本文介绍了一种全细胞电化学实验方案，用于研究质子传递对Shewanella oneidensis MR-1菌株中外膜细胞色素复合物介导的胞外电子传递速率的贡献。
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本文内容
摘要
摘要
直接电化学检测 c-嵌入细菌外膜的细胞色素复合物（外膜 c-型细胞色素复合物；OM c细胞色素（Cyts）最近作为一种新型的全细胞分析方法出现，用于表征细菌呼吸链向细胞外传递电子的过程，即胞外电子传递（extracellular electron transport, EET）。尽管EET反应中电子传递的通路和动力学已有研究，但用于考察与EET相关阳离子转运影响的全细胞电化学方法尚未建立。本研究提供了一种生化技术示例，通过外膜（OM）考察氘代动力学同位素效应（deuterium kinetic isotope effect, KIE）对EET的影响。 c-使用模式微生物的细胞研究， Shewanella oneidensis MR-1的描述。如果通过OM的EET过程的KIE可以获取 c-Cyts 是微生物电流产生过程中的限速步骤。因此，在添加 D 之前2O，将上清液更换为含有足量电子供体的新鲜培养基，以支持上游代谢反应的速率，并去除工作电极上均匀单层生物膜中的浮游细胞。其他方法可用于验证微生物电流产生中的限速步骤是通过外膜的电子传递（EET） c-细胞色素也进行了描述。我们用于研究质子转运动力学的全细胞电化学检测技术可应用于其他电活性微生物菌株。
引言
近年来，随着金属还原型微生物菌株（如 S. oneidensis MR-1 或 Geobacter sulfurreducens PCA，其外膜上暴露有细胞外的c型细胞色素复合物（OM c-Cyts）1,2,3,4,5. OM c细胞色素介导电子从呼吸链向胞外固体底物的传递，该过程称为胞外电子传递（EET）。1,6 并且是微生物燃料电池等新兴生物技术的关键过程6因此，为了理解EET的动力学和机制及其与微生物生理的关联，OM c-已采用全细胞电化学方法对细胞进行研究4,7，结合显微镜技术8,9，光谱学10
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方案
1. 在 ITO 电极上形成 S. oneidensis MR-1 的单层生物膜（图 1）
注意：为防止其他微生物污染电化学反应器，所有培养基、器具及电化学反应器的组件均应预先灭菌。使用 S. oneidensis MR-1 细胞并构建电化学反应器时，所有操作均应在超净工作台内进行。
- 培养 S. oneidensis MR-1 细胞
注：在 ITO 电极上形成的 S. oneidensis MR-1 单层生物膜，其培养条件依据先前报道的方法4。- 为培养 S. oneidensis MR-1 细胞，将一块含有 Luria-Bertani（LB，20 g/L）和细菌琼脂（bacto agar，15 g/L）的琼脂平板上生长的 S. oneidensis MR-1 单菌落接种至 15 mL LB 培养基（20 g/L）中，在 30 °C、有氧条件下以 160 rpm 振荡培养 24 小时。
- 将细胞悬液在 6,000 × g 条件下离心 10 分钟，弃上清，将所得细胞沉淀重悬于 15 mL 定义培养基（DM，pH 7.8）中（DM 成分为：NaHCO3
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结果
在 +0.4 V（相对于标准氢电极）施加电位 25 小时后，ITO 玻璃工作电极表面形成单层生物膜，该结果此前已通过扫描电子显微镜或共聚焦显微镜证实4电流产生的代表性时间过程 S. oneidensis MR-1 在单层生物膜形成过程中的表现如图所示 图2尽管每次测量时电流都会变化，但所产生的电流与该值相比偏差不超过50% 图2 如果单层生物膜均匀形成。
为了最大限度提高代谢速率并清洗单层生物膜，在用含10 mM乳酸的新鲜DM替换上清液后（图3），在施加+0.4 V（相对于SHE）时可观察到稳定的阳极电流（约10分钟内增加5%）（图4a）。如果阳极电流.......
