）从小鼠尾部肌腱制备 I 型胶原溶液

注意： I 型胶原溶液可商业获取。请按照生产商的说明进行凝胶制备。

  1. 根据相关机构动物护理和使用委员会批准的方案，使用二氧化碳处死5至10只任何野生型品系的年轻成年（3至5周龄）小鼠16。收集尾巴，并通过将其浸入70%乙醇中至少4小时（室温）进行消毒。
    注意：应避免孵育超过48小时，因为这会导致组织过度脱水，从而阻碍肌腱提取过程。
  2. 用手术刀片在每条尾巴上做一个纵向切口，并用镊子剥离整个皮肤。将去皮的尾巴转移至一个盛有洁净70%乙醇的100 mm培养皿中，并将其切成10 mm长的片段。
    注意：应丢弃尾巴最细的部分，因其难以操作。
  3. 用镊子将每一段尾巴固定在培养皿底部，再用另一对精细镊子逐个从尾巴中提取肌腱。单根肌腱纤维应能几乎无阻力地被拉出。
    注意：旧的、钝头的#5镊子在此步骤中效果良好。
  4. 在无菌的分子级水中配制100 mL体积分数为0.1%的乙酸溶液，并取10 mL该溶液加入无菌的100 mm培养皿中。将肌腱转移至培养皿中，在室温下放置1小时，以使I型胶原变性。
  5. 使用无菌手术刀或钝头弯头虹膜剪将肌腱切碎成1至2 mm的碎片。将切碎的肌腱转移至无菌的50 mL离心管中，并加入0.1%乙酸溶液至终体积为50 mL。
    注意：每50 mL酸溶液使用四到五条尾巴，可获得2.0至2.5 mg/mL的I型胶原浓度。
  6. 将I型胶原溶液在4 °C下冷藏至少48小时，以促进蛋白质完全变性。每天两次使用台式涡旋振荡器以最大速度涡旋1分钟。
  7. 使用二辛可宁酸法测定溶液的蛋白浓度，通过添加0.1%乙酸溶液将I型胶原浓度调整至2.0至2.5 mg/mL，并在4 °C下保存。
    注意：I型胶原溶液可保存一至两年。
  8. （可选）将I型胶原溶液在4 °C下以2,000 × g离心1小时，并取上层半透明部分（约总体积的一半），用于第4节中制备光学透明的胶原凝胶。

