转化生长因子-β信号诱导的内皮-间充质转化的分子分析

摘要

体外诱导内皮-间充质转化（EndMT）的实验方案，可用于研究参与EndMT的细胞信号通路。在此实验模型中，通过TGF-β处理MS-1内皮细胞以诱导EndMT。

摘要

内皮细胞的表型可塑性是心血管系统发育、心血管疾病以及多种器官纤维化相关疾病的基础。在这些病理状态下，已分化的内皮细胞获得类似间充质细胞的表型，这一过程称为内皮-间充质转化（EndMT），其特征是内皮标志物表达下调、间充质标志物表达上调以及细胞形态学改变。EndMT 可由多种信号通路诱导，包括转化生长因子（TGF）-β、Wnt 和 Notch 通路，其分子调控机制与上皮-间充质转化（EMT）相似，而 EMT 在原肠胚形成、组织纤维化和癌症转移中具有重要作用。深入理解 EndMT 的分子机制，对于开发靶向 EndMT 的诊断和治疗策略至关重要。体外高效诱导 EndMT 有助于鉴定共有的基因表达特征、发现可药物靶向的分子机制，并筛选 EndMT 的调控因子。本文介绍了一种体外诱导 EndMT 的实验方法：小鼠胰腺微血管内皮细胞系 MS-1 在长期暴露于 TGF-β 后发生 EndMT，表现为间充质标志物表达上调、形态学改变，以及多种炎症趋化因子和细胞因子的诱导表达。文中还包含了微小 RNA（miRNA）调控分析的相关方法。这些方法为研究 EndMT 的分子机制以及 miRNA 在 EndMT 中的作用提供了有效平台。

引言

内皮-间充质转化（EndMT）是指已分化的内皮细胞经历一系列分子变化，最终转变为成纤维细胞样的间充质细胞¹。EndMT最初被描述为心脏发育过程中内皮细胞的一种转化现象^2,3。在心脏早期发育阶段，心脏管由内层的心内膜和外层的心肌层组成，两者之间由一层称为心胶质的细胞外基质分隔。胚胎期的心内膜细胞获得内皮细胞标志物后，会转化为间充质细胞，侵入下方的心胶质，并促进心垫的形成，为房室瓣、室间隔以及半月瓣的发育奠定基础。此外，研究表明EndMT还可能是其他胚胎血管系统（包括冠状血管、腹主动脉和肺动脉）中周细胞和血管平滑肌细胞的来源之一^4,5,6。同时，EndMT也参与生理性血管生成出芽过程⁷。

越来越多的证据表明，内皮-间质转化（EndMT）也参与多种心血管疾病及其他疾病的发生发展^1,8。与EndMT相关的疾病包括血管钙化、动脉粥样硬化、肺动脉高压、海绵状血管畸形、器官纤维化、静脉移植后重塑、肾移植中的同种移植物功能障碍以及癌症^{8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18}。最近一项研究报告指出，若干分子水平的EndMT标志物可作为肾移植中移植物功能障碍诊断和预后预测的工具¹⁷。调控与EndMT相关的细胞信号通路已被证明可在动物模型中改善包括心肌纤维化和静脉移植后重塑在内的多种疾病状态^8,15。因此，深入理解EndMT的分子机制对于开发靶向EndMT的诊断和治疗策略具有重要意义。

内皮-间质转化（EndMT）的特征是细胞间连接的丧失、迁移潜能的增加、内皮特异性基因（如VE-钙黏蛋白）的表达下调，以及间充质基因（包括α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA））的表达上调。此外，EndMT与上皮-间质转化（EMT）——一种将上皮细胞转化为间充质细胞的类似过程——均与多种细胞外基质成分的产生异常相关，这可能促进组织纤维化的发生^8,19。

