背根神经节（DRG）原代培养常用于研究感觉神经元中的生理功能或与病理相关的过程。本文中，我们展示了利用腰段DRG培养物，在使用选择性激动剂刺激神经肽FF受体2型后，检测神经递质释放的方法。
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本文内容
摘要
摘要
背根神经节（DRG）包含感觉神经元的细胞体。这类神经元为假单极神经元，具有两条轴突，分别支配皮肤、肌肉和内脏器官等外周组织以及中枢神经系统中的脊髓背角。感觉神经元负责传递包括触觉、痛觉、温度觉和本体感觉在内的躯体感觉。因此，背根神经节原代培养被广泛用于研究伤害性感受的细胞机制、感觉神经元的生理功能以及神经发育过程。培养的神经元可用于电生理学、信号转导、神经递质释放或钙成像等相关研究。通过背根神经节原代培养，科研人员可培养分离的DRG神经元，以监测单个或多个细胞内的生化变化，克服许多与 体内 实验。与市售的DRG-杂交瘤细胞系或永生化DRG神经元细胞系相比，原代细胞的组成和特性更接近于组织中的感觉神经元。然而，由于单只动物可分离获得的培养用DRG原代细胞数量有限，因此难以开展针对药物靶向研究的高通量筛选。本文描述了DRG的采集与培养步骤。此外，我们展示了使用神经肽FF受体2型（NPFFR2）激动剂处理培养的DRG细胞，以诱导肽类神经递质（降钙素基因相关肽（CRGP）和P物质（SP））的释放。
引言
感觉神经元的细胞体位于背根神经节（DRG）内。这些神经元为假单极神经元，支配外周组织和中枢神经系统。感觉神经元的外周神经末梢分布于肌肉、皮肤、内脏器官和骨骼等多种组织中。 它们将外周感觉信号传递至脊髓背角的神经末梢，随后信号通过不同的躯体感觉上行通路传至大脑1,2。躯体感觉使机体能够感受（即触觉、痛觉和温度觉）并感知运动与空间方位（本体感觉）1,3。初级传入轴突可分为四个亚类，包括对骨骼肌本体感觉起反应的I类（Aα）纤维、对皮肤机械感受器起反应的II类（Aβ）纤维，以及对疼痛和温度起反应的III类（Aδ）和V类（C）纤维。其中只有C纤维无髓鞘，其余纤维均不同程度地具有髓鞘。
伤害性感受器是初级感觉神经元，可被具有组织损伤潜能的有害刺激（机械性、热性和化学性刺激）激活。这些神经元由有髓鞘的Aδ纤维和无髓鞘的C纤维组成1,4。Aδ纤维表达神经生长因子（NGF，trkA受体）、CGRP和SP的受体。C纤维可分为肽能性和非肽能性C纤维。其中，非肽能性C纤维表达胶质细胞源性神经营养因子（GDNF，RET....
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方案
本研究中涉及实验动物的所有方法均经长庚大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准（CGU 13-014）。
1. 采集实验大鼠腰段背根神经节
- 使用2至3周龄的Sprague-Dawley（SD）大鼠进行腰段背根神经节（DRG）的采集。
注意：超过4周龄的大鼠所采集的DRG神经元在本文所述的培养条件下生长不佳。 - 将所有手术器械在高压灭菌器中灭菌。
- 使用替来他明与唑拉西泮1:1混合液（20 mg/kg，腹腔注射（IP））对大鼠进行麻醉，并等待其在脚趾夹捏试验中不再出现足部回缩反应。
注意：本实验方案中可成功使用不同的麻醉策略。 - 使用商用断头器对大鼠实施断头处死。
- 使用断头器将大鼠躯干从前肢至股骨之间部分分离。采集区域示意图见图1A。
注意：尾侧切割线应位于股骨稍前方。若脊柱切割位置过高，将导致腰段L6背根神经节被切除。 - 沿胸骨纵向剪开，并使用解剖剪去除所有器官/组织（见图2A-a）。
- 沿躯干侧面剪开以获取大鼠背部组织，并去除皮肤。解剖后背部躯干的实物图见图1B。
- ....
