本文介绍了一种实验方案，旨在通过对少量细胞进行染色质免疫沉淀（ChIP）、文库构建、高通量测序及生物信息学数据分析，研究少突胶质细胞转录因子2（Olig2）在急性分离的脑少突胶质细胞前体细胞（OPCs）中的全基因组结合情况。
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摘要
摘要
在哺乳动物细胞中，基因转录通过转录因子与基因组DNA的相互作用，以细胞类型特异性的方式进行调控。谱系特异性转录因子被认为在发育过程中的细胞命运决定和分化中发挥关键作用。染色质免疫沉淀联合高通量DNA测序（ChIP-seq）被广泛用于分析转录因子（或其相关复合物）在基因组DNA上的全基因组结合位点。然而，一次标准的ChIP反应需要大量细胞，这使得研究数量有限的分离原代细胞或稀有细胞群体变得困难。为了理解少突胶质细胞谱系特异性转录因子Olig2在急性纯化的小鼠少突胶质前体细胞（OPC）中的调控机制，本文展示了一种利用ChIP-seq鉴定Olig2（或Olig2复合物）全基因组结合位点的详细方法。首先，该方案说明了如何从小鼠脑组织中纯化血小板源性生长因子受体α（PDGFRα）阳性的OPC。接着，进行Olig2抗体介导的染色质免疫沉淀及文库构建。最后部分描述了用于Olig2 ChIP-seq分析的生物信息学软件和分析流程。总之，本文报道了一种在急性纯化的小鼠脑OPC中分析转录因子Olig2全基因组结合位点的方法。
引言
研究蛋白质（或蛋白质复合物）与DNA的结合以及表观遗传标记，对于构建参与各种生物过程的转录调控网络至关重要。特别是转录因子与基因组DNA的结合，在基因调控、细胞分化和组织发育中可发挥重要作用。染色质免疫沉淀（ChIP）是研究转录调控和表观遗传机制的一种强大工具。由于下一代测序技术的快速发展，染色质免疫沉淀联合高通量DNA测序（ChIP-seq）已被广泛用于分析蛋白质-DNA结合及表观遗传标记1。然而，标准的ChIP-seq实验每反应通常需要约2000万个细胞，因此在细胞数量有限的情况下（如分离的原代细胞和稀有细胞群体），该技术的应用受到限制。
少突胶质细胞谱系细胞，包括少突胶质前体细胞（OPCs）和少突胶质细胞，广泛分布于整个大脑，对大脑的发育和功能至关重要。作为一类前体细胞，OPCs 具有自我更新和分化的能力。OPCs 不仅是少突胶质细胞的前体细胞，还通过与其他类型的脑细胞相互作用，在神经元信号传导过程中发挥重要作用2。先前的研究表明，少突胶质细胞的发育受到谱系特异性转录因子（如 Olig2 和 Sox10）的调控3,4。这些转录因子可结合到某些关键基因的启动子或增强子区域，从而影响其在少突胶质细胞特化和分化过程中的表达。然而，在细胞数量极为有限的急性分离原代 OPCs 中，鉴定目标蛋白（或蛋白复合物）的 DNA 结合情况仍具有挑战性。
本方案描述了如何利用ChIP-seq技术，在全基因组范围内系统性地分析经Olig2免疫沉淀的小鼠纯化少突胶质前体细胞（OPC）中的基因组DNA。从小鼠脑组织中急性分离纯化的OPCs通过免疫筛选法获得，并直接用于ChIP实验，无需进行增殖培养。 体外通过免疫盘选获得的少突胶质前体细胞（OPCs）数量有限，不足以满足标准的ChIP-seq实验需求。本文描述了一种适用于转录因子的低细胞数ChIP-seq方案，每个ChIP反应仅需低至20,000个细胞。简而言之，交联后的细胞经裂解，并使用超声破碎仪对染色质进行超声剪切。剪切后的染色质与Olig2抗体及蛋白A包被的磁珠共同孵育，以沉淀与Olig2抗体结合的基因组DNA。随后将沉淀物从蛋白A包被的磁珠上洗脱并进行逆转交联，再通过酚-氯仿抽提法纯化由Olig2抗体富集的基因组DNA。对所得产物进行定量后，依次进行T尾添加、引物退火、模板转换与延伸、接头连接与扩增、文库片段大小选择及纯化等步骤，完成ChIP-seq文库构建。
