Method Article

小鼠初级少突胶质的快速特异磁分离

DOI:

10.3791/57543

⸱

May 21st, 2018

 ,  , 
1Program in Molecular and Cellular Biology, State University of New York Downstate Medical Center, 2Department of Neurology and Rehabilitation, University of Illinois at Chicago

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们描述了主鼠标少突胶质的磁隔离, 它允许对体外区域性的细胞进行快速和特定的隔离。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

高效、健壮的分离和培养原少突胶质 (生命线)是体外研究 oligodendroglia 的重要工具, 也是脱髓鞘疾病 (如多发性硬化) 的生物学和Pelizaeus Merzbacher 样疾病 (PMLD)。在这里, 我们提出了一个简单而有效的选择方法, 磁隔离三期 O4+ preoligodendrocytes 细胞从新生小鼠幼崽。由于未成熟的 OL 在产后 7 (P7) 的啮齿动物脑白质中占80% 以上, 这种隔离方法不仅保证了高细胞的产量, 而且还对已经致力于 oligodendroglial 谱系的生命线的具体隔离, 减少了可能隔离污染的细胞, 如星形胶质细胞和其他电池从老鼠的大脑。这种方法是对以前报告的技术的修改, 并提供少突胶质的纯度在80% 以上约4小时。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

少突胶质 (生命线) 是中枢神经系统 (CNS)1 的 myelinating 细胞。在严格调节的环境中, 主少突胶质的分离和培养是体外研究 oligodendroglia 的重要工具, 也是脱髓鞘疾病 (如多发性硬化症) 的生物学基础2.这需要一个高效且健壮的少突胶质隔离和区域性方法3。在本研究中, 我们利用了一个独特的少突胶质细胞表面标记的表达, 以实现一个快速和具体的改进的隔离技术。

已经确定了四个不同的少突胶质成熟阶段, 每一个发育阶段都表现出独特的细胞表面标记(图 1)。这些单元格表面标记可以通过特定的抗体4、5识别, 并可用于在特定阶段隔离生命线。在第一阶段, 少突胶质前体细胞 (OPCs) 有能力增殖, 迁移, 并明确表达血小板衍生生长因子受体 (血小板 Rα)6, 苷 A2B5, 蛋白多糖NG27, 8, 聚唾液酸-神经细胞黏附分子9和脂肪酸结合蛋白 7 (FABP7) 10. OPCs 具有双极性形态学, 细胞体的对立两极产生的短过程很少, 这是神经前体细胞11的特征。

少突胶质细胞成熟图;有标记物的阶段：OPC、少突胶质细胞前、未成熟、成熟。
图 1: 在鼠标少突胶质开发过程中单元格表面标记的表达式。A2B5、GalC (O1)、NG2、O4 和血小板因子 Rα等生命线细胞表面标记物可用于在特定发育阶段用特定抗体分离少突胶质。  请单击此处查看此图的更大版本.

在第二阶段, OPCs 产生 preoligodendrocytes 和表达的细胞膜不仅 OPC 标记, 而且 sulfatide (硫酸 galactolipid) 承认 O4 抗体12,13, GPR17 蛋白14,一直持续到未成熟的少突胶质 (OL) 阶段。在这个阶段, preoligodendrocytes 扩展多极短过程。Preoligodendrocytes 是大鼠和鼠脑白质中 2 (P2) 的主要 OL 阶段, 其小种群为未成熟的生命线15。

在第三阶段, 未成熟的生命线继续表达 O4, 失去 A2B5 和 NG2 标记的表达, 并开始表达 galactocerebroside C16。在这个阶段, 苏丹生命线行动致力于 oligodendroglial 谱系, 成为后有丝分裂细胞与长分支分支17,18。未成熟的 OL 构成80% 以上的啮齿动物白色物质在 P7 和此时第一个 MBP+单元格被观察15,19,20,21。因此, 在 P7 中分离生命线能保证细胞高产。