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结果
将大鼠腰段背根神经节（DRG）神经元接种于24孔板中进行培养，培养基中添加Ara-C以抑制胶质细胞增殖，并添加NGF以支持神经元生长。观察活体DRG细胞的形态。如图3所示，在第1天，单个神经元的胞体贴附于培养皿底部，被选中用于观察。从第1天至第3天持续监测轴突生长情况。胶质细胞发生增殖并延伸出突起，包绕感觉神经元的胞体。在另一组培养样本中，通过CGRP蛋白染色以显示神经元的形态。在图4中，CGRP蛋白染色信号出现在感觉神经元的胞浆和轴突中。经DAPI染色后，神经元与胶质细胞的核形态具有明显区别：神经元的细胞核更大且呈更圆的形态，而胶质细胞的细胞核则更倾向于椭圆形（图4B）。
使用选择性 NPFFR2 激动剂 dNPA 刺激 CGRP 和 SP 的释放。此外，通过将细胞转染 N.......
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讨论
本文中，我们展示了大鼠腰段背根神经节（DRG）的采集、酶解离及培养方法。在神经生长因子（NGF）的神经营养支持下，接种细胞后3天内即可观察到DRG神经元轴突的延伸。通过降钙素基因相关肽（CGRP）蛋白染色后，可清晰观察到延伸的轴突，该蛋白在胞体中合成并沿轴突纤维运输。同时，卫星细胞的突起也向外延伸，使得这些可分裂的胶质细胞在数天内即可围绕神经元分布。采用本方案培养的原代DRG细胞适用于研究调控感觉神经元的细胞机制。在此，我们使用NPFFR2特异性激动剂dNPA刺激培养的DRG神经元释放神经肽CGRP和P物质（SP）。NPFFR2是神经肽FF（NPFF）的特异性受体，已有报道表明其参与疼痛感知与调控通路22,23。通过使用NPFFR2 siRNA进一步验证了CGRP和SP释放的NPFFR2依赖性。
背根神经节（DRG）培养物包含感觉神经元和卫星胶质细胞。卫星胶质细胞为神经元提供代谢支持，并维持神经元功能9,
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 M. Calkins 博士在英文编辑方面的帮助。本研究由长庚纪念医院（CMRPD1F0482）、长庚大学健康老龄化研究中心（EMRPD1G0171）以及科技部（105-2320-B-182-012-MY2）提供资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 替来他明和唑拉西泮混合物（Zoletil） | Virbac | Zoletil 50 | 麻醉剂 |
| 胎牛血清 | Biological Industries | 04-001-1 | 培养基 |
| 丙酮酸钠 | Sigma | S8636 | 培养基 |
| 青霉素/链霉素 | Biological Industries | 03-033-1 | 培养基 |
| DMEM-F12 | Invitrogen | 12400024 | 培养基 |
| 多聚-L-赖氨酸 | Sigma | P9011 | 包被培养皿 |
| 胶原酶 IA | Sigma | 9001-12-1 | 酶消化 |
| 汉克平衡盐溶液 | Invitrogen | 14170-112 | 培养基 |
| 胰蛋白酶 EDTA | Biological Industries | 03-051-5 | 酶消化 |
| 巴斯德吸管 | Hilgenberg | 3150102 | 细胞吹打 |
| 阿糖胞苷（Ara-C） | Sigma | C6645 | 培养基 |
| 神经生长因子（NGF） | Millipore | NC011 | 培养基 |
| NPFFR2 siRNA | Dharmacon | L-099691-02-0005 | 转染 |
| 非靶向 siRNA | Dharmacon | L-001810-10-05 | 转染 |
| NeuroPORTER 转染试剂 | Genlantis | T400150 | 转染试剂 |
| dNPA | Genemed Synthesis | N/A | NPFFR2 激动剂 |
| CGRP ELISA | Cayman | 589001 | 酶免疫分析 |
| SP ELISA | Cayman | 583751 | 酶免疫分析 |
| CGRP 抗体 | Calbiochem | PC205L | 免疫组化 |
| DAPI | Roche | 10236276001 | 免疫组化 |
参考文献
- Bear, M. F., Connors, B. W., Paradiso, M. A. Neuroscience: exploring the brain. , 3 edn, Lippincott Williams & Wilkins. (2007).
- Hunt, S. P., Mantyh, P. W. The molecular dynamics of pain control. Nat Rev Neurosci. 2 (2), 83-91 (2001).
- Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M.
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重印与许可