测序完成后，分析了使用Olig2转录因子抗体制备的样品及对照样品的原始读段质量。去除低质量的碱基对以及含有接头序列的读段片段。随后，将过滤后的读段比对至小鼠参考基因组。与对照样品相比，染色质免疫沉淀（ChIP）读段显著富集的基因组区域被识别为峰。代表潜在转录因子结合位点的显著峰经筛选后在基因组浏览器中进行可视化展示。
值得注意的是，本方案中描述的方法可广泛用于其他转录因子的ChIP-seq实验，适用于任何数量有限的细胞类型。
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方案
所有动物使用和实验方案均遵循《实验动物护理和使用指南》的规定，并经休斯顿德克萨斯大学健康科学中心机构生物安全委员会和动物福利委员会批准。
1. 从小鼠脑中纯化 PDGFRα 阳性少突胶质细胞系细胞（改良自先前描述的免疫平皿分离法5,6,7）
- 用于PDGFRα阳性细胞筛选的免疫平皿制备，以及用于去除内皮细胞和小胶质细胞的两个平皿的制备。
注意：请注意，免疫平皿实验需使用培养皿（Petri dishes），而非细胞培养皿；如果纯化的细胞将用于后续培养，则免疫平皿操作必须在生物安全柜中进行- 在4 °C条件下，将30 µL山羊抗大鼠IgG溶于10 mL pH 9.5、50 mM Tris-HCl缓冲液中，过夜包被一个10 cm培养皿。轻轻振荡培养皿，确保包被液均匀且完全覆盖皿表面。
- 将40 µL大鼠抗PDGFRα抗体加入含0.2% BSA的12 mL杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中，配制PDGFRα抗体溶液。
- 用10 mL 1× DPBS对IgG包被的培养皿洗涤3次后，在室温下用PDGFRα抗体溶液孵育4小时。
- 用10 mL 1× DPBS对大鼠抗PDGFRα抗体包被的培养皿洗涤3次。沿培养皿侧壁轻柔加入DPBS溶液，避免扰动包被表面。
- 用含2.3 µg/mL Banderiaea simplicifolia 凝集素1（BSL-1）的20 mL DPBS，对两个新的15 cm培养皿进行2小时包被，用于去除内皮细胞和小胶质细胞。
- 用20 mL 1× DPBS对BSL-1包被的培养皿洗涤3次。沿培养皿侧壁轻柔加入DPBS溶液，避免扰动包被表面。
- PDGFRα阳性少突胶质细胞系细胞的纯化方法基于先前发表的方法6,7,8进行改进。
- 根据先前发表的方案5,6，分离2只出生后第7天（P7）小鼠的大脑皮质组织。
- 使用神经组织解离试剂盒（P）按照制造商详细说明将组织解离，制备单细胞悬液。
- 简要步骤：用解剖刀将分离的皮质组织切成小块，并在37 °C下进行酶消化。消化完成后，使用火焰抛光的玻璃巴斯德移液管手动将组织块解离成单细胞悬液。
- 将单细胞悬液在室温下以300 × g离心10分钟，弃上清，用15 mL免疫平皿缓冲液重悬细胞沉淀（免疫平皿缓冲液为含0.02% BSA和5 µg/mL胰岛素的DPBS）。
- 将来自2只小鼠脑组织的单细胞悬液依次在两个BSL-1包被的培养皿上孵育15分钟（室温），每5分钟轻柔振荡一次培养皿，以更有效地去除小胶质细胞和内皮细胞。
- 轻柔旋转培养皿，收集未贴壁的细胞悬液，并将其转移至大鼠抗PDGFRα抗体包被的培养皿中，在室温下孵育45分钟。