最近，一些 体外 内皮-间质转化（EndMT）的研究已阐明了EndMT的分子机制细节^15,20内皮-间质转化（EndMT）可由多种信号通路诱导，包括转化生长因子（TGF）-β、Wnt 和 Notch 通路。¹其中，TGF-β 在诱导 EMT 和 EndMT 过程中均发挥关键作用。在 EndMT 中，内皮细胞长期暴露于 TGF-β 会引发 EndMT，而短期暴露则似乎不足以诱导该过程。²¹我们在此描述了一种诱导内皮-间充质转化（EndMT）的简便方案，其中MILE SVEN 1（MS-1）小鼠胰腺微血管内皮细胞发生EndMT 体外 长期暴露于 TGF-β 后²⁰在此模型中，可进行多种下游分析，以研究内皮-间质转化（EndMT）的标志性特征，包括形态学变化、内皮细胞标志物的下调、间质细胞标志物和炎症基因的上调、细胞骨架重排以及胶原凝胶收缩。

microRNA（miRNA）是一类长约22个核苷酸的小分子调控RNA，可介导多种mRNA靶标的转录后抑制^22,23。通过种子序列介导的靶标识别，miRNA能够抑制数百个靶基因，调控细胞分化、增殖和运动性等多种细胞功能。在内皮-间质转化（EndMT）和上皮-间质转化（EMT）的调控中亦是如此，已有多个miRNA被报道为EMT和EndMT的调控因子^24,25。本文综述中所介绍的EndMT模型可方便地与miRNA调控方法相结合，用于检测miRNA在EndMT过程中的作用。本综述总结了我们在MS-1细胞中研究TGF-β诱导EndMT的实验流程，并比较了TGF-β在其他内皮细胞中诱导EndMT的条件。

方案

1. 内皮间质转化的诱导

1. 在标准培养条件下培养MS-1细胞，避免细胞汇合。MS-1细胞的来源见于 材料表对于MS-1细胞，使用含10%胎牛血清（FCS）、50 U/mL青霉素和50 μg/mL链霉素的α最低必需培养基（MEM-α）。
2. 用1×磷酸盐缓冲液（PBS）清洗10 cm培养皿中的MS-1细胞，加入1.0 mL胰蛋白酶。于37 °C孵育5分钟。
3. 使用 9 mL 培养基消化细胞，将细胞悬液收集至 15 mL 离心管中。
4. 将细胞悬液在300–400 x g 室温下孵育5分钟。
5. 小心吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于预热的培养基中。
6. 使用台盼蓝溶液和标准血细胞计数板或自动细胞计数仪计数活细胞。
7. 将MS-1细胞接种于未包被的标准培养板中，密度为0.5 × 10⁶ cells/mL³ 每平方厘米细胞数² 用于长期培养。例如，接种 5.0 x 10³ 每孔接种细胞于6孔培养板中。使用相同的培养基，包括相同浓度的胎牛血清（FCS）。在MS-1细胞中，TGF-β在含FCS的长期培养（至少48–72小时）中可诱导内皮-间质转化（EndMT）。
8. 24小时后，用TGF-β2（终浓度为1 ng/mL）刺激内皮细胞。
9. 在加湿培养箱（5% CO₂）中培养细胞₂，37 °C）。若需观察形态学变化，应每日监测细胞。
10. 在长期培养中，经 TGF-β 处理 48 小时后，更换为含 TGF-β2 的新鲜预热培养基。
11. 进行下游分析。通常在给予处理24小时后可观察到肌动蛋白的重组，而在使用TGF-β处理48–72小时后可观察到内皮标志物的下调和间充质标志物的上调。

