小鼠原代少突胶质细胞的快速特异性免疫磁珠分离

摘要

我们描述了原代小鼠少突胶质细胞的免疫磁珠分离方法，该方法可快速、特异性地分离出细胞用于 体外 培养

摘要

高效且稳定的原代少突胶质细胞（OLs）的分离与培养，是研究少突胶质细胞发育以及多发性硬化和Pelizaeus-Merzbacher样疾病（PMLD）等脱髓鞘疾病生物学机制的有力工具。in vitro 此处我们介绍一种简单高效的免疫磁珠分离法，用于从新生小鼠中分离第三阶段 O4⁺ 前体少突胶质细胞。由于在出生后第7天（P7）时，未成熟OL占啮齿类动物脑白质的80%以上，该分离方法不仅能确保较高的细胞得率，还可特异性地分离已定向分化为少突胶质细胞系的OLs，从而降低星形胶质细胞及其他小鼠脑细胞等污染细胞被分离的可能性。本方法是在先前报道技术基础上的改进，可在约4小时内获得纯度超过80%的少突胶质细胞制备物。

引言

少突胶质细胞（OLs）是中枢神经系统（CNS）中的髓鞘形成细胞¹在严格调控的环境中分离和培养原代少突胶质细胞是一种有价值的工具，用于 体外 少突胶质细胞发育以及多发性硬化等脱髓鞘疾病生物学的研究²这需要一种高效且稳定的少突胶质细胞分离与培养方法³本研究利用少突胶质细胞特异性细胞表面标志物的表达，采用了一种改良的快速且特异的分离技术。

已鉴定出少突胶质细胞成熟的四个不同阶段，每个阶段均具有特定的细胞表面标志物表达特征（图1）。这些细胞表面标志物可被特异性抗体识别^4,5，并可用于分离特定阶段的少突胶质细胞。在第一阶段，少突胶质前体细胞（OPCs）具有增殖和迁移的能力，并特异性表达血小板源性生长因子受体（PDGF-Rα）⁶、神经节苷脂A2B5、蛋白聚糖NG2^7,8、多唾液酸-神经细胞黏附分子⁹以及脂肪酸结合蛋白7（FABP7）

方案

本研究中使用的小鼠均按照纽约州立大学下州医学中心实验动物资源部（DLAR）方案编号 15-10492 的指南进行饲养和管理。

注意：原代少突胶质细胞来源于新生（P5-P7 野生型 C57Bl/6N）小鼠。在此阶段，未成熟少突胶质细胞（OL）占啮齿类动物白质的 80% 以上，可确保较高的细胞得率。所有缓冲液和试剂的组成均列于材料表末尾。

1. 盖玻片准备

注意：应在少突胶质细胞分离前准备好经多聚-D-赖氨酸（PDL）/层粘连蛋白包被的盖玻片。

1. 将 #1 德国盖玻片放入 50 mL 圆锥形离心管中，加入 35 mL 70% EtOH 以清洗。
2. 盖紧管盖，置于摇床中，室温下轻轻摇动孵育至少 30 分钟；盖玻片也可过夜孵育。
3. 弃去 70% EtOH。
4. 用去离子水洗涤盖玻片 3 次，每次均用真空抽吸法去除水分。
5. 向 50 mL 管中的盖玻片加入 30–35 mL 浓度为 50 µg/mL 的 PDL，用量以能完全覆盖盖玻片为宜。
6. 将装有盖玻片的 50 mL 管置于摇床上，室温下轻轻摇动孵育至少 30 分钟。
7. 用去离子水洗涤盖玻片 3 次，每次均用真空抽吸法去除水分。
8. 将盖玻片转移至....