- 细胞悬液在大鼠抗PDGFRα抗体包被的培养皿上孵育后，轻柔旋转培养皿收集细胞悬液，并用DPBS冲洗培养皿8次，以彻底去除未贴壁细胞。沿培养皿侧壁轻柔加入洗涤液，并多次振荡培养皿以确保未贴壁细胞被完全清除。
- 使用4 mL细胞解离液在37 °C处理10分钟，使贴壁细胞从大鼠抗PDGFRα抗体包被的培养皿上脱落。轻轻摇动培养皿以促进细胞脱离。
- 在室温下以300 × g离心收集纯化的少突前体细胞（OPCs），用2 mL OPC细胞培养基重悬细胞沉淀，并使用台盼蓝染色和血细胞计数板进行细胞计数（500 mL OPC培养基为DMEM/F12培养基，含5 mL青霉素-链霉素溶液（P/S）、5 mL N2、10 mL B27、5 µg/mL胰岛素、0.1% BSA、20 ng/mL bFGF和10 ng/mL PDGFRα）。
- 免疫平皿后OPCs纯度的验证。
- 为评估免疫平皿后OPCs的富集效果，取部分纯化的OPCs，根据制造商说明，采用硫氰酸胍法提取RNA。
- 使用荧光绿色染料预混液进行qRT-PCR，检测纯化OPCs中PDGFRα表达水平的富集情况，并与解离的全脑细胞进行比较，参照先前发表的材料4。
- 此外，将部分纯化的OPCs接种至多聚-D-赖氨酸包被的24孔板中，按照先前发表的方法9，使用抗NG2硫酸软骨素蛋白聚糖（NG2）抗体进行免疫染色。
2. 适用于高通量测序的低细胞量ChIP制备及ChIP文库构建
- 使用市售的超声破碎系统和市售的低细胞数ChIP试剂盒（参见材料表），按照制造商提供的详细标准操作流程进行Olig2低细胞数ChIP样品制备。
- 将纯化的少突胶质前体细胞（OPCs）从包被了大鼠抗PDGFRα抗体的培养板上解离，并用台盼蓝染色结合血细胞计数板进行细胞计数后，将20,000个纯化的OPCs置于1 mL OPC细胞培养基中，用于每轮ChIP反应。
- 向细胞悬液中加入27 µL 36.5%甲醛，在室温下固定10分钟。
注意：出于安全考虑，甲醛必须在化学通风橱中使用。 - 加入50 µL 2.5 M甘氨酸，在室温下孵育5分钟以终止DNA-蛋白质交联。
注：自此步骤起，所有操作均需在冰上或4 °C冷室中进行。 - 用含蛋白酶抑制剂混合物的1 mL冰浴Hanks平衡盐溶液（HBSS）洗涤交联后的细胞沉淀，并在4 °C条件下以300 × g离心收集细胞沉淀。
- 在冰上用25 µL完整裂解缓冲液裂解细胞沉淀，持续5分钟。
注：轻轻振荡管子，使细胞充分悬浮于裂解缓冲液中。 - 向细胞裂解物中加入75 µL含蛋白酶抑制剂混合物的冰浴HBSS，并使用预冷的超声破碎系统对染色质进行剪切，程序设置为5个循环，每个循环30秒开启、30秒关闭。每次超声处理需同时进行6个样品管，并确保平衡管中加入100 µL水以保持离心平衡。
- 剪切完成后，在4 °C条件下以14,000 × g离心10分钟，离心后将上清液转移至新管中。
- 取100 µL剪切后的染色质，加入等体积含蛋白酶抑制剂的冰浴完整ChIP缓冲液进行稀释。
- 保留20 µL稀释后的剪切染色质作为Input对照样品。
注：Input对照样品需与Olig2免疫沉淀样品进行比较，以确认Olig2抗体所富集的DNA片段。 - 向180 µL稀释后的剪切染色质中加入1 µL兔抗Olig2抗体，在4 °C条件下以40 rpm转速于旋转摇床上孵育16小时。
注：此步骤应在冷室中进行。 - 对于每轮ChIP反应，用55 µL磁珠洗涤缓冲液洗涤11 µL蛋白A包被的磁珠两次，洗涤后将磁珠沉淀重悬于11 µL磁珠洗涤缓冲液中。
注：此步骤应在冷室中进行。 - 对于每轮ChIP反应，向ChIP反应管中加入10 µL预洗过的蛋白A包被磁珠。此步骤应在冷室中进行。