在 OL 发育的最后和第四阶段, 成熟的 myelinating 蛋白 (髓鞘碱性蛋白 (MBP), proteolipid 蛋白 (), 髓鞘相关糖蛋白 (MAG) 和髓鞘少突胶质糖蛋白 (MOG) 22, 23 ,24,25,26。在这个阶段, 成熟的生命线延伸膜, 形成紧凑的包裹鞘围绕轴突和能够 myelinate。这与观察老鼠和老鼠大脑的情况一致, 在 P1419,20,21中, MBP+细胞变得越来越丰富。

自从 Fewster 和同事在1967年首次隔离少突胶质27 以来, 已实施了几种方法, 用于从啮齿动物中枢神经系统中分离生命线, 其中包括immunopanning28、29、30、荧光活化细胞分选 (资产管制署) 利用细胞表面特异抗原28,31, 差分梯度离心32,33,34,35和基于不同中枢神经胶质细胞差异粘附的震动方法36,37。然而, 现有的文化方法有局限性, 特别是在纯度、产量和执行程序38所需的时间方面。因此, 需要更有效的少突胶质隔离方法。

本文提出了一种简便、有效的选择方法, 用于磁三 O4+ preoligodendrocytes 细胞与新生小鼠幼崽的分离。此方法是对金刚砂et所报告的技术的修改。39和 Dincman et 。40 , 并提供在大约4小时以上80% 的少突胶质制备纯度。

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究中使用的小鼠根据纽约州立大学南部医学中心实验室动物资源 (DLAR) 协议15-10492 号的指导方针予以照顾。

注: 原少突胶质与新生儿 (P5-P7 野生型 C57Bl/6N) 小鼠分离。在这一阶段, 不成熟的生命线构成了80% 以上的啮齿动物白质, 确保高细胞产量。所有缓冲和试剂组合物都可在材料表的末尾提供。

1. 盖玻片准备

注: 聚 d-赖氨酸 (PDL)/层粘连蛋白涂层盖玻片应在 OL 隔离之前准备好。

  1. 将 #1 德国玻璃盖玻片放入50毫升锥形管中, 并加入35毫升70% 乙醇以清洁它们。
  2. 关闭管, 把它放在一个 nutating 搅拌机, 并在室温下孵化至少30分钟, 同时轻轻摇摆。盖玻片可以在一夜之间孵化。
  3. 丢弃70% 乙醇。
  4. 用去离子水清洗盖玻片3次, 每次用真空吸水的时候都要去除水分。
  5. 增加30-35 毫升的 PDL 50 µg/毫升的盖玻片在50毫升管, 足以覆盖盖玻片。
  6. 将含有盖玻片的50毫升管放在 nutating 搅拌机上, 在室温下孵育至少30分钟, 同时轻轻摇动。
  7. 用去离子水清洗盖玻片3次, 每次用真空吸水时, 都要去除水分。
  8. 将盖玻片转移到含有去离子水的60毫米培养皿中。
  9. 使用 P200 吸管尖将盖玻片排列成覆盖培养皿整个表面的层。
  10. 小心, 从盘子里取出水, 抽吸真空。
  11. 除去盖玻片周围的多余水分, 让他们一夜之间用盖子打开, 在罩下紫外线照射下晾干。
    注: 在无菌培养皿中, PDL 涂布玻璃盖玻片可储存在4摄氏度, 长达三月。
  12. 将盖玻片放入24井板中, 每井一条, 使用细钳。
  13. 将盖玻片移动到井的中心, 确保边缘不触及井壁。
  14. 在 B27NBMA 中添加100µL 10 µg/毫升层粘连蛋白 (参见材料表), 从每个盖玻片的中心开始, 以圆形的方式向边缘移动以覆盖所有区域。
    注: 由于层粘连蛋白参与了 OL 维护, 并促进分化为成熟的生命线, 它是体外区域性41,42,43,44的重要的 OL 生存因素。
  15. 在 5% CO2的37°c 孵化器中孵化出至少1小时的板材, 或者直到生命线准备好进行电镀。