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讨论
与蛋白质电化学相比，我们的全细胞电化学检测方法具有多项技术优势。蛋白质纯化需要多步且耗时的流程，而我们的全细胞方法仅需在细胞培养后进行一天的自组织生物膜形成。为了实现外膜 c-细胞色素（OM c-Cyts）与电极之间的稳定相互作用，我们仅需对电极表面进行灭菌和清洁，无需对电极进行修饰以调控蛋白质的取向4，例如，S. oneidensis MR-1 可天然附着于电极表面，同时将外膜 c-细胞色素以相同方向排列25,26,27。相比之下，蛋白质的电化学反应对蛋白质中氧化还原活性位点与电极之间的距离高度敏感，因此必须谨慎控制纯化后蛋白质的取向28,29。更重要的是，全细胞电化学检测可直接表征嵌入脂质膜中的外膜 c
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了日本学术振兴会（JSPS）科学研究费特别推进研究（KAKENHI 项目编号 24000010、17H04969 和 JP17J02602）以及美国海军研究全球办公室（N62909-17-1-2038）的资助。Y.T. 是 JSPS 研究员，并获得 JSPS 研究生院领先项目（MERIT）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 玻璃圆筒 | N/A | N/A | 定制，用作电化学反应器 |
| 聚四氟乙烯（PTFE）盖板和底座 | N/A | N/A | 定制，用作电化学反应器的盖子和基座 |
| 丁基橡胶 | N/A | N/A | 定制，插入电化学反应器各组件之间 |
| 隔垫（Septa） | GL Science | 3007-16101 | 用作电化学反应器的进样口 |
| 掺铟氧化锡（ITO）电极 | GEOMATEC | No.0001 | 用作工作电极，5Ω/sq |
| 氯化银/银（Ag/AgCl）饱和KCl电极 | HOKUTO DENKO | HX-R5 | 用作参比电极，Φ0.30mm |
| 铂丝 | The Nilaco Cooporation | PT-351325 | 用作对电极 |
| LB培养基（Luria-Bertani Broth, Miller） | Becton, Dichkinson and Company | 244620 | 用于 S. oneidensis MR-1 的预培养 |
| 细菌琼脂（Bacto agar） | Becton, Dichkinson and Company | 214010 | |
| 蒽醌-1-磺酸盐（α-AQS） | TCI | A1428 | |
| 黄素单核苷酸（FMN） | Wako | 184-00831 | |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | 用于定义培养基（DM） |
| CaCl2 · 2H2O | Wako | 031-00435 | 用于DM |
| NH4Cl | Wako | 011-03015 | 用于DM |
| MgCl2 · 6H2O | Wako | 135-00165 | 用于DM |
| NaCl | Wako | 191-01665 | 用于DM |
| 2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸（HEPES） | DOJINDO | 346-08235 | 用于DM |
| 乳酸钠溶液 | Wako | 195-02305 | |
| 酵母提取物（Bacto Yeast Extract） | Becton, Dichkinson and Company | 212750 | |
| 重水（D，99.9%） | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-PK | 用于动力学同位素效应实验的添加剂 |
| 培养箱 | TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD. | LTI-601SD | 用于预培养 |
| 摇床 | TAITEC | NR-3 | 用于预培养 |
| 高压灭菌器 | TOMY SEIKO CO. LTD. | LSX-500 | 用于电化学反应器和培养基的灭菌 |
| 超净工作台 | SANYO | MCV-91BNF | 用于防止其他微生物污染电化学反应器和培养基 |
| 离心机 | Eppendorf | 5430R | 要求转速可达6000×g |
| 氮气发生器 | Puequ CO. LTD. | PNTN-2 | 也可使用氮气钢瓶替代气体发生器 |
| 紫外-可见分光光度计 | SHIMADZU | UV-1800 | 用于优化细胞密度 |
| 电化学工作站 | BioLogic | VMP3 | 用于生物膜形成和动力学同位素效应实验 |
| 恒温水浴循环器 | AS ONE | TR-1A | 用于维持电化学反应器的温度 |
| 法拉第屏蔽笼 | HOKUTO DENKO | HS-201S | 用于电化学实验 |
参考文献
- Nealson, K. H., Saffarini, D. Iron and Manganese in Anaerobic Respiration - Environmental Significance, Physiology, and Regulation. Annu. Rev. Microbiol. 48, 311-343 (1994).
- Bretschger, O., et al.
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