2. 免疫细胞化学分析

1. 在标准培养条件下维持 MS-1 细胞。
2. 将 MS-1 细胞以每孔 1.0 × 10³ 个细胞（1.7 cm²）的密度接种至 4 孔细胞培养板中。载玻片预先用明胶包被。每孔加入 0.5–1.0 mL 培养基。
3. 24 小时后，用 TGF-β2（终浓度为 1 ng/mL）刺激内皮细胞。若需分析 ROCK 在内皮-间质转化（EndMT）中的作用，则在 TGF-β 处理前 1 小时加入 ROCK 抑制剂 Y-27632（10 μM）。若需评估 TGF-β 信号通路抑制的影响，可使用 TGF-β 受体激酶抑制剂。
4. 将细胞置于加湿培养箱中培养（5% CO₂，37 °C）。TGF-β 处理 24 小时后可在 MS-1 细胞中观察到肌动蛋白的重排。其他变化在处理 48–72 小时后变得明显。对于 72 小时的培养，在 TGF-β 处理 48 小时后更换为含 TGF-β 的新鲜培养基。
5. F-肌动蛋白染色
   1. TGF-β 处理 24 小时后，吸除培养基，用含 4% 多聚甲醛的 1× PBS 在室温下固定细胞 20 分钟，然后用 1× PBS 洗涤细胞。
   2. 在室温下用 0.2% Triton X-100 孵育 5 分钟。
   3. 用 1× PBS 洗涤细胞三次。
   4. 将来自毒伞属（Amanita phalloides）的异硫氰酸四甲基罗丹明标记鬼笔环肽（phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate）按 150 倍稀释于封闭缓冲液中，在室温下孵育 1 小时。
   5. 用 1× PBS 洗涤细胞三次。
   6. 在室温下用花青类核酸结合染料对细胞核染色 5 分钟。
   7. 洗涤载玻片，并用封片剂将盖玻片面向下封固于载玻片上。
   8. 使用共聚焦显微镜观察。检测鬼笔环肽荧光时使用 543 nm 激光和 560–615 nm 发射滤光片；检测细胞核染色时使用 633 nm 激光和波长超过 650 nm 的发射滤光片。经 TGF-β 处理后，可观察到粗大的应力纤维形成。
6. VE-钙黏蛋白和 α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）染色
   1. TGF-β 处理 72 小时后，吸除培养基，用冰冷的 50% 甲醇和 50% 丙酮（每孔 0.5–1.0 mL）在 4 °C 下固定细胞 5 分钟。
   2. 用 1× PBS 洗涤细胞三次（每孔 0.5–1.0 mL）。
   3. 根据生产商推荐浓度，将一抗溶于封闭缓冲液中，在 4 °C 避光条件下孵育过夜。使用 VE-钙黏蛋白单克隆抗体（BV13，1:100 稀释）和 Cy3 标记的 α-SMA 单克隆抗体（1A4，1:200 稀释）²⁰。
   4. 用 1× PBS 洗涤细胞三次。
   5. 根据生产商推荐浓度，将绿色荧光标记的二抗溶于封闭缓冲液中，在室温避光条件下孵育 1 小时，用于检测 VE-钙黏蛋白抗体。
   6. 用 1× PBS 洗涤细胞三次。
   7. 在室温下用花青类核酸结合染料对细胞核染色 5 分钟。
   8. 洗涤载玻片，并用封片剂将盖玻片面向下封固于载玻片上。
   9. 使用共聚焦显微镜观察。检测 α-SMA（Cy3）时使用 543 nm 激光和 560–615 nm 发射滤光片；检测 VE-钙黏蛋白时使用 488 nm 激光和 505–550 nm 发射滤光片。通常在 TGF-β 处理后，可观察到 VE-钙黏蛋白信号减少，而 α-SMA 信号增强。

3. 三维胶原凝胶收缩实验

1. 在进行胶原凝胶收缩实验前72小时，对MS-1细胞进行培养，分为添加和不添加TGF-β的两组。
2. 在冰上制备I型胶原凝胶。按8:1:1的比例混合冷的胶原溶液、10倍浓缩的MEM培养基以及含有0.05 N NaOH、2.2% NaHCO₃和200 mM HEPES（pH 7.4）的胶原稀释缓冲液。
3. 将200 μL对照组或经TGF-β处理的内皮细胞悬液（1.0 × 10⁶ 细胞/200 μL）与800 μL胶原凝胶溶液混合。对于TGF-β处理组，在细胞悬液中加入TGF-β2（1 ng/mL）。
4. 将1.0 mL上述混合液加入12孔板的每个孔中，置于37 °C培养箱中孵育30–60分钟，使其凝固。
5. 凝胶化完成后，在凝胶表面覆盖1.0 mL含10% FCS、50 U/mL青霉素和50 μg/mL链霉素的MEM-α培养基，使凝胶漂浮。对于TGF-β处理组，需在培养基中加入TGF-β2（1 ng/mL）。
   注意：对于TGF-β处理组，需在凝胶和培养基中均加入TGF-β。
6. 将漂浮的凝胶在37 °C下继续孵育48小时。
7. 使用扫描仪从培养板底部扫描凝胶图像。或者，使用数码相机在固定高度对凝胶进行拍照记录。
8. 利用ImageJ软件根据像素数量定量分析凝胶表面积。可使用手绘选区或其他选区工具选择凝胶区域，或使用"图像 | 调整 | 颜色阈值"工具选择凝胶，然后通过"分析 | 测量"命令确定凝胶面积。