2. 鼠大脑皮层离解

  1. 牺牲产后5-7 天老 C57Bl/6N 鼠幼崽通过快速斩首与剪刀以前清洗过70% 乙醇。
    注: 5-6 只新生小鼠脑皮质用于每种制剂。平均来说, 一只老鼠的大脑产生 1-1. 5 x 106生命线。
  2. 用小的解剖剪刀剪下中线的头皮皮肤, 再缩回以暴露头骨。
  3. 小心地沿着中线切开头骨, 从头骨后部的开口开始朝向前额区域, 用剪刀抬起, 以避免损伤大脑。然后, 用头骨后部的开口沿着头骨的底部切开每个眼窝。
  4. 使用细钳轻轻地戏弄皮层远离中脑, 并转移到一个60毫米的组织培养皿含有7毫升的 B27NBMA。对每个大脑重复步骤2.2 到 2.4, 将解剖过的皮层集中。
  5. 将皮质转移到一个新的60毫米组织培养皿中, 内含5毫升离解缓冲液 (B27NBMA、20-30 u/毫升木瓜蛋白酶和 2500 U DNase I)。
  6. 将皮质切成小块约1毫米3使用 #15 手术刀刀片和孵化20分钟在37°c, 5% CO2孵化器。
  7. 添加1毫升牛生长血清 (BGS), 以停止酶反应。
  8. 使用10毫升血清吸管将皮质与离解介质转移至15毫升圆锥管。
  9. 轻轻地开始用10毫升的血清吸管吹打6-8 次, 慢慢地将脑组织分离出来, 用小心最小化气泡。
  10. 允许组织块安定2-3 分钟和转移上清到新鲜的管子。
  11. 添加3毫升的 B27NBMA 含有 10% BGS/2500 U DNase I 到组织颗粒。
  12. 使用5毫升血清吸管轻轻地分离脑组织, 而吹打上下6-8 次。注意尽量减少气泡。
  13. 允许组织块解决2-3 分钟。
  14. 将上清液转移到新鲜的管子上。添加3毫升的 B27NBMA 含有 10% BGS/DNase I 的组织颗粒。
  15. 用 P1000 吸管尖轻轻地分离脑组织, 同时吹打媒体和脑组织的混合。重复步骤2.13 和 2.14, 直到没有大块的组织保持或直到 B27NBMA 包含 10% BGS/DNase 我累了, 谁先来。注意尽量减少气泡。
  16. 池细胞悬浮与早先上清液。
  17. 将 70-µm 细胞过滤器放置在50毫升管中。使用10毫升血清吸管, 通过在70µm 细胞过滤器轻轻地通过池细胞悬浮。
  18. 通过添加1毫升含有 10% BGS/DNase i 的 B27NBMA 来清洗细胞过滤器。
  19. 丢弃细胞过滤器。用含有 10% BGS/DNase i 的 B27NBMA, 将体积带到30毫升。
  20. 将细胞悬浮液转移到两个15毫升锥形管上。离心机细胞悬浮10分钟在 200 x g。
  21. 移除上清液, 不让暴露在空气中的细胞离开。由于细胞碎片, 上清将多云。添加3毫升的 B27NBMA 含有 10% BGS 的颗粒。
  22. 用 P1000 吸管仔细分离细胞颗粒。将体积带到15毫升, 含 B27NBMA 10% BGS。
  23. 通过细胞悬浮在一个新鲜的40µm 细胞过滤器。
  24. 通过添加含有 10% BGS 的 B27NBMA 1mL 来清洗细胞过滤器。丢弃细胞过滤器。
  25. 将体积带到30毫升, 含 B27NBMA 10% BGS。
  26. 将细胞悬浮液转移到 2 x 15 毫升锥形管上。离心机细胞悬浮10分钟在 200 x g。
  27. 除去大部分上清液, 而不让暴露在空气中的细胞离开。并用重悬5毫升的冰冷磁细胞分选 (MCS) 缓冲细胞颗粒。