2. 前庭和听觉器官的解剖

  1. 根据相关机构动物护理和使用委员会批准的方案，使用二氧化碳对任何品系的怀孕小鼠实施安乐死16。取出胚胎并断头。
    注意：可使用 Lfng-CreERT2/tdTomato 小鼠，在暴露于 4-羟基他莫昔芬时实现对支持细胞的永久标记17。
  2. 使用 70% 乙醇清洁所有工作表面和解剖器械，包括两把 #5 镊子和一把毛刀18，以进行消毒。
  3. 用无菌手术刀片做纵向切口，或使用两把 #5 镊子将每个头部沿中线分为两半。取出包含内耳的颞骨19，并将其放入盛有 15 mL 冰上预冷的汉克斯平衡盐溶液（HBSS）的 60 mm 培养皿中。将培养皿保持在冰上。
    注意：已成功使用 E13.5 至 E18.5 不同发育阶段的胚胎。
  4. （可选）将内耳置于含有 30 mL 冰上预冷 HBSS 的 50 mL 锥形管中，轻轻振荡洗涤，并更换 HBSS 三至四次。将锥形管保持在冰上。
    注意：此步骤可减少组织培养可能的污染，并迅速将温度降至 4 °C，从而防止组织降解和细胞死亡。
  5. 使用两把精细的 #5 镊子将内耳从颞骨中分离，并每次转移三至四个内耳至盛有冰上预冷 HBSS 的 60 mm 培养皿中。
  6. 解剖前庭感觉器官。
    1. 将内耳腹侧朝上放置，定位椭圆囊。使用两把 #5 镊子去除围绕前庭器官的软骨组织。轻轻切断前庭神经、椭圆囊与球囊之间的连接以及半规管，如图1所示。轻柔地将椭圆囊及其附着的上半规管和水平半规管的壶腹从内耳中拉出。
      注意：该方法适用于 E16.5 至 E18.5 阶段的内耳。请保留软骨碎片，用于下文第 3 节。
  7. 解剖耳蜗。
    1. 使用两把 #5 镊子去除围绕听觉器官的软骨组织。轻轻切断耳蜗基部与球囊之间的连接，如图1所示。
      注意：对于 E13.5 至 E14.5 阶段，可在解剖前用含 0.25% I 型胶原酶的磷酸盐缓冲液（PBS）在室温下处理内耳 5 分钟，以软化软骨。请保留软骨碎片，用于下文第 3 节。
  8. 使用配备宽口防粘枪头的 200-µL 移液器，将椭圆囊和耳蜗转移至盛有生长培养基的 30 mm 培养皿中。培养基成分为 DMEM/F12，添加 33 mM D-葡萄糖、19 mM 碳酸氢钠、15 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）、1 mM 谷氨酰胺、1 mM 烟酰胺、20 mg/L 表皮生长因子、20 mg/L 成纤维细胞生长因子、10 mg/L 胰岛素、5.5 mg/L 转铁蛋白和 5 µg/L 硒酸钠。
  9. 将椭圆囊样本在含 5% 二氧化碳的组织培养孵育箱中于 37 °C 维持最多 3 小时，以允许解剖过程中造成的上皮切口愈合。耳蜗样本应在解剖后 10 分钟内转移至胶原凝胶中。
    注意：由于解剖在冰上预冷的 HBSS 中进行，因此无需预先将生长培养基加热至 37 °C。

3. （可选）通过添加不同浓度的软骨细胞调节I型胶原凝胶的硬度

注意： 软骨细胞分离方法参照 Gosset et al.20 进行了修改

  1. 在无菌1×PBS中配制1%的胶原酶I溶液，分装为100–200 µL等份，于-80 °C保存。使用时置于冰上解冻，避免反复冻融。
  2. 使用精细镊子收集从10–12只耳的前庭和听觉器官解剖后剩余的软骨组织。将结缔组织和内耳组织与软骨分离，将软骨转移至30 mm培养皿中，并加入300 µL无菌生长培养基。
  3. 使用无菌手术刀片或钝头弯角虹膜剪将组织切碎，使软骨碎片长度约为0.5 mm。
  4. 向含软骨的培养基中加入胶原酶I，使终浓度为0.25%。将培养皿置于37 °C、含5%二氧化碳气体的组织培养孵箱中。每20分钟用1,000 µL移液器剧烈吹打一次，直至软骨碎片完全解离且在溶液中不可见，随后继续孵育20分钟。
    注意：对于椭圆囊样本的制备，软骨细胞的分离可在步骤2.9期间进行；整个过程约需2小时（需吹打3–4轮）。
  5. 将细胞悬液收集至15 mL锥形离心管中，用无菌1×PBS调整体积至10 mL。在4 °C下以800 × g离心5分钟，弃去上清液，将细胞重悬于10 mL无菌1×PBS中。再次在4 °C下以800 × g离心5分钟，并弃去上清液。
    注意：必须对细胞进行两次洗涤；残留的胶原酶I会降解I型胶原凝胶。
  6. 使用200 µL移液器向细胞沉淀中加入100 µL培养基，轻柔吹打使细胞重悬。使用血细胞计数板计数细胞，并在使用前将细胞置于冰上保存。
  7. 为提高凝胶刚度，将软骨细胞加入已中和的I型胶原凝胶溶液（第1节）中，并迅速混匀，使细胞在凝胶固化前均匀分布。
    注意：I型胶原凝胶的弹性模量（刚度的度量）随添加的软骨细胞数量呈线性增加11。该关系由实验确定的线性函数 E = 206·Nc + 15 描述，其中 E 为帕斯卡（Pa）表示的弹性模量，Nc 为以百万计的软骨细胞数量。有关凝胶刚度测量的详细方案，请参阅原始文献11。