- 将ChIP反应管置于4 °C旋转摇床上继续孵育2小时。
- 将ChIP反应管置于磁力架上静置1分钟。
注：此步骤应在冷室中进行。 - 小心移除上清液，避免扰动磁珠沉淀。
- 在4 °C条件下，将磁珠沉淀依次用四种洗涤缓冲液各100 µL，在旋转摇床上分别洗涤4分钟。
- 洗涤完成后，向磁珠沉淀中加入200 µL洗脱缓冲液，并在65 °C条件下孵育4小时以逆转蛋白质-DNA交联。
- 同时，向20 µL Input对照样品中加入180 µL洗脱缓冲液，同样在65 °C条件下孵育4小时以逆转蛋白质-DNA交联。
- 向每个ChIP反应管中加入200 µL苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1, v/v）混合液。
- 剧烈涡旋1分钟，室温下以13,000 × g离心15分钟，将上层水相转移至新管中。
- 向每个ChIP反应管中加入40 µL 3 M乙酸钠溶液、1,000 µL 100%乙醇以及2 µL共价连接蓝色染料的糖原沉淀剂，在-20 °C条件下过夜沉淀。
- 在4 °C条件下以13,000 × g离心20分钟。
- 弃去上清液，用500 µL冷的70%乙醇洗涤一次，再在4 °C条件下以13,000 × g离心20分钟。
- 弃去上清液，将沉淀在空气中干燥10分钟，然后用50 µL水溶解沉淀。
- 用于高通量测序的ChIP文库构建
- 根据制造商说明书，使用纯化试剂盒对ChIP DNA进行纯化和浓缩。
- 根据制造商说明书，使用PicoGreen法对ChIP样品进行定量。
- 根据制造商说明书，使用ChIP-seq试剂盒进行T尾添加、复制与尾部延伸、模板转换与延伸、接头连接与扩增、文库片段大小选择及纯化。
- 将双链DNA变性后，利用虾碱性磷酸酶去除单链DNA的3'末端磷酸基团，并通过末端脱氧核苷酸转移酶在单链DNA上添加poly(T)尾。
- 将DNA Poly(dA)引物与单链DNA模板退火，以实现DNA复制和模板转换。
- 模板转换完成后，使用正向和反向引物通过PCR扩增ChIP-seq文库以进行样本索引。
- 采用磁性微珠（选项2双选策略）对PCR扩增后的ChIP-seq文库进行筛选，选择片段大小在250至500 bp之间的产物。
- 使用微流控芯片毛细管电泳装置检测所选ChIP-seq文库的质量。
3. 数据分析
- 准备目录结构。
- 创建一个用于进行ChIP-seq数据分析的目录。在新创建的目录中，建立六个子目录，名称分别为：raw.files、fastqc.output、bowtie.output、homer.output、macs2.output、motif.analysis 和 reports。
- 准备数据并对原始测序数据进行质量控制分析。
- 移动到 "原始文件" 目录并下载 ChIP-seq 数据文件。
- 验证文件名。如果测序为双端测序，则会有 4 个文件（两个处理组文件和两个输入组文件），其基础名称相似：PDGFRα_Olig2.read1.fastq、PDGFRα_Olig2.read2.fastq、PDGFRα_input.read1.fastq 和 PDGFRα_input.read2.fastq。如果文件名不同，请使用以下方式重命名它们 "毫伏" 命令
- 移动到 "fastqc.output" 目录
- 使用 FASTQ 文件质量控制软件从原始测序读段中获取质量控制指标10. 使用命令在 图 S1A 对每个fastq文件分别运行质量控制流程。该软件将在一个html文件中显示多个质量控制指标。
- 打开 HTML 质控文件，检查读段数量、读段长度、每碱基序列质量、每序列质量得分、序列 GC 含量、序列重复水平、接头污染以及 kmer 含量。
