体外诱导内皮-间充质转化（EndMT）的实验方案，可用于研究参与EndMT的细胞信号通路。在此实验模型中，通过TGF-β处理MS-1内皮细胞以诱导EndMT。
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本文内容
摘要
摘要
内皮细胞的表型可塑性是心血管系统发育、心血管疾病以及多种器官纤维化相关疾病的基础。在这些病理状态下，已分化的内皮细胞获得类似间充质细胞的表型，这一过程称为内皮-间充质转化（EndMT），其特征是内皮标志物表达下调、间充质标志物表达上调以及细胞形态学改变。EndMT 可由多种信号通路诱导，包括转化生长因子（TGF）-β、Wnt 和 Notch 通路，其分子调控机制与上皮-间充质转化（EMT）相似，而 EMT 在原肠胚形成、组织纤维化和癌症转移中具有重要作用。深入理解 EndMT 的分子机制，对于开发靶向 EndMT 的诊断和治疗策略至关重要。体外高效诱导 EndMT 有助于鉴定共有的基因表达特征、发现可药物靶向的分子机制，并筛选 EndMT 的调控因子。本文介绍了一种体外诱导 EndMT 的实验方法：小鼠胰腺微血管内皮细胞系 MS-1 在长期暴露于 TGF-β 后发生 EndMT，表现为间充质标志物表达上调、形态学改变，以及多种炎症趋化因子和细胞因子的诱导表达。文中还包含了微小 RNA（miRNA）调控分析的相关方法。这些方法为研究 EndMT 的分子机制以及 miRNA 在 EndMT 中的作用提供了有效平台。
引言
内皮-间充质转化（EndMT）是指已分化的内皮细胞经历一系列分子变化，最终转变为成纤维细胞样的间充质细胞1。EndMT最初被描述为心脏发育过程中内皮细胞的一种转化现象2,3。在心脏早期发育阶段，心脏管由内层的心内膜和外层的心肌层组成，两者之间由一层称为心胶质的细胞外基质分隔。胚胎期的心内膜细胞获得内皮细胞标志物后，会转化为间充质细胞，侵入下方的心胶质，并促进心垫的形成，为房室瓣、室间隔以及半月瓣的发育奠定基础。此外，研究表明EndMT还可能是其他胚胎血管系统（包括冠状血管、腹主动脉和肺动脉）中周细胞和血管平滑肌细胞的来源之一4,5,6。同时，EndMT也参与生理性血管生成出芽过程7。
越来越多的证据表明，内皮-间质转化（EndMT）也参与多种心血管疾病及其他疾病的发生发展1,8。与EndMT相关的疾病包括血管钙化、动脉粥样硬化、肺动脉高压、海绵状血管畸形、器官纤维化....
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方案
1. 内皮间质转化的诱导
- 在标准培养条件下培养MS-1细胞，避免细胞汇合。MS-1细胞的来源见于 材料表对于MS-1细胞，使用含10%胎牛血清（FCS）、50 U/mL青霉素和50 μg/mL链霉素的α最低必需培养基（MEM-α）。
- 用1×磷酸盐缓冲液（PBS）清洗10 cm培养皿中的MS-1细胞，加入1.0 mL胰蛋白酶。于37 °C孵育5分钟。
- 使用 9 mL 培养基消化细胞，将细胞悬液收集至 15 mL 离心管中。
- 将细胞悬液在300–400 x g 室温下孵育5分钟。
- 小心吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于预热的培养基中。
- 使用台盼蓝溶液和标准血细胞计数板或自动细胞计数仪计数活细胞。
- 将MS-1细胞接种于未包被的标准培养板中，密度为0.5 × 10⁶ cells/mL3 每平方厘米细胞数2 用于长期培养。例如，接种 5.0 x 103 每孔接种细胞于6孔培养板中。使用相同的培养基，包括相同浓度的胎牛血清（FCS）。在MS-1细胞中，TGF-β在含FCS的长期培养（至少48–72小时）中可诱导内皮-间质转化（EndMT）。
- 24小时后，用TGF-β2（终浓度为1 ng/mL）刺激内皮细胞。
- 在加湿培养箱（5% CO₂）中培养细胞
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结果
TGF-β 是多种内皮细胞发生内皮-间质转化（EndMT）的强效诱导因子。在 MS-1 细胞中经 TGF-β 处理 24 小时后，F-actin 染色显示肌动蛋白应力纤维发生重排（图 1A）20。预先使用 ROCK 抑制剂 Y-27632 处理可抑制肌动蛋白重排的诱导20。MS-1 内皮细胞经 TGF-β 处理后，由典型的鹅卵石样形态转变为间充质样纺锤形形态（图 1B），并失去细胞间接触。经 TGF-β 处理 48–72 小时后，免疫细胞化学分析显示 VE-钙黏蛋白表达减少，而 α-SMA 表达增加（图 1C）。TGF-β 在处理 48–72 小时后，显著诱导 MS-1 细胞中 α-SMA 在 mRNA 和蛋白水平的表达（图 1D 和 1E