3. 细胞计数和生存能力的测定

  1. 稀释100µL 的细胞悬浮与400µL 的台盼蓝溶液在1.5 毫升离心管, 以达到1:5 稀释 0.4% (瓦特/v)。
  2. 将盖玻璃放在 hemocytometer 室上, 用 P10 吸管和避免溢出填充两个腔, 用10µL 细胞稀释。溶液将通过毛细管作用在盖玻璃下通过。
  3. 将 hemocytometer 放在显微镜舞台上, 用40X 放大器调整焦距。
    注意: 细胞计数是使用手持计数器在每五个正方形 (四个角落和一个中心) 记录。只有非可行的细胞吸收染料, 并出现蓝色, 而活和健康的细胞出现圆形和屈光, 不吸收蓝色染料, 允许确定的数量的可行和总细胞每毫升。

4. 隔离 O4+少突胶质

  1. 离心机细胞悬浮在 200 x g 为10分钟。
  2. 用真空抽吸法小心丢弃上清液, 避免细胞暴露于空气中。
  3. 并用重悬每 1 x10 7 总单元格中的90µL 的 MCS 缓冲区中的颗粒, 然后添加10µL 的 anti-O4 珠, 每 1 x10 7 单元格。
  4. 用手指轻轻地弹15毫升圆锥管, 将细胞悬浮和珠子混合4-5 次。
  5. 在4摄氏度孵育15分钟的混合, 用手指 4-5 timesevery 5 分钟弹15毫升圆锥管。
  6. 将每 1 x 107单元格中的 MCS 缓冲区的2毫升缓冲液轻轻地添加到管中来清洗混合。离心机的混合在 200 x g 10 分钟。
  7. 小心使用真空吸尘, 避免细胞暴露在空气中, 从而丢弃上清液。并用重悬每个 1 x10 7 单元格中的500µL 的 MCS 缓冲区中的细胞颗粒。
  8. 将磁选机连接到磁选机支架上。将选择列附加到磁选器上, 并将40µm 单元格滤网放在该列的顶部。将两个15毫升或一个50毫升圆锥管置于分离柱下面, 以收集流过的水流。
  9. 用3毫升的 MCS 缓冲器预冲洗40µm 细胞过滤器和分离柱, 让缓冲器在柱子上运行, 不让它干。
  10. 添加细胞悬浮和珠子的混合到细胞过滤器, 并进入选择栏。
  11. 用1毫升的 MCS 缓冲器清洗40µm 细胞过滤器。
  12. 丢弃细胞过滤器, 让细胞、珠子和缓冲器混合在一起, 不让它干。
  13. 用3毫升的 MCS 缓冲器和1次用 OL 扩散介质清洗分离柱3次。
  14. 将分离柱从磁选机中取出, 快速将其放入15毫升锥形管中, 立即加入5毫升的 OL 扩散介质。
  15. 将柱塞放在立柱顶部, 并将被标记的细胞冲出15毫升锥形管。
  16. 删除100µL 细胞悬浮, 以确定细胞计数和可行性使用台盼蓝和 hemocytometer 如第3节所示。
    注意: 80% 以上的细胞活力被认为是可以接受的, 可以继续使用苏丹生命线的文化, 但生存能力大于90% 是最佳的。