- 去除末端低质量读段和接头序列。
- 观察 "碱基序列质量" 和 "适配器内容" 图。确定每条读段头部和尾部的修剪长度。适当的修剪长度应满足以下条件：碱基质量低于30，并且存在接头序列的证据。
- 移动到 "原始文件" 目录
- 下载并安装用于修剪测序读段的软件11. 使用该命令在 图 S1B 分别对处理组和输入组进行修剪。参数 'CROP' 表示从末端修剪后剩余的读段长度，'HEADCROP' 指定从读段起始端去除的碱基数。
- 修剪命令还包含参数“MINLEN”，用于设定过滤后可接受的最小读长。如果读长至少为 50 bp，则将 35 bp 作为读长阈值。
- 移动到 "fastqc.output" 目录
- 在对测序读段进行修剪后，执行 fastq 文件的质量控制分析，验证质量控制问题是否已得到解决。使用以下命令： 图 S1C 以获取质量控制指标。
- 将单端或成对末端的 ChIP-seq 读段比对至小鼠参考基因组。
- 转移到 "bowtie.output" 用于映射的目录
- 下载GENCODE mm10小鼠参考基因组。将mm10小鼠参考基因组重命名为 "mm10.fa".
- 下载一个读段比对工具12 并将其安装到系统中。
- 使用以下命令为下载的参考基因组创建索引文件 图 S2A自动生成六个文件：mm10.1.bt2、mm10.2.bt2、mm10.3.bt2、mm10.4.bt2、mm10.rev.1.bt2 和 mm10.rev.2.bt2。
- 使用该命令在 图 S2B 执行比对并调整参数 "- p" 根据您的系统设置调整处理核心数量。如果运行双端模式，参数 "-1" 和 "-2" 标明经修剪的 FASTQ 文件的名称。
注意：处理样本和输入样本的比对需分别进行，且每个样本都会生成相应的输出度量日志文件。 - 下载用于处理 SAM 格式文件的软件13 并将其安装到系统中。使用以下命令将比对后的SAM文件转换为BAM文件： 图 S2C.
- 在进行峰识别之前，获取双端测序的处理组和对照组样本比对后读段的质量控制指标。
- 需要关注的最重要质量控制指标之一是测序深度。打开文件 "log.bowtie.PDGFRα_Olig2.txt" 和 "log.bowtie.PDGFRα_input.txt " 在 bowtie.output 目录中，确认每个样本中唯一比对的读段对数目超过 1000 万。
- 移动到 "homer.output" 目录
- 下载用于基序发现和下一代测序分析的软件14 并将其安装到系统中。
- 创建一个名为 "tagDir".
- 为验证标签克隆性，使用图中所示命令 图 S3A。该 "makeTagDirectory" 该命令将生成四个质量控制输出文件：tagAutocorrelation.txt、tagCountDistribution.txt、tagInfo.txt 和 tagLengthDistribution.txt。
- 移动到 "标签目录" 目录
- 复制 "tagCountDistribution.txt" 文件输入到 "报告" 目录
- 转移到 "报告" 目录
- 使用电子表格程序打开 tagCountDistribution.txt 文件，并创建每个基因组位置上标签数量的柱状图。将直方图文件保存为以下名称 "标签.克隆性.xlsx".
- 安装 R 编程语言15 在系统中。
- 在终端中输入“R”并按回车键，以进入 R 编程环境。
- 下载用于处理 ChIP-seq 数据的 R 软件包16 并使用图中所示命令进行安装 图 S3B.