结果

本研究的目的是建立一种改进的O4⁺原代小鼠少突胶质细胞分离方法，以尽可能减少对靶细胞的操作。从处死幼鼠到细胞接种至盖玻片的整个过程约需4小时，本文所示数据来自三次独立实验。组织解离后，每次独立实验平均可获得4.3 ± 0.46 x 10⁷个细胞，细胞活力为91% ± 5.6%。经抗O4标记的磁性微珠进行免疫磁珠分离后，平均获得6.9 ± 0.38 x 10⁶个少突胶质细胞（每只小鼠可得1-1.5 x 10⁶个），占初始解离总细胞数的16.2% ± 1.6%；细胞活力为96.3% ± 3.5%。

讨论

本文介绍了一种高效分离高纯度小鼠未成熟少突胶质细胞培养物的方法。与先前发表的方案^39，40相比，该方法获得了更高的纯度，GFAP阳性星形胶质细胞含量显著更低，其他未鉴定细胞的比例也非常低。需要强调的是，这些细胞是已承诺进入少突胶质细胞系的未成熟OLs。因此，这些细胞不适用于分化早期阶段的研究。

对 Dincman 方案的一项改进⁴⁰ 去除增殖培养基中的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。已有报道称 体外，bFGF 作为一种强效有丝分裂原因子，不仅抑制少突胶质前体细胞（OPCs）的分化，还减少其突起的数量^46,47此外，bFGF 可促进少突胶质细胞系传代细胞的去分化与增殖 ⁴⁸因此，O4阳性细胞数量减少是合理的⁺ 细胞.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 ml 血清移液管	Fisher Scientific	13-676-10J
10 ml 注射器鲁尔锁扣式接头	BD，Becton Dickinson	309604
15 ml 锥形管	Falcon	352097
24孔组织培养板	Falcon	353935
40µm细胞滤筛	Fisher Scientific	22368547
50 ml 锥形管	Falcon	352098
5 ml 血清移液管	Fisher Scientific	13-676-10H
60 mm 组织培养板	Falcon	353002
70µm细胞滤筛	Fisher Scientific	22363548
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG（H+L）二抗	Invitrogen	A11001
Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgM（H+L）二抗	Invitrogen	A21042
Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgM（H+L）二抗	Invitrogen	A11008
Alexa Fluor 594 山羊抗鸡 IgG（H+L）二抗	Invitrogen	A11042
抗O4磁珠-抗O4微磁珠	Miltenyi Biotec	130-094-543
人转铁蛋白（无铁形式）	Sigma	T1147
Autofil 完整瓶顶过滤器组件，0.22 μm 滤膜，250 ml	USA Scientific	6032-1101
Autofil 完整瓶顶过滤器组件，0.22 μm 滤膜，250 ml	USA Scientific	6032-1102
B27 补充剂	Invitrogen	17504-044
硼酸	Sigma	B7660
牛生长血清（BGS）	GE Healthcare Life Sciences	SH30541.03
BSA	Fisher Scientific	BP-1600-100
CNTF	Peprotech	450-50
d-生物素	Sigma	B4639
脱氧核糖核酸酶 I (DNAse I)	沃辛顿	LS002007
EDTA	Fisher Scientific	S311
配备 Olympus DP70 相机的落射荧光显微镜	Olympus	Bx51
一次性羽毛状手术刀	Andwin Scientific	EF7281C
Forskolin	Sigma	F6886
德国玻璃盖玻片，1号厚度，直径12毫米，圆形	NeuVitro	GG-12-oz
GFAP 抗体	鸟类	GFAP
葡萄糖	Fisher Scientific	D16-1
GlutaMAX	Invitrogen	35050-61
胰岛素	Invitrogen	12585-014
磁力分离架 - MACS 多功能支架	Miltenyi Biotec	130-042-303