5. 隔离 O4+少突胶质的电镀

  1. 使用 OL 扩散介质, 将细胞悬浮液稀释至欲望电镀密度 (每盖玻片 5 x10 5 单元格)。
    注意: OL 播种密度非常重要, 因此在进行前应使用组织培养显微镜确定合适的细胞密度。播种密度低于1万细胞/盖玻片可能导致细胞存活不良。在镀层密度为1万到2.5万时, OL 形态分化缓慢45。我们在至少5万细胞/盖玻片的播种密度下, 以确保细胞存活。
  2. 将含有层粘连蛋白的盖玻片24井板移动到组织培养罩中。
  3. 从每个盖玻片中去除层粘连蛋白, 并用100µL 的 OL 悬浮液取代。
  4. 在37°c/5% CO2孵化器孵化的生命线, 最大45分钟, 以促进对盖玻片的 OL 黏附力。
  5. 孵化后, 从孵化器中取出24井板。将24井板块的每一个井与500µL 的 OL 扩散介质一起淹没。
  6. 将生命线恢复到37°c/5% CO2孵化器, 以增加24小时。
  7. 24小时后, 去除扩散介质, 用 OL 分化培养基替代, 诱导分化。
  8. 把生命线放回孵化器中, 不要移除, 直到细胞准备好固定。
    注意: pH 值的变化对苏丹生命线行动和降低细胞活力是有害的, 因此应该避免从孵化器中不必要地去除生命线的文化。

6. 免疫荧光染色

  1. 为检测细胞表面标记物 (NG2、O1 和 O4), 从油井中取出介质。
  2. 添加250µL 的小鼠杂交瘤上清液含有主要抗体对 O1 (未稀释) 13 和 O4 (未稀释) 13 和兔多克隆对 NG2 (1:150 稀释在 B27NBMA)。
    注: 如果使用商用 anti-O1 和 anti-O4 抗体, 最好利用制造商建议的稀释。
  3. 在37°c/5% CO2孵化器中, 用主抗体在45分钟内孵化细胞。
  4. 用 0.05% Tween-20/1X PBS 清洗两次。在室温下用4% 多聚甲醛 (4% 粉煤灰) 固定细胞, 10 分钟。
  5. 每5分钟洗三次, 0.05% Tween-20/1X PBS。
  6. 稀释 Alexa 488-共轭山羊抗鼠 IgM 或抗兔 IgG 二级抗体 (1:400) 在 B27NBMA。
  7. 从盖玻片中卸下 0.05% Tween-20/1X PBS。在黑暗的室温下, 用二级抗体在室温下孵化细胞1小时。
  8. 每5分钟洗三次, 0.05% Tween-20/1X PBS。
  9. 用于检测内部标记 (GFAP) 的双色染色, 在室温下取出 0.05% Tween-20/1X PBS 和块/通透缓冲器15分钟的块状/permeabilize 细胞。否则继续执行步骤6.17。
  10. 删除块/通透缓冲区, 并添加250µL 鸡抗胶质 (1:100) 稀释在块/通透缓冲。
  11. 室温下以1小时的抗胶质细胞孵化。每5分钟洗三次, 0.05% Tween-20/1X PBS。
  12. 稀释 Alexa 594-共轭山羊抗鸡 IgG 二级抗体 (1:400) 在 B27NBMA。
  13. 从盖玻片中卸下 0.05% Tween-20/1X PBS。在黑暗的室温下, 用二级抗体在室温下孵化细胞1小时。
  14. 每5分钟洗三次, 0.05% Tween-20/1X PBS。
  15. Counterstain 与 4 ', 6-diamidino 2-苯基吲哚 (DAPI), 并装入包含 antifade 的 DAPI 安装介质的细胞。
  16. 让盖玻片在黑暗中过夜, 在室温下治疗。
  17. 用荧光显微镜对染色的细胞进行图像处理。
    注意: 在本协议中, 使用均匀曝光时间对单元格进行40X 放大成像。

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Results

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本研究的目的是为 O4+主鼠标少突胶质建立一个改进的隔离方法, 要求对目标单元格进行尽可能少的操作。整个过程从幼崽的安乐死到电镀细胞在盖玻片需要大约 4 h, 并且这里显示的数据代表三个独立实验。组织离解后, 每项独立实验的平均 4.3 0.46 x 107细胞被隔离, 其生存能力为 91% @ 5.6%。在使用 anti-O4 标记磁性微珠磁隔离之后, 平均获得了6.9 个 0.38 x 106生命线 (1-1. 5 x 106每鼠标), 这是 16.2% @ 1.6% 的总细胞最初离解;生存能力为 96.3%, 3.5%。