4. 将前庭或听觉感觉器官置于I型胶原凝胶中

  1. 在无菌的1.5 mL离心管中，通过混合160 µL含酚红pH指示剂的10x PBS、133 µL 0.34 M氢氧化钠、70 µL 0.9 M碳酸氢钠和40 µL 1 M HEPES，配制I型胶原蛋白聚合溶液。将离心管置于冰上保存。
    注意：此配方可制备2 mL I型胶原凝胶所需的聚合溶液，但可根据需要按比例调整。
  2. 在预冷的1.5 mL离心管中，将100 µL聚合溶液与400 µL I型胶原溶液在冰上轻轻吹打混匀。如需增加凝胶硬度，可加入含软骨细胞的50 µL生长培养基，并按照第3节所述方法轻轻混匀。
  3. 将500 µL中和后的I型胶原溶液转移至预冷的带有10 mm玻璃底插件的30 mm培养皿，或四孔板中的一个孔内。
    注意：为防止I型胶原过早或不均匀聚合，所有试剂必须始终保持在冰上。
  4. 迅速将耳蜗或球囊转移至中和后的I型胶原溶液中，并使用无菌毛刀18或精细镊子调整组织至理想位置。
    注意：胶原聚合开始后1–2分钟内溶液逐渐变浑浊，聚合现象即可被观察到。
  5. 待组织周围的溶液完成聚合后，将培养皿或四孔板置于充有5%二氧化碳的37 °C组织培养孵育箱中孵育20分钟，以确保聚合完全。
  6. 每培养皿加入3 mL含0.5%胎牛血清（FBS）的生长培养基，或每四孔板孔加入500 µL相同培养基。将培养物维持在充有5%二氧化碳的37 °C组织培养孵育箱中。如需标记增殖细胞，可在生长培养基中额外添加10 µM 5-乙炔基-2´-脱氧尿苷（EdU）。
    注意：可根据需要使用更高浓度的FBS。

5. 前庭和听觉感觉器官三维培养中的病毒注射

  1. 将所需的病毒在冰上解冻，并在0.5 mL锥形管中与台盼蓝溶液混合，使染料终浓度为0.05%。使用10–20倍浓度的染料以避免病毒被显著稀释。保持在冰上。
    注意：5型腺病毒对感染椭圆囊中的支持细胞效果最佳19，而Anc80型腺相关病毒可同时感染椭圆囊和耳蜗中的毛细胞和支持细胞21。
  2. 在双目解剖显微镜最高放大倍数下观察，用洁净的精细镊子折断在微电极拉制仪上制备的玻璃针尖。
    注意：优化微电极拉制仪的参数设置至关重要。针体长度为9–12 mm、尖端开口为20–30 µm的玻璃针效果最佳。
  3. 从培养箱中取出一个感觉器官培养物。将玻璃针连接至显微注射仪，并吸入2–3 µL染料与病毒的混合液。在双目解剖显微镜下观察，将针头推进至感觉器官内。
  4. 轻柔地将针尖穿过三维椭圆囊培养物顶部的间充质层和上皮层。注入病毒混合液，直至椭圆囊和壶腹的腔隙充满蓝色染料。
    注意：由于便于接近感觉器官，底部为玻璃的10 mm培养皿是注射操作的最佳选择。
  5. 在充有5%二氧化碳的37 °C组织培养孵育箱中孵育。
    注意：当病毒载体中使用绿色或红色荧光蛋白时，病毒转导24小时后即可观察到荧光信号。

