背根神经节（DRG）原代培养常用于研究感觉神经元中的生理功能或与病理相关的过程。本文中，我们展示了利用腰段DRG培养物，在使用选择性激动剂刺激神经肽FF受体2型后，检测神经递质释放的方法。
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摘要
摘要
背根神经节（DRG）包含感觉神经元的细胞体。这类神经元为假单极神经元，具有两条轴突，分别支配皮肤、肌肉和内脏器官等外周组织以及中枢神经系统中的脊髓背角。感觉神经元负责传递包括触觉、痛觉、温度觉和本体感觉在内的躯体感觉。因此，背根神经节原代培养被广泛用于研究伤害性感受的细胞机制、感觉神经元的生理功能以及神经发育过程。培养的神经元可用于电生理学、信号转导、神经递质释放或钙成像等相关研究。通过背根神经节原代培养，科研人员可培养分离的DRG神经元，以监测单个或多个细胞内的生化变化，克服许多与 体内 实验。与市售的DRG-杂交瘤细胞系或永生化DRG神经元细胞系相比，原代细胞的组成和特性更接近于组织中的感觉神经元。然而，由于单只动物可分离获得的培养用DRG原代细胞数量有限，因此难以开展针对药物靶向研究的高通量筛选。本文描述了DRG的采集与培养步骤。此外，我们展示了使用神经肽FF受体2型（NPFFR2）激动剂处理培养的DRG细胞，以诱导肽类神经递质（降钙素基因相关肽（CRGP）和P物质（SP））的释放。
引言
感觉神经元的细胞体位于背根神经节（DRG）内。这些神经元为假单极神经元，支配外周组织和中枢神经系统。感觉神经元的外周神经末梢分布于肌肉、皮肤、内脏器官和骨骼等多种组织中。 它们将外周感觉信号传递至脊髓背角的神经末梢，随后信号通过不同的躯体感觉上行通路传至大脑1,2。躯体感觉使机体能够感受（即触觉、痛觉和温度觉）并感知运动与空间方位（本体感觉）1,3。初级传入轴突可分为四个亚类，包括对骨骼肌本体感觉起反应的I类（Aα）纤维、对皮肤机械感受器起反应的II类（Aβ）纤维，以及对疼痛和温度起反应的III类（Aδ）和V类（C）纤维。其中只有C纤维无髓鞘，其余纤维均不同程度地具有髓鞘。
伤害性感受器是初级感觉神经元，可被具有组织损伤潜能的有害刺激（机械性、热性和化学性刺激）激活。这些神经元由有髓鞘的Aδ纤维和无髓鞘的C纤维组成1,4。Aδ纤维表达神经生长因子（NGF，trkA受体）、CGRP和SP的受体。C纤维可分为肽能性和非肽能性C纤维。其中，非肽能性C纤维表达胶质细胞源性神经营养因子（GDNF，RET和GFR受体）、凝集素IB4以及ATP门控离子通道亚型（P2X3）5,6,7。伤害性感受器可通过离子通道的表达加以区分，并可被神经营养因子、细胞因子、神经肽、ATP或其他化学物质激活8。在受到刺激时，感觉神经元末梢可释放包括CGRP、SP和谷氨酸在内的神经递质，传递至脊髓背角以传导伤害性感觉信号2。背根神经节（DRG）不仅包含神经元，还含有卫星胶质细胞。卫星细胞包绕感觉神经元，为其提供机械和代谢支持9,10。有趣的是，越来越多的证据表明，DRG中的卫星胶质细胞可能参与调控痛觉感知11。
已有报道指出，感觉神经元是最常被用作原代神经元细胞的类型12，并被广泛应用于电生理学、信号转导以及神经递质释放的研究。它们也常用于探索神经元发育、炎症性疼痛、神经病理性疼痛、皮肤感觉（如瘙痒）和轴突生长等细胞机制12,13,14,15。背根神经节（DRG）原代培养可采用解离神经元的方式，以评估单个或多个细胞内的生化变化，使科学家能够开展在实验动物体内无法实施的研究。最近，已成功从人类器官捐献者获取的组织中培养出DRG，这可能极大促进转化医学研究16。另一方面，感觉神经元也可通过DRG组织块培养的方式进行培养。