- 使用 R 脚本 图 S3C 绘制链间交叉相关性图。
- 使用峰映射器检测峰
- 移动到 "macs2.输出" 目录。下载并安装峰图映射工具17 在您的系统中。
- 使用该功能 "callpeak" 使用步骤 3.4.6 中生成的处理组和对照组 BAM 文件。
注意：其他参数包括 "- f" 输入文件格式 "- g" 基因组大小 "姓名" 用于指定所有输出文件的基名称，以及 "- B" 用于以 bedgraph 格式存储片段堆积数据。完整的峰呼叫命令包含在 图 S4A对于成对末端样本，使用 BEDPE 格式。 - 验证峰映射器是否生成了以下六个文件：PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls、PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.narrowPeak、PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_summits.bed、PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_model.r、PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_control_lambda.bdg 和 PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_treat_pileup.bdg。
- 打开文件 PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls，查看识别出的峰、位置、长度、峰顶位置、pileup 值以及峰富集度指标：-log10(p值)、富集倍数和 -log10(q值)。
- 过滤并注释已识别的峰。
- 使用上一步中打开的文件，根据富集倍数、p 值和/或 q 值对获得的峰进行筛选。为确定合适的过滤阈值，绘制直方图以分析各指标的密度分布。过滤掉低于选定阈值的值，以获得显著性峰。
- 下载 mm10 黑名单（已知存在人工假象高信号的区域），并过滤掉位于这些假象区域内的 ChIP-seq 峰。
- 创建一个包含以下列的过滤后峰区域的 bed 文件：染色体、起始位置、终止位置、峰区域 ID、mock 和链方向。将 mock 列填充为一个点 "." 因为未被使用。在链列中，将所有值设置为 "+". 将 bed 文件保存为 "filtered.peakData2.bed".
- 复制 "filtered.peakData2.bed" 文件中的 "报告" 目录
- 移动到 "报告" 目录
- 为了将过滤后的峰注释到特定基因区域，请使用该功能 "annotatePeaks" 使用上一步创建的 bed 文件。所用命令如下所示： 图 S5A.
- 打开 "filtered.annotatedPeaks.txt" 使用统计软件对文件进行处理。
- 过滤位于基因间区且距离已注释的转录起始位点（TSS）超过 5 kb 的峰值区域。使用 "转录起始位点的距离" 将文件中的列作为过滤距离。将过滤后的峰存储在名为的 Excel 文件中 "5kbup.geneBody.peakData.txt".
- 将过滤后的峰结果存储为 bedGraph 文件，文件包含以下列：染色体、起始位置、终止位置和 -log10(q 值)。将文件命名为 "5kbup.geneBody.peakData.bedGraph".
- 生成用于浏览器可视化的 bigwig 文件。
- 下载并安装基因组计算软件18.
- 下载一个用于将 bedgraph 转换为 bigwig 的工具并安装到系统中。下载 'mm10.chrom.sizes' 文件。
- 使用该命令在 图 S6A 生成一个 bigwig 文件。
- 下载并安装基因组浏览器19 在系统中。
- 打开基因组浏览器并加载文件 "5kbup.geneBody.peakData.bigwig" 用于可视化经过筛选的显著峰及其相对于已知基因的位置。
- 基序搜索
- 移动到 "基序分析" 目录
- 下载 a 从头合成 基序扫描与基序富集程序并将其安装到您的系统中20.
- 下载包含 Olig2 基序的全面基序数据库。
- 获取位于显著峰顶点中心的 500 bp 区域的基因组序列，将序列保存为 peak.sequences.txt。使用以下命令： 图 S7 在每个500 bp峰区中搜索Olig2基序。
- 使用适当的E值（默认值 = 0.05）对获得的模体进行筛选。
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结果
对急性分离的脑少突胶质前体细胞（OPCs）中转录因子Olig2与基因组DNA的潜在相互作用，进行了低细胞量染色质免疫沉淀测序（Low-cell ChIP-seq）及生物信息学分析。图1展示了实验流程与数据分析流程的总体示意图。在本方案中，取出生后小鼠脑组织，将其解离为单细胞悬液。组织解离后，使用PDGFRα抗体通过免疫平皿法（immunopanning）纯化OPCs。图2显示，经RT-qPCR评估，纯化的OPCs中PDGFRα显著富集，而神经元标志物Tuj1（神经元特异性III类β-微管蛋白）、星形胶质细胞标志物GFAP（胶质纤维酸性蛋白）、小胶质细胞标志物Iba1（离子化钙结合接头分子1）、成熟髓鞘化少突胶质细胞标志物Mbp（髓鞘碱性蛋白）和Mog（髓鞘少突胶质细胞糖蛋白）表达极少。此外，免疫染色结果表明，绝大多数细胞呈NG2阳性，如图2所示。随后，每反应使用2万个纯化的OPCs，以甲醛固定细...