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结果

来自胚胎耳朵的前庭和听觉感觉器官，在模拟低刚度胚胎环境的40-Pa I型胶原凝胶中培养11，保持相对正常的三维结构（图1）并维持毛细胞和支持细胞（图2 和 图3）。尽管支持细胞密度降低了超过30%（Student's t-测试：n = 4， p <0.004）且毛细胞密度减少60%（Student's t-测试：n = 5， p <0.0001）在耳石器培养中培养3天后（图2），同一时期黄斑区的面积增加了一倍以上11 （n = 3， p = 0.0002）。这表明，本文所述的三维培养方法可显著增加支持细胞的数量

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讨论

在发育过程中介导内耳生长和分化的分子信号已被广泛研究5,6,7,8,9,10。然而，从椭圆囊模型系统获得的证据表明，通过细胞连接感知并激活Hippo信号通路的机械信号在这些过程中也发挥着重要作用2,11,22。此外，死亡毛细胞从感觉上皮中被挤出以及随后通过转分化形成新的感觉受体的过程均可影响残余支持细胞所感知的机械力，从而促使它们在再生过程中重新进入细胞周期。本文所述的三维培养系统为研究机械力在内耳发育过程中对生长调控的作用1...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 A. Jacobo 博士、J. Salvi 博士和 A. Petelski 为本实验方案所依据的原始研究做出的贡献。我们还要感谢 J. Llamas 和 W. Makmura 提供的技术支持与动物饲养工作。本研究得到了美国国立耳聋与其他沟通障碍研究所（NIDCD）培训基金 T32 DC009975、NIDCD 基金 R01DC015530、Robertson 治疗发展基金以及 Caruso 家族基金会的资助。最后，我们感谢霍华德·休斯医学研究所（Howard Hughes Medical Institute）的支持，Hudspeth 博士是该研究所的研究员。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
#10 外科手术刀片Miltex4-110
#5 镊子Dumont11252-20
100 mm 培养皿SigmaP5856-500EA
250 µL 大孔径移液器吸头USA Scientific1011-8406
30 mm 玻璃底培养皿Matsunami Glass USA CorporationD35-14-1.5-U
4 孔板Thermo Fisher Scientific176740
4-羟基他莫昔芬 SigmaH7904
60 mm 培养皿Thermo Fisher Scientific123TS1
乙酸 Sigma537020
Ad-GFPVector Biolabs1060
抗-GFP，鸡IgY组分InvitrogenA10262 
抗-Myo7AProteus Biosciences25-6790
抗-Sox2 抗体 (Y-17)Santa Cruzsc-17320
双喹啉羧酸法蛋白定量试剂盒Thermo Fisher Scientific23225
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 成像试剂盒Thermo Fisher ScientificC10340
胶原酶 IGibco17100017
D-葡萄糖SigmaG8270
DMEM/F12 Gibco11320033
表皮生长因子SigmaE9644
胎牛血清 (FBS)Thermo Fisher Scientific16140063
成纤维细胞生长因子SigmaF5392
Flaming/Brown 微量移液管拉制仪Sutter InstrumentP-97
谷氨酰胺SigmaG8540
HBSSGibco14025092
血细胞计数板 DaiggerEF16034F
HEPESSigmaH4034
胰岛素SigmaI3536
虹膜剪 Zepf Medical Instruments08-1201-10  
显微注射仪NarishigeIM-6
烟酰胺SigmaN0636
PBS (10X), pH 7.4Gibco70011044
PBS (1X), pH 7.4Gibco10010023
酚红 pH 指示剂 SigmaP4633 
纯乙醇，200 证明Decon Labs 2716
RFP 抗体ChromoTek 5F8
碳酸氢钠SigmaS5761
氢氧化钠SigmaS8045
亚硒酸钠SigmaS5261
台式涡旋振荡器 VWR97043-562
转铁蛋白SigmaT8158
台盼蓝 SigmaT6146

参考文献

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