DRG组织块培养可保留神经元原有的组织结构，包括施万细胞和卫星胶质细胞，特别适用于研究神经元与非神经元细胞之间的相互作用17。DRG原代培养可在2.5小时内简便完成。其细胞组成和特性高度反映来源DRG的真实情况，因此可根据实验需求选择性地采集特定部位的DRG（如腰段或胸段DRG）。胚胎期和新生期DRG神经元的培养需要神经生长因子（NGF）以维持存活并诱导轴突生长，而成年动物DRG神经元的培养则无需在培养基中添加神经营养因子12,17。此外，目前已有 commercially available DRG-杂交瘤细胞系，例如ND7/23和F11，这些细胞系无需使用实验动物。然而，由于缺乏瞬时受体电位阳离子通道亚家族V成员1（TRPV1）的表达（TRPV1是小直径感觉伤害性神经元的重要标志物），以及基因表达谱与真实神经元不一致，限制了它们的应用范围18。近年来，已从小鼠（MED17.11）20和大鼠（50B11）19中建立了永生化DRG神经元细胞系，适用于药物靶点研究中的高通量筛选。然而，这些细胞系的基因表达谱尚未全面鉴定，因此将这些永生化细胞与真实感觉神经元进行比较的验证实验仍在持续进行中。
NPFFR2 在背根神经节（DRG）中合成，并被转运至脊髓背角的感觉神经末梢21。本文提供了一种培养腰段 DRG 细胞的方案，并使用 NPFFR2 激动剂处理这些细胞，以诱导神经肽 CGRP 和 SP 的释放。为进一步验证其对 NPFFR2 的依赖性，可采用 NPFFR2 小干扰 RNA（siRNA）转染培养的 DRG 细胞进行检测。
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方案
本研究中涉及实验动物的所有方法均经长庚大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准（CGU 13-014）。
1. 采集实验大鼠腰段背根神经节
- 使用2至3周龄的Sprague-Dawley（SD）大鼠进行腰段背根神经节（DRG）的采集。
注意：超过4周龄的大鼠所采集的DRG神经元在本文所述的培养条件下生长不佳。 - 将所有手术器械在高压灭菌器中灭菌。
- 使用替来他明与唑拉西泮1:1混合液（20 mg/kg，腹腔注射（IP））对大鼠进行麻醉，并等待其在脚趾夹捏试验中不再出现足部回缩反应。
注意：本实验方案中可成功使用不同的麻醉策略。 - 使用商用断头器对大鼠实施断头处死。
- 使用断头器将大鼠躯干从前肢至股骨之间部分分离。采集区域示意图见图1A。
注意：尾侧切割线应位于股骨稍前方。若脊柱切割位置过高，将导致腰段L6背根神经节被切除。 - 沿胸骨纵向剪开，并使用解剖剪去除所有器官/组织（见图2A-a）。
- 沿躯干侧面剪开以获取大鼠背部组织，并去除皮肤。解剖后背部躯干的实物图见图1B。
- 在采集DRG前将组织置于冰上预处理。清除手套上的毛发和血液，并用75%乙醇对手套进行消毒后再进行下一步操作。
- 去除覆盖腰椎的肌肉组织。首先沿脊柱两侧（左侧和右侧）各做一纵行切口，并做一横向侧方切口以标记腰椎的头端界限。随后使用骨剪钳去除脊柱背侧肌肉（见图2A-b）。
- 使用骨剪钳去除椎骨的背侧部分，暴露脊髓。
- 使用解剖剪（见图2A-c）和镊子（见图2A-d）将脊髓移除。
- 从最后一根肋骨对应的胸椎（胸椎13）开始计数椎骨，以确定腰段背根神经节的位置。椎骨位置示意图见图1C。
- 使用显微剪将双侧腰段背根神经节（L1-L6）剪下（见图2A-f），放入含有2 mL冰浴无血清培养基的35 mm培养皿中。去除连接相邻背根神经节之间的神经纤维（如图1C所示），然后将其转移至培养皿中，以提高培养纯度。
注意：采集的背根神经节可在冰上保存于培养基中约1小时。在此期间，可对多只大鼠实施安乐死以获得更大数量的背根神经节样本。