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讨论
哺乳动物的基因调控网络非常复杂。染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）是一种研究全基因组范围内蛋白质-DNA相互作用的强大方法。本实验方案介绍了如何利用从小鼠脑组织中纯化的少突胶质前体细胞（OPC）进行Olig2 ChIP-seq，每反应所需细胞数量可低至两万个。该方案的第一步关键在于通过使用PDGFRα抗体进行免疫贴壁法从小鼠脑组织中纯化OPC。在使用包被PDGFRα的培养板进行OPC阳性筛选时，OPC通常与包被板的结合较弱。即使经过多次洗涤，仍可能残留部分非贴壁细胞。因此，每次使用D-PBS洗涤后，必须在显微镜下检查非贴壁细胞的情况。如果继续增加D-PBS洗涤次数并不能进一步减少非贴壁细胞的数量，则应立即收集已结合的细胞，因为过度洗涤可能导致已贴附的OPC脱落，从而降低纯化细胞的得率。然而，洗涤不足则可能导致其他脑细胞类型的污染。因此，每次分离后，必须通过免疫染色检测OPC标志物NG2，并结合qPCR检测已知细胞类型特异性基因的表达情况（如神经元标志基因Tuj1、星形胶质细胞标志基因GFAP、OPC标志基因PDGFRα、小胶质细胞标志基因Iba1，以及髓鞘化成熟...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
JQW、XD、RCDD 和 YY 获得了美国国立卫生研究院（NIH）R01 NS088353 项目资助；NIH 资助项目 1R21AR071583-01；Staman Ogilvie 基金-纪念赫尔曼基金会；德克萨斯大学健康科学中心（UTHealth）脑科学计划及 CTSA UL1 TR000371 项目；以及德克萨斯大学系统神经科学与神经技术研究所资助项目（资助编号 #362469）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂/设备 | |||
| Banderiaea simplicifolia 凝集素 1 | Vector Laboratories | # L-1100 | |
| 大鼠抗 PDGFRa 抗体 | BD Bioscience | # 558774 | |
| 神经组织解离试剂盒 (P) | MACS Miltenyi Biotec | # 130-092-628 | |
| Accutase | STEMCELL technologies | # 07920 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | # 15596026 | |
| 抗 NG2 硫酸软骨素蛋白聚糖抗体 | Millipore | # AB5320 | |
| Bioruptor Pico 超声破碎仪 | Diagenode | # B01060001 | |
| True MicroChIP 试剂盒 | Diagenode | # C01010130 | |
| 苯酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1, v/v) | Thermo Fisher | # 15593031 | |
| NucleoSpin 凝胶与 PCR 纯化试剂盒 | MACHEREY-NAGEL | # 740609 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA 定量检测试剂盒 | Thermo Fisher | # P11496 | |
| DNA SMART ChIP-Seq 试剂盒 | Clontech Laboratories | # 634865 | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Voulter | # A63880 | |
| GlycoBlue | Thermo Fisher | # AM9516 | |
| pico-green | Thermo Fisher | # P11496 | |
| D-PBS | Thermo Fisher | # 14190-144 | |
| SYBR Green 预混液 | Bio-Rad Laboratories | # 1725124 | |
| DMEM/F12 | Fisher Scientific | # 11-320-033 | |
| 青霉素-链霉素 (P/S) | Fisher Scientific | # 15140122 | |
| N-2 添加剂 | Fisher Scientific | # 17502048 | |
| B-27 添加剂 | Fisher Scientific | # 17504044 | |
| 胰岛素 | Sigma | # I6634 | 通过将 5 mg 胰岛素溶解于 10 ml 水中并加入 50 μl 1 N HCl，配制 0.5 mg/ml 胰岛素溶液。 |
| 牛血清白蛋白，适用于细胞培养 (BSA) | Sigma | # A4161 | 通过将 4 g BSA 溶解于 100 ml D-PBS 中并调节 pH 至 7.4，配制 4% BSA 溶液。 |
| 碱性成纤维细胞生长因子蛋白，人重组 (bFGF) | EMD Millipore | # GF003 | |
| 人 PDGF-AA | VWR | # 102061-188 | |