磁力分离器-MiniMACS 分离器	Miltenyi Biotec	130-042-302
Millex PES 0.22µm 滤器单元	Millipore	SLG033RS
封片剂——含 DAPI 的 Prolong Gold	Thermo Fisher	P36930
N-乙酰半胱氨酸（NAC）	Sigma	A8199
天然小鼠层粘连蛋白	Invitrogen	23017-015
Neurobasal 培养基 A	Invitrogen	10888-022
神经营养素-3（NT-3）	Peprotech	450-03
NG2抗体	Millipore	AB5320
木瓜蛋白酶	Worthington	LS003126
不含 Ca2+ 的 PBS+ 和 Mg²⁺+	Sigma	D5652
PDGF	Peprotech	100-13A
培养皿	Falcon	351029
聚-D-赖氨酸	Sigma	P6407
Primocin	Invivogen	抗pm-2
孕酮	Sigma	P8783
腐胺	Sigma	P5780
选择柱-LS柱	Miltenyi Biotec	130-042-401
亚硒酸钠	Sigma	S5261
微量元素 B	康宁	25-000-CI
三碘甲腺原氨酸（T3）	Sigma	T6397
Triton-X	Sigma	T8787
台盼蓝溶液	康宁	25-900-CI
Tween 20	Sigma	P1379
B27NBMA			487.75 mL Neurobasal 培养基 A；10 mL B27 添加剂；1 mL Primocin；1.25 mL Glutamax；过滤除菌后于 4 ℃ 保存 °C，直至使用。
B27NBMA + 10% BGS			27 mL B27NBMA；3 mL 牛生长血清
CNTF 溶液储备液（10 µg/ml；1000倍			从 Peprotech（货号 450-50）订购。根据生产商说明配制为 0.1 至 1 mg/ml’按照缓冲液中的说明（可能因批次而异）进行操作（例如 DPBS + 0.2% BSA）。储存于 -80 °C. 工作液（10 µg/ml，1000 倍浓缩 1. 配制0.2% BSA（Fisher scientific BP-1600-100）的DPBS溶液，并经滤膜除菌。 2. 将母液分装物稀释至 10µg/ml，置于无菌、预冷的 0.2% BSA/DPBS 中。 3. 分装（20µl/管），并在液氮中速冻。 4. 将分装样品于 -80 ℃ 保存 °C.
d-生物素储备液（50 µg/ml；5000倍			将d-生物素（Sigma-B4639）溶于双蒸水，配制成50 µg/ml（例如，2.5 mg 溶于 50 ml ddH2O 中）。重悬可能需要较长时间的振荡或涡旋，或在 37℃ 短暂温和加热。°C. 如果d-生物素仍然无法溶解，配制较低浓度的溶液（例如10µg/ml），并增加B27NBMA的添加体积（1/1000而非1/5000）。4 ℃保存°C.
DNase I 储存液			1. 将脱氧核糖核酸酶 I 以 12,500 U/ml 的浓度溶解于预冷的 HBSS 中。 2. 在冰上进行过滤除菌 3. 分装至200 µl 并在 -20℃ 过夜冷冻°C. 4. 将分装样品储存在 -20 至 -30°C.
杜尔贝科’磷酸盐缓冲液（不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺）			将一袋粉末溶于 1 升水中，配制成每升培养基含 9.6 克粉末的 1 升培养基。2-8 ℃ 保存。 °C.
Forskolin 储存液（4.2 mg/ml；1000×）			向含有50 mg福斯科林（Forskolin）的瓶子（Sigma-F6886）中加入1 ml无菌DMSO，用移液器吹打至重悬。转移至15 ml离心管中，再加入11 ml无菌DMSO，使其终浓度为4.2 mg/ml。分装（例如20 µl）并在 -20 保存°C.
Hank’s 平衡盐溶液 (HBSS) (Sigma			1. 量取 900 ml 水（温度 15–20 °C），加入搅拌子后置于磁力搅拌器上。缓慢加入 9 g 氯化钠、3 g 氯化钾、1.2 g 磷酸二氢钠和 4.8 g 磷酸氢二钠，持续搅拌直至完全溶解。用 1 M 盐酸调节 pH 至 7.4，定容至 1 L。将溶液分装至 500 ml 瓶中，15 psi 高压灭菌 20 分钟。室温保存。 °C）在量筒中轻轻搅拌。 2. 加入电源并搅拌至溶解。 3. 用少量水冲洗原包装，以去除粉末的所有残留。 4. 向第2步中的溶液中添加。 5. 每升终体积加入0.35克碳酸氢钠（7.5% w/v）。 6. 持续搅拌直至溶解。 7. 在搅拌过程中将缓冲液的pH值调节至比pH=7.4低0.1–0.3个单位，因为过滤过程中pH可能会上升。建议使用1N HCl或1N NaOH调节pH。 8. 加入蒸馏水至终体积为1 L。 9. 使用孔径为0.22微米的滤膜过滤除菌。 10. 储存于 2-8 °C.