2. 大鼠腰段DRG原代培养
注意：以下步骤应在层流罩内进行。
- 在1×DMEM-F12培养基中配制含10%胎牛血清、100 mM丙酮酸钠和1×青霉素/链霉素的培养液。
- 用200 µg/mL的多聚-L-赖氨酸对细胞培养处理过的24孔板进行包被，作用2小时后用无菌水洗涤。
- 使用前，将培养皿在37 °C CO2培养箱中用1 mL培养基预孵育至少30分钟。
- 将含有背根神经节（DRG）的35 mm培养皿转移至超净工作台，用无血清培养基通过移液重复清洗DRG三次。
注意：转移至工作台前，应先用75%乙醇清洁培养皿外表面。一个35 mm培养皿可容纳来自多只大鼠的DRG（具体数量取决于实验设计需求）。 - 用无菌镊子将来自单只或合并多只大鼠的DRG转移至新的35 mm培养皿中，该培养皿内含有2 mL I型胶原酶IA（1 mg/mL，溶于无血清培养基）（图2A-e）。
注意：胶原酶溶液应通过0.22 µm注射器滤器过滤除菌。 - 将DRG在37 °C CO2培养箱中用胶原酶溶液消化30分钟。
- 吸除胶原酶溶液，并用2 mL Hank's平衡盐溶液（HBSS）清洗DRG三次。
注意：可能会有残余纤维或组织从DRG脱落进入溶液中，可在清洗时用移液器将其去除。 - 向含有DRG的35 mm培养皿中加入2 mL预热的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液，并在37 °C CO2培养箱中继续消化30分钟。
- 用玻璃移液管将2 mL含DRG的溶液转移至15 mL离心管中。
注意：DRG可能粘附于玻璃移液管壁，因此操作需谨慎。为避免细胞损失，可将含DRG的溶液保留在玻璃移液管的锥形末端（约0.5 mL），然后缓慢但连续地转移至离心管中。 - 在4 °C条件下以290 × g离心5分钟，弃上清，加入2 mL无血清培养基重悬DRG沉淀。
- 重复步骤2.10两次，最后一次更换为预热的完全培养基。
- 使用火焰抛光的巴斯德移液管（长度230 mm，尖端内径1 mm）手动吹打DRG约60次。参见图2B中火焰抛光与未抛光巴斯德移液管尖端孔径的对比照片。
注意：火焰抛光后的巴斯德移液管内径比对照管约小10%，且锥形末端内壁更光滑。吹打过程中应避免产生气泡。 - 从CO2培养箱中取出经多聚-L-赖氨酸包被的培养皿，吸除预孵育的培养基，将解离后的细胞接种至包被好的培养皿中。
- 将一只大鼠（双侧L1-L6节段，共12个DRG）的DRG细胞接种至24孔板的四个孔中；每孔约含5 × 104个细胞。
注意：该密度适用于检测释放的降钙素基因相关肽（CGRP）或P物质（SP），也适用于免疫染色。若用于Western blot或RNA提取，应将一只大鼠（双侧L1-L6）的DRG细胞接种至6孔板的一个孔中。 - 次日更换培养基，加入10 µM阿糖胞苷（Ara-C）和100 ng/mL神经生长因子（NGF），之后每两天更换一次培养基。
注意：若已采集胸段脊柱来源的DRG，也可采用本方案进行培养。
3. 在DRG细胞中转染NPFFR2 siRNA
- 根据制造商提供的说明书进行NPFFR2 siRNA和对照siRNA的转染。
注意：如果所选转染试剂与本实验使用的试剂不同（参见材料表），则需要对说明书中的方案进行相应调整。 - 细胞接种后第3天，更换为0.5 mL预热的无血清培养基，将背根神经节（DRG）置于37 °C的CO2培养箱中孵育1 h。
- 将50 nM siRNA（溶于1 µL无RNase的水中）加入12.5 µL无血清培养基中。
- 将2.5 µL转染试剂加入10 µL无血清培养基中。
- 用移液器将步骤3.3和3.4中的溶液混合，并在室温下孵育该混合转染溶液10分钟。