| 聚-D-赖氨酸 | VWR | # IC15017510 | 通过将 10 mg 聚-D-赖氨酸溶解于 10 ml 水中，配制 1 mg/ml 溶液，使用时稀释 100 倍。 |
| Falcon 一次性培养皿，无菌，Corning，100×15 mm | VWR | # 25373-100 | |
| Falcon 一次性培养皿，无菌，Corning，150×15 mm | VWR | # 25373-187 | |
| HBSS，10×，无钙，无镁，无酚红 | Fisher Scientific | # 14185-052 | |
| 台盼蓝 | Stemcell Technologies | # 07050 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma | # 11697498001 | |
| 软件 | |||
| FastQC | [10] http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ | 获取原始及修剪后测序读段的质量控制指标 | |
| Trimmomatic 0.33 | [11] http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | 对原始读段进行修剪和过滤 | |
| GENCODE mm10 | ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/gencode/Gencode_mouse/release_M15/GRCm38.primary_assembly.genome.fa.gz | 小鼠参考基因组 | |
| Bowtie2 2.2.4 | [12] http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | 将测序读段比对至参考基因组 | |
| SAMTools 1.5 | [13] http://samtools.sourceforge.net/ | 将 SAM 文件转换为 BAM 格式 | |
| HOMER 4.9.1 | [14] http://homer.ucsd.edu/homer/ | 创建标签目录，并使用基因符号注释富集的基因组区域 | |
| R 3.2.2 | [15] https://www.R-project.org/ | 编写程序脚本并运行函数 | |
| SPP 1.13 | [16] https://github.com/hms-dbmi/spp | 生成链间交叉相关图 | |
| MACS2 2.2.4 | [17] https://github.com/taoliu/MACS | 识别相对于对照组的 ChIP 富集区域 | |
| BEDTools 2.25 | [18] http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ | 基因组算术操作 | |
| bedGraphToBigWig | http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/ | 将 bedGraph 文件转换为 bigwig 格式 | |
| IGV 浏览器 2.3.58 | [19] http://software.broadinstitute.org/software/igv/ | 显著 ChIP-seq 峰的可视化与浏览 | |
| Microsoft Excel | 电子表格程序 | ||
| ENCODE 黑名单 | https://sites.google.com/site/anshulkundaje/projects/blacklists | 峰过滤 | |
| mm10.chrom.sizes | http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/mm10.chrom.sizes. | 将 bedGraph 文件转换为 bigwig | |
| ENCODE 基序数据库 | [25] http://compbio.mit.edu/encode-motifs/ | 进行基序富集分析所需的综合基序数据库 | |
| MEME-ChIP | [20] http://meme-suite.org/index.html | 基序富集分析与基序发现 | |
| qPCR 所用引物名称 | qPCR 所用引物序列 | ||
| Mbp-F: | CTATAAATCGGCTCACAAGG | ||
| Mbp-R: | AGGCGGTTATATTAAGAAGC | ||
| Iba1-F: | ACTGCCAGCCTAAGACAACC | ||
| Iba1-R: | GCTTTTCCTCCCTGCAAATCC | ||
| Mog-F: | GGCTTCTTGGAGGAAGGGAC | ||
| Mog-R: | TGAATTGTCCTGCATAGCTGC | ||
| GAPDH-F | ATGACATCAAGAAGGTGGTG | ||
| GAPDH-R | CATACCAGGAAATGAGCTTG | ||
| Tuj1-F | TTTTCGTCTCTAGCCGCGTG | ||
| Tuj1-R | GATGACCTCCCAGAACTTGGC | ||
| PDGFRα-F | AGAGTTACACGTTTGAGCTGTC | ||
| PDGFRα-R | GTCCCTCCACGGTACTCCT |
参考文献
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