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文提出了一种高效分离高纯度未成熟小鼠少突胶质培养的方法。与以前发布的协议39、40相比, 此方法产生了更高的纯度, 具有低得多的 GFAP 阳性星形胶质细胞和其他非特征细胞的极低百分比。重要的是要指出, 这些是未成熟的生命线行动已经致力于 oligodendroglial 血统。因此, 这些细胞对于研究分化的早期阶段是不有用的。

Dincman 协议40的一项修改是从我们的扩散介质中去除碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)。据报道,体外, bFGF 作为一个强大的有丝分裂因子, 不仅抑制 OPCs 的分化, 但也减少进程的数量46,47。此外, bFGF 增加了 oligodendroglial 谱系48传代细胞的少突胶质分化和增殖。因...

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Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项研究得到了国家多发性硬化协会 (RG4591A1/2) 和国立卫生研究院 (R03NS06740402) 的赠款的支持。作者感谢 Ivan 博士及其实验室成员提供实验室空间、设备和建议。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10ml 血清移液管Fisher Scientific13-676-10J
10ml 注射器 Luer-Loc tipBD、Becton Dickinson309604
15ml 锥形管Falcon352097
24 孔组织培养板Falcon353935
40µM 细胞过滤器Fisher Scientific22368547
50ml 锥形管Falcon352098
5ml 血清移液管Fisher Scientific13-676-10H
60mm 组织培养板Falcon353002
70µM 细胞过滤器Fisher Scientific22363548
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG （H+L） 二抗InvitrogenA11001
Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgM （H+L） 二抗InvitrogenA21042
Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgM （H+L） 二抗InvitrogenA11008
Alexa Fluor 594 山羊抗鸡 IgG （H+L） 二抗InvitrogenA11042
抗 O4 微珠 - 抗 O4MicroBeadsMiltenyi Biotec130-094-543
Apo-转铁蛋白人SigmaT1147
Autofil 完整瓶顶过滤器组件，0.22 微米过滤器，250 毫升USA Scientific6032-1101
Autofil 完整瓶顶过滤器组装，0.22um 过滤器，250ml美国科学6032-1102
B27 补充剂Invitrogen17504-044
硼酸SigmaB7660
牛生长血清 （BGS）GE Healthcare 生命科学SH30541.03
BSAFisher ScientificBP-1600-100
CNTFPeprotech450-50
d-生物素SigmaB4639
脱氧核糖核酸酶 I （DNAse I）沃辛顿LS002007
EDTAFisher ScientificS311
落射荧光显微镜，配备奥林巴斯 DP70 相机奥林巴斯Bx51
羽毛一次性手术刀Andwin ScientificEF7281C
ForskolinSigmaF6886
德国玻璃盖玻片，#1 厚度，直径 12 毫米圆形NeuVitroGG-12-oz
GFAP 抗体AvesGFAP
葡萄糖Fisher ScientificD16-1
GlutaMAXInvitrogen35050-61
胰岛素Invitrogen12585-014
磁选机架 - MACS 多架Miltenyi Biotec130-042-303
磁选机 - MiniMACS 分离器Miltenyi Biotec130-042-302
Millex PES 0.22µm 过滤器单元MilliporeSLG033RS
封片剂 - 含 DAPI 的 Prolong Gold，ThermoFisherP36930
N-乙酰半胱氨酸 （NAC）SigmaA8199
天然小鼠层粘连蛋白Invitrogen23017-015
Neurobasal 培养基A Invitrogen10888-022
神经营养因子-3 （NT-3）Peprotech450-03
NG2 抗体MilliporeAB5320
木瓜蛋白酶WorthingtonLS003126
PBS，不含 Ca2+ 和 Mg2+SigmaD5652