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讨论
已有报道称，活化的Ras联合TGF-β处理24小时可诱导MS-1细胞发生内皮-间充质转化（EndMT），而单独使用TGF-β在这一较短时间内则无法诱导EndMT21。与此一致，我们观察到在MS-1细胞中，经较长时间（48–72小时）TGF-β处理后可显著诱导EndMT20。在多种内皮细胞中，包括人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、人皮肤微血管内皮细胞（HCMEC）、人冠状动脉内皮细胞（HCEC）、小鼠肺内皮细胞（MLEC）、大鼠脑内皮细胞（BEC）、牛主动脉内皮细胞（BAEC）、永生化牛视网膜微血管内皮细胞（iBREC）以及绵羊主动脉瓣内皮细胞，长期（2–6天）TGF-β处理后也反复观察到EndMT的发生8,18,29,30,31
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢Zea Borok和Kohei Miyazono在手稿准备过程中提出的建议。H.I.S.和M.H.获得上原纪念基金会研究奖学金的支持，H.I.S.还获得林修一海外留学奖学金的支持。本研究工作获得了武田科学基金会资助（A.S.）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| MS-1 细胞 | 美国模式培养物集存库 | CRL-2279 | |
| MEM-alpha | 赛默飞世尔科技 | 32571036 | |
| TGF-beta2 | R&D | 302-B2-002 | |
| 4 孔 Lab-Tek II 培养皿载玻片 | 赛默飞世尔科技 | 154526 | |
| Y-27632 | 西格玛奥德里奇 | Y0503 | |
| 封闭剂 One | 那卡莱泰斯克 | 03953-95 | |
| 鬼笔环肽-四甲基罗丹明异硫氰酸盐 | 西格玛奥德里奇 | P1951 | |
| TOTO-3 碘化物 | 赛默飞世尔科技 | T3604 | |
| VE 钙黏蛋白单克隆抗体 (BV13) | 赛默飞世尔科技 | 14-1441-82 | |
| α-平滑肌肌动蛋白 Cy3 单克隆抗体 (1A4) | 西格玛奥德里奇 | C6198 | |
| Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG (H+L) | 赛默飞世尔科技 | A-11001 | |
| 盖玻片 | 赛默飞世尔科技 | 174934 | |
| 胶原蛋白溶液 | 新田明胶株式会社 | Cellmatrix I-P | |
| 胶原蛋白稀释缓冲液 | 新田明胶株式会社 | Cellmatrix I-P | |
| LNA miRNA 抑制剂 | EXIQON | miRCURY LNA microRNA Power Inhibitor（阴性对照 B 和靶向 miRNA） | |
| 合成 miRNA 双链体 | Qiagen | miScript miRNA Mimic | |
| Lipofectamine RNAiMAX | 赛默飞世尔科技 | 13778030 | |
| Lipofectamine 2000 | 赛默飞世尔科技 | 11668027 |
参考文献
- Sanchez-Duffhues, G., Garcia de Vinuesa, A., Ten Dijke, P. Endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases: Developmental signaling pathways gone awry. Developmental Dynamics. , (2017).
- Markwald, R. R., Fitzharris, T. P., Smith, W. N. Structural analysis of endocardial cytodifferentiation. Developmental Biology
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重印与许可