- 将转染溶液加入含有背根神经节（DRG）的24孔板中，通过轻轻摇动使溶液与培养基混匀。
注意：若需对多个孔进行转染，应同时加入多个转染溶液。 - 将背根神经节（DRG）置于37 °C的CO2培养箱中继续孵育6小时。
- 向24孔板中每孔加入0.5 mL含有20%胎牛血清、100 mM丙酮酸钠和1×青霉素/链霉素的1×DMEM-F12培养基，并添加10 µM Ara-C和100 ng/mL神经生长因子（NGF）。
- 将背根神经节（DRG）置于37 °C的CO2培养箱中继续孵育66小时（在48小时时更换新鲜培养基）。
4. 从原代背根神经节细胞释放神经递质
- 细胞接种后第6天（siRNA转染72小时后），更换为200 µL无血清培养基，将细胞置于37 °C CO2培养箱中孵育30分钟。
- 加入1 µL刺激性化学物质，通过移液轻轻混匀培养基。将培养皿置于37 °C CO2培养箱中孵育指定时间。
注意：本文中，培养的细胞使用NPFFR2激动剂dNPA（D.Asn-Pro-(N-Me)Ala-Phe-Leu-Phe-Gln-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2，5 nmol）刺激1小时。 - 从培养皿中收集培养基，在4 °C条件下以5,000 x g离心5分钟，以去除悬浮杂质。
- 收集离心后的上清液，根据需要使用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释样品。使用酶联免疫分析（EIA）试剂盒检测神经递质水平。
注意：此处分析CGRP水平前将上清液按1:100稀释；分析SP水平前未对上清液进行稀释。
5. CGRP 和 SP 免疫放射分析
- 根据CGRP或SP EIA试剂盒制造商的说明书立即分析样品。
注意：具体操作步骤将根据所使用的试剂盒不同而有所差异。 - 使用试剂盒中提供的洗涤缓冲液将CGRP EIA孔板清洗5次。
- 向CGRP EIA孔中加入100 µL样品和100 µL抗CGRP乙酰胆碱酯酶（AChE）示踪剂；向SP EIA孔中加入50 µL样品、50 µL抗SP AChE示踪剂和50 µL抗SP抗血清。
- 使用试剂盒中提供的塑料封膜密封CGRP和SP检测孔。
- 在4 °C条件下孵育过夜。
- 使用CGRP或SP洗涤缓冲液清洗孔板5次，并彻底去除孔内残留液体。
- 向相应的CGRP或SP EIA孔中加入200 µL试剂盒提供的Ellman's试剂。
- 将CGRP孔在室温下孵育30分钟，SP孔在室温下孵育90分钟。两种检测均需避光操作。
- 在414 nm波长下读取酶标板数据，并根据相应的EIA仪器计算结果。
注意：操作过程中始终避免用手接触孔板底部，在加入Ellman's试剂前，使用镜头清洁纸擦去孔底的水渍。
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结果
将大鼠腰段背根神经节（DRG）神经元接种于24孔板中进行培养，培养基中添加Ara-C以抑制胶质细胞增殖，并添加NGF以支持神经元生长。观察活体DRG细胞的形态。如图3所示，在第1天，单个神经元的胞体贴附于培养皿底部，被选中用于观察。从第1天至第3天持续监测轴突生长情况。胶质细胞发生增殖并延伸出突起，包绕感觉神经元的胞体。在另一组培养样本中，通过CGRP蛋白染色以显示神经元的形态。在图4中，CGRP蛋白染色信号出现在感觉神经元的胞浆和轴突中。经DAPI染色后，神经元与胶质细胞的核形态具有明显区别：神经元的细胞核更大且呈更圆的形态，而胶质细胞的细胞核则更倾向于椭圆形（图4B）。
使用选择性 NPFFR2 激动剂 dNPA 刺激 CGRP 和 SP 的释放。此外，通过将细胞转染 N...