4. 利用基于锁核酸的miRNA抑制剂抑制miRNA活性

1. 在标准培养条件下维持 MS-1 细胞。
2. 根据制造商说明书，使用脂质转染试剂转染锁定核酸（LNA）miRNA 抑制剂、合成 miRNA 双链体或 siRNA（20 或 50 nM）。LNA miRNA 抑制剂、合成 miRNA 双链体和 siRNA 的详细信息及来源见我们之前的研究报告^26,27。在 MS-1 细胞中，基于制造商说明书的标准转染程序可有效导入 LNA miRNA 抑制剂、合成 miRNA 双链体或 siRNA。
3. 转染后 16–48 小时，用 TGF-β2（终浓度为 1 ng/mL）刺激内皮细胞。
4. 进行多种下游分析，包括 RNA 表达分析（定量 RT-PCR 和 RNA 测序（RNA-seq）分析）、免疫细胞化学分析和报告基因检测。下游分析方法已在我们之前的研究报告中描述^20,26,27。

结果

TGF-β 是多种内皮细胞中内皮-间充质转化（EndMT）的强效诱导因子。在 MS-1 细胞中经 TGF-β 处理 24 小时后，F-actin 染色显示肌动蛋白应力纤维发生重组（图 1A）²⁰。预先使用 ROCK 抑制剂 Y-27632 处理可抑制肌动蛋白重组的诱导²⁰。MS-1 内皮细胞在 TGF-β 处理后由典型的鹅卵石样形态转变为间充质样纺锤形形态（图 1B）。经 TGF-β 处理的细胞失去细胞间接触。在 TGF-β 处理 48–72 小时后，免疫细胞化学分析显示 VE-钙黏蛋白表达减少，而 α-SMA 表达增加（图 1C）。TGF-β 在处理 48–72 小时后显著诱导 MS-1 细胞中 α-SMA 在 mRNA 和蛋白水平的表达（图 1D 和

讨论

已有报道称，活化的Ras联合TGF-β处理24小时可诱导MS-1细胞发生内皮-间充质转化（EndMT），而单独使用TGF-β在这一较短时间内则无法诱导EndMT²¹。与此一致，我们观察到在MS-1细胞中，经较长时间（48–72小时）TGF-β处理后可显著诱导EndMT²⁰。在多种内皮细胞中，包括人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、人皮肤微血管内皮细胞（HCMEC）、人冠状动脉内皮细胞（HCEC）、小鼠肺内皮细胞（MLEC）、大鼠脑内皮细胞（BEC）、牛主动脉内皮细胞（BAEC）、永生化牛视网膜微血管内皮细胞（iBREC）以及绵羊主动脉瓣内皮细胞，长期（2–6天）TGF-β处理后也反复观察到EndMT的发生^{8,18,29,30,31}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MS-1 细胞	美国模式培养物集存库	CRL-2279
MEM-alpha	赛默飞世尔科技	32571036
TGF-beta2	R&D	302-B2-002
4 孔 Lab-Tek II 培养皿载玻片	赛默飞世尔科技	154526
Y-27632	西格玛奥德里奇	Y0503
封闭剂 One	那卡莱泰斯克	03953-95
鬼笔环肽-四甲基罗丹明异硫氰酸盐	西格玛奥德里奇	P1951
TOTO-3 碘化物	赛默飞世尔科技	T3604
VE 钙黏蛋白单克隆抗体 (BV13)	赛默飞世尔科技	14-1441-82
α-平滑肌肌动蛋白 Cy3 单克隆抗体 (1A4)	西格玛奥德里奇	C6198
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG (H+L)	赛默飞世尔科技	A-11001
盖玻片	赛默飞世尔科技	174934
胶原蛋白溶液	新田明胶株式会社	Cellmatrix I-P
胶原蛋白稀释缓冲液	新田明胶株式会社	Cellmatrix I-P
LNA miRNA 抑制剂	EXIQON	miRCURY LNA microRNA Power Inhibitor（阴性对照 B 和靶向 miRNA）
合成 miRNA 双链体	Qiagen	miScript miRNA Mimic
Lipofectamine RNAiMAX	赛默飞世尔科技	13778030
Lipofectamine 2000	赛默飞世尔科技	11668027