PDGFPeprotech100-13A
培养皿Falcon351029
聚-D-赖氨酸SigmaP6407
初生霉素ant-pm-2
黄体酮SigmaP8783
腐胺SigmaP5780
选择柱-LS 色谱柱Miltenyi Biotec130-042-401
亚硒酸钠SigmaS5261
微量元素 B康宁25-000-CI
三碘甲状腺原氨酸 （T3）SigmaT6397
Triton-XSigmaT8787
台盼蓝溶液康宁25-900-CI
吐温 20SigmaP1379
B27NBMA487.75 mL Neurobasal 培养基 A;10 mL B27 添加剂;1 mL 初蛙星;1.25 mL 谷氨酰胺;过滤、消毒并储存在 4 °C 直到使用。
B27NBMA + 10% BGS27 mL B27NBMA; 3 mL 牛生长血清
CNTF 溶液原液（10 &微量;克/毫升;1000X）从 Peprotech 订购 （450-50）。根据制造商的比例为 0.1 至 1 mg/ml缓冲液（例如 DPBS + 0.2% BSA）中的指令（可能因批次而异）。储存在 -80 °C.
工作溶液（10 µg/ml， 1000X）
1.在 DPBS 溶液中加入 0.2% BSA （Fisher scientific BP-1600-100） 并过滤消毒。
2.将主原液等分试样稀释至 10µ在无菌、冷藏的 0.2% BSA/DPBS 中 g/ml.
3.等分试样（20&微量;升/管）并在液氮中快速冷冻
4.将等分试样储存在 -80 °C 下。
d-生物素储备液（50 &微量;克/毫升;5000X）将 d-生物素 （Sigma-B4639） 重悬于 50 &微量的双蒸 H 2 O 中;g/ml（例如 2.5 mg 在 50 ml ddH 2 O 中）。重悬可能需要相当多的搅动/涡旋，或在 37&°C 时短暂地轻度升温。如果 d-生物素仍然不溶解，则可以配制浓度较低的 d-生物素（例如 10µg/ml），并向B27NBMA添加更高的体积 （1/1000），而不是 1/5000）。储存在 4&°C。
DNase I 储备液1.以 12,500 U 脱氧核糖核酸酶 I / ml 溶于冰上冷却的 HBSS 中。
2.过滤 在冰上消毒
3.分装 200 &微量;l 并在 -20°C.
4 下冷冻过夜。将等分试样储存在 -20 至 -30°C 下。
杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水（不含 Ca2+ 和 Mg2+）小袋溶解在 1 升水中，产生 1 升培养基，每升培养基含 9.6 克粉末。储存在 2-8 °C。
毛喉素储备液 （4.2 mg/ml;1000X）将 1 ml 无菌 DMSO 加入 50 mg 瓶装毛喉素 （Sigma-F6886） 中，并移液至重悬。转移到 15 ml 离心管中，加入 11 ml 无菌 DMSO，使其达到 4.2 mg/ml。等分试样（例如 20 µl） 并储存在 -20&°C 下。
汉克s 平衡盐 （HBSS） （Sigma1.量取 900 毫升水（温度 15-20 °C） 放入圆筒中并轻轻搅拌。
2.加粉搅拌至溶解。
3.用少量清水冲洗原包装，去除所有粉末痕迹。
4.添加到步骤 2.
5 中的解决方案中。每升最终><体积添加 0.35 克碳酸氢钠 （7.5% w/v）。继续搅拌直至溶解。
7.搅拌时将缓冲液的 pH 值调节至低于 pH= 7.4 的 0.1-0.3 个单位，因为它在过滤过程中可能会升高。建议使用 1N HCl 或 1N NaOH 来调节 pH.
8.加入额外的水，使最终体积达到 1 升。
9。使用孔隙率为 0.22 微米的膜过滤消毒。
10.储存在 2-8 °C。
胰岛素储备溶液（4000 µg/ml）解冻瓶子并分装 25 &微量;l 并储存在 -20&°C 下。
层粘连蛋白溶液在寒冷 （2°C 到 8 度;C） 避免凝胶形成。然后，分装到聚丙烯管中。储存在 5°C 至 -20°等分试样中的 C（例如 20 和微量;l） 并且不要反复冻融。层粘连蛋白可以在这些温度下储存长达六个月。
磁性细胞分选 （MCS） 缓冲液制备含有磷酸盐缓冲盐水 （PBS）、pH 7.2 和 0.5% 牛血清白蛋白 （BSA）、0.5 mM EDTA、5µg/ml 胰岛素，1 g/L 葡萄糖。通过过滤缓冲液进行灭菌和脱气，方法是将缓冲液通过 0.22 µm 米勒克斯滤波器。将缓冲液储存在 4°C 直到使用
N-乙酰基-L-半胱氨酸 （NAC） 储备液 （5mg/ml;1000X）将 N-乙酰-L-半胱氨酸 （Sigma-A8199） 以 5 mg/ml 的浓度溶解在 DMEM 中（例如 50 mg NAC 溶于 10 ml B27NBMA）。过滤、灭菌和等分试样（例如 20 & 微量;储存在 -20°C。
NT3 储备溶液（1 µ克/毫升;1000X）主库存：
从 Peprotech （450-03） 订购。根据制造商的含量为 0.1 至 1 mg/ml的指示（可能因批次而异），在缓冲液中（例如 DPBS + 0.2% BSA）。储存在 -80°C.