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讨论
本文中，我们展示了大鼠腰段背根神经节（DRG）的采集、酶解离及培养方法。在神经生长因子（NGF）的神经营养支持下，接种细胞后3天内即可观察到DRG神经元轴突的延伸。通过降钙素基因相关肽（CGRP）蛋白染色后，可清晰观察到延伸的轴突，该蛋白在胞体中合成并沿轴突纤维运输。同时，卫星细胞的突起也向外延伸，使得这些可分裂的胶质细胞在数天内即可围绕神经元分布。采用本方案培养的原代DRG细胞适用于研究调控感觉神经元的细胞机制。在此，我们使用NPFFR2特异性激动剂dNPA刺激培养的DRG神经元释放神经肽CGRP和P物质（SP）。NPFFR2是神经肽FF（NPFF）的特异性受体，已有报道表明其参与疼痛感知与调控通路22,23。通过使用NPFFR2 siRNA进一步验证了CGRP和SP释放的NPFFR2依赖性。
背根神经节（DRG）培养物包含感觉神经元和卫星胶质细胞。卫星胶质细胞为神经元提供代谢支持，并维持神经元功能9,
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 M. Calkins 博士在英文编辑方面的帮助。本研究由长庚纪念医院（CMRPD1F0482）、长庚大学健康老龄化研究中心（EMRPD1G0171）以及科技部（105-2320-B-182-012-MY2）提供资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 替来他明和唑拉西泮混合物（Zoletil） | Virbac | Zoletil 50 | 麻醉剂 |
| 胎牛血清 | Biological Industries | 04-001-1 | 培养基 |
| 丙酮酸钠 | Sigma | S8636 | 培养基 |
| 青霉素/链霉素 | Biological Industries | 03-033-1 | 培养基 |
| DMEM-F12 | Invitrogen | 12400024 | 培养基 |
| 多聚-L-赖氨酸 | Sigma | P9011 | 包被培养皿 |
| 胶原酶 IA | Sigma | 9001-12-1 | 酶消化 |
| 汉克平衡盐溶液 | Invitrogen | 14170-112 | 培养基 |
| 胰蛋白酶 EDTA | Biological Industries | 03-051-5 | 酶消化 |
| 巴斯德吸管 | Hilgenberg | 3150102 | 细胞吹打 |
| 阿糖胞苷（Ara-C） | Sigma | C6645 | 培养基 |
| 神经生长因子（NGF） | Millipore | NC011 | 培养基 |
| NPFFR2 siRNA | Dharmacon | L-099691-02-0005 | 转染 |
| 非靶向 siRNA | Dharmacon | L-001810-10-05 | 转染 |
| NeuroPORTER 转染试剂 | Genlantis | T400150 | 转染试剂 |
| dNPA | Genemed Synthesis | N/A | NPFFR2 激动剂 |
| CGRP ELISA | Cayman | 589001 | 酶免疫分析 |
| SP ELISA | Cayman | 583751 | 酶免疫分析 |
| CGRP 抗体 | Calbiochem | PC205L | 免疫组化 |
| DAPI | Roche | 10236276001 | 免疫组化 |
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