胰岛素储备液（4000 µg/ml			解冻瓶子并分装 25 µ每微离心管1升，于-20℃保存°C.
层粘连蛋白溶液			在低温（2℃）下缓慢解冻层粘连蛋白°C至8°C）以避免凝胶形成。然后分装至聚丙烯管中。于5℃保存° C 至 -20° C，分装保存（例如 20 µl）且避免反复冻融。层粘连蛋白在此温度下可保存长达六个月。
磁性细胞分选（MCS）缓冲液			配制含有磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2）、0.5% 牛血清白蛋白（BSA）、0.5 mM EDTA 的溶液，5µg/ml 胰岛素，1 g/L 葡萄糖。将缓冲液通过 0.22 微孔滤膜过滤，以除菌并去除溶解气体 µm Millex 滤器。将缓冲液于 4°C，直至使用
N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）储备液（5 mg/ml；1000倍）			将 N-乙酰-L-半胱氨酸（Sigma-A8199）以 5 mg/ml 的浓度溶解于 DMEM 中（例如，50 mg NAC 溶于 10 ml B27NBMA）。过滤除菌后分装（例如，20） µl). 储存于 -20°C.
NT3 储存液（1 µ微克/毫升；1000倍			母液 购自 Peprotech（货号 450-03）。根据制造商说明配制成 0.1 至 1 mg/ml’s 说明（可能因批次而异），置于缓冲液（如 DPBS + 0.2% BSA）中。于 -80 保存°C. 工作液（1µ微克/毫升；1000倍 1. 配制0.2% BSA的DPBS溶液，并经滤膜除菌。 2. 将母液分装物稀释至1 µg/ml，置于无菌、预冷的0.2% BSA/DPBS中 3. 分装（例如 20µl/管）并在液氮中速冻。 4. 将分装样品储存在 -80°C.
PDGF 储存液（10 µg/ml；1000倍			母液： 从 Peprotech 购买（货号：100-13A）。根据生产商说明配制成 0.1 至 1 mg/ml’s 说明（不同批次可能有所差异）加入缓冲液（如 DPBS）+ 0.2% BSA 中。储存于 -80°C. 工作液（1µg/ml；1000倍 1. 配制0.2% BSA的DPBS溶液，并过滤除菌。 2. 将母液分装物稀释至1µg/ml，置于无菌、预冷的0.2% BSA/DPBS中 3. 分装（例如 20µl/管）并在液氮中速冻。 4. 将分装样品于 -80 保存°C.
聚-D-赖氨酸（1 mg/ml；100倍）			将聚-D-赖氨酸（poly-D-lysine，分子量70–150 kD，Sigma P6407）以0.5 mg/ml的浓度溶于0.15 M、pH 8.4的硼酸溶液中（例如，50 mg溶于50 ml硼酸缓冲液）。过滤除菌后分装（例如，100 μl/管）µl/管。于 -20℃ 保存°C. 使用前，将100倍储存液（1 mg/ml）稀释至50倍 µg/ml，溶于无菌水。
少突胶质细胞增殖培养基			见 补充表 1
少突胶质细胞分化培养基			见 补充表 1
Sato 补充剂（100X）			见 补充表 1
参考文献：试剂与配方列表采用自 Emery 等人 2013 年 previously 描述的实验方案（Emery, B. & Dugas, J. C. 通过免疫贴壁法纯化小鼠大脑皮层少突胶质细胞系细胞。Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868, doi:10.1101/pdb.prot073973, (2013)) 以及 Dincman 等人 (Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S. & Whittemore, S. R. 皮质小鼠少突胶质前体细胞的分离。J Neurosci Methods. 209 (1), 219-226, doi:10.1016/j.jneumeth.2012.06.017, (2012)