工作库存（1µ克/毫升;1000X）：
1.在 DPBS 溶液中加入 0.2% BSA 并过滤消毒。
2.将主储备液等分试样稀释至 1 &微量;在无菌、冷藏的 0.2% BSA/DPBS 中 g/ml.
3.等分试样（例如 20µ升/管）并在液氮中快速冷冻
4.将等分试样储存在 -80°C 下。
PDGF 储备溶液（10 &微量;克/毫升;1000X）主库存：
从 Peprotech 订购 （100-13A）。根据制造商的含量为 0.1 至 1 mg/ml缓冲液（例如 DPBS）+ 0.2% BSA 中的说明（可能因批次而异）。储存在 -80°C.

工作库存（1µ克/毫升;1000X）：
1.在 DPBS 溶液中加入 0.2% BSA 并过滤消毒。
2.将主原液等分试样稀释至 1µ在无菌、冷藏的 0.2% BSA/DPBS 中 g/ml.
3.等分试样（例如 20µ升/管）并在液氮中快速冷冻
4.将等分试样储存在 -80°C 下。
聚-D-赖氨酸 （1mg/ml;100X）0.5mg/ml 的浓度重悬于 0.15M 硼酸 pH 8.4 的聚-D-赖氨酸 （Sigma P6407） 中（例如 50mg 在 50ml 硼酸盐缓冲液中。过滤灭菌和等分试样（例如 100µl/tube）。储存在 -20°C。使用前，将 100X 原液 （1mg/ml） 稀释至 50 µ在无菌水中 g/ml。
少突胶质细胞增殖培养基参见 补充表 1
少突胶质细胞分化培养基参见 补充表 1
Sato 补充剂 （100X）参见 补充表 1
参考文献：试剂和配方列表采用自 Emery 等人 2013 年之前描述的方案（Emery， B. &Dugas， JC 通过免疫淘选从小鼠皮层中纯化少突胶质细胞谱系细胞。冷泉港 Protoc.2013 （9）， 854-868， doi：10.1101/pdb.prot073973， （2013）） 和 Dincman 等人。al. （Dincman， TA， Beare， JE， Ohri， SS &Whittemore， SR 分离皮质小鼠少突胶质细胞前体细胞。J 神经科学方法。209 （1）， 219-226， doi：10.1016/j.jneumeth.2012.06.017， （2